在南极洲假丝酵母或伯克霍尔德氏菌的作用下对映选择性地打开3位取代的氧杂环丁－2－酮的方法

本发明涉及一种由外消旋氧杂环丁-2-酮制备基本对映纯(enantiopure)的3-羟基羧酸或酯的方法。

旋光3-羟基羧酸及其酯是用于制备药用活性成分的中间体。

现有技术

使用Ru-二膦配合物催化氢化酮和酮酸酯是公知的(例如，Burk等人，J.Am.Chem.Soc 1995，117，4423；A.Mortreux等人，Tetrahedron：Asymmetry，7(2)，379-82，1996；Noyori等人，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，36(3)，285-288，1997；WO 9713763 A1)。

同样公知的是用甲酸/三乙胺配合物作为还原剂和钌催化剂对酮进行催化转移氢化(P.Knochel等人，Tetrahedron Lett.，37(45)，8165-8168，1996；Sammakia等人，J.Org.Chem.，62(18)，6104-6105，1997(异丙醇作为还原剂))。

这些方法的共同点是使用制备非常复杂的催化剂和配体。而且，在转移氢化中，不是使用低成本的氢气，而是使用异丙醇或甲酸/叔胺。后者干扰反应发展并且不可避免地导致形成丙酮或二氧化碳。

此外，在上述研究中通常使用非常大量的催化剂，这使得先前的方法不经济。

Sakai等人(J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，2000，71-77)描述了不同取代的氧杂环丁-2-酮的脂肪酶催化的立体选择性酯交换反应。但是，所述条件下的反应在化学收率和光学收率方面仍然不能完全令人满意。

问题陈述

因此问题是提供能消除现有技术的缺陷且尤其保证化学收率和光学纯度提高的对映选择性地打开氧杂环丁-2-酮的方法。

发明描述

本发明涉及一种制备基本对映纯的通式(III)3-羟基羧酸或酯的方法，其中在源自南极洲假丝酵母(Candida antartica)或伯克霍尔德氏菌(Burkholderia plantarii)的脂肪酶存在下使通式(I)的外消旋氧杂环丁-2-酮与通式(II)的化合物R³-OH反应，并且使形成的式(III)和(IV)产物彼此分离；

其中的基团具有如下意义：

R¹、R²、R³彼此独立地为H；取代或未取代的C₁-C₁₀烷基，取代或未取代的芳基或杂芳基，其中R¹和R²可以不同时具有相同的意义。术语“取代或未取代的C₁-C₁₀烷基”还包括环烷基如环戊基、环己基、环庚基、环戊基甲基、环戊基乙基、环己基甲基、环己基乙基。

这里描述的式(III)和(IV)在各种情况下代表一种对映体。但是，本发明还包括各种情况下的其它对映异构体(对映体)(III)和(IV)。所需对映体的形成可受到脂肪酶选择的影响。

通式(I)的外消旋氧杂环丁-2-酮可从文献获知并且可容易地通过已知方法获得-例如Sakai等人描述的方法(J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，2000，71-77)。

化合物(II)是本领域熟练技术人员公知的醇和水。根据所需的3-羟基羧酸(III)是游离酸或直接作为酯(II)的形式，分别选择水或醇。

适合本发明方法的脂肪酶是来自生物体南极洲假丝酵母(Candidaantarctica)和伯克霍尔德氏菌(Burkholderia plantarii)的脂肪酶。伯克霍尔德氏菌(Burkholderia plantarii)类微生物目前又称为植物伯克霍尔德氏菌(Pseudomonas plantarii)。

这样的微生物是公知的并且可从菌株公共保藏单位获得，例如DSMNo.9509、DSM No.7128、DSM No.9510、ATCC No.51545、NCPPB No.3676、ATCC No.43733、ICMP No.9424、JCM No.5492、LMG No.9035。

特别合适的脂肪酶可从微生物DSM No.8246(于1993年4月28日保藏)获得。关于由该微生物制备脂肪酶，参看EP 1069183，特别是实施例1，该专利的内容通过参考在此引用。

南极洲假丝酵母类微生物可由公众可获得的菌株保藏例如DSM No.70725获得。南极洲假丝酵母类微生物还归类在Pseudozyma aphidis名下(例如DSM No.70725、ATCC No.32657、CBS No.6821、NRRL No.Y-7954)。

特别合适的源自南极洲假丝酵母的脂肪酶是可从Novozymes商业获得的脂肪酶Novozym^435。

源自伯克霍尔德氏菌(Burkholderia plantarii)的脂肪酶在本发明反应中提出了与源自南极洲假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶相反的立体化学，因此是对合成库(the synthetic repertoire)的理想增加。由实施例1和2显然可以了解确切的立体化学。

所述脂肪酶可作为粗提取物和经各种纯度的制备直至达到高纯度的两种形式用于本发明方法。在优选实施方式中，所述脂肪酶具有活性0.1-1000单位/mg，优选10-400单位/mg，特别优选20-200单位/mg(以三丁酸甘油酯为单位测量)。

脂肪酶的活性可通过公知方法测定(Gupta等人，Review：Lipaseassays for conventional and molecular screening：an overview.，Biotechnol.Appl.Biochem.(2003)37，63-71)，例如滴定测量三丁酸甘油酯试验。

特别优选的实施方式是使用载体结合(固定化)的脂肪酶。这样的脂肪酶及其固定化方法已经在例如EP 1069183及其引用文献中披露。

式(I)-(IV)中的基团R¹、R²和R³表示氢、取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、取代或未取代的芳基或杂芳基。未取代的烷基在这里特别指甲基，乙基，正丙基和异丙基，正丁基、异丁基、叔丁基，直链和支化的戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基，还有支化烷基(branched alkyls)如环丁烷、环戊烷、环己烷。取代的烷基在这里指，与相应的未取代烷基相比，其中一个或多个H原子被其它原子或分子基团如NH₂、N(烷基)H、N(烷基)₂、OH、O-烷基、SH、S-烷基、CN、NO₂、I、Cl、Br、F、羰基、羧基、酯、芳基或杂芳基取代的基团。取代的烷基还包括符合单不饱和或多不饱和烷基定义的那些，例如烯烃和炔。

未取代的芳基特别为苯基和萘基，未取代的杂芳基为其中至少一个碳原子被所谓的杂原子如O、N、S取代的芳族化合物。优选的杂芳基是吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基。

但是，基团R¹和R²可以不同时具有相同的意义，因为否则不能得到旋光C原子，而且外消旋物(I)的分馏是不适用的。

本发明方法可以在有溶剂和无溶剂的情况下进行。但是，优选使用的溶剂特别为选自烷基醚的溶剂，或前体(II)还另外作为溶剂使用。甲基叔丁基醚和二异丙基醚特别优选用作溶剂。

与使用醇(II)进行氧杂环丁-2-酮(I)开环反应相竞争的反应是用(III)使(I)开环或者用另一个(III)的分子进行(III)的酯交换，结果导致(III)的“二聚体形成”。为了尽可能地抑制这些不期望的竞争反应，明智的做法是反应中使用溶剂，如果合适的话使用醇(III)作为溶剂。溶剂的使用量特别优选为基于(I)计的最高25重量％。

由于没有脂肪酶以100％的立体选择性操作，所以总是以适当长的反应时间形成一定比例的不期望的对映体如3-羟基羧酸或酯(III)。因此，反应时间的选择是反应收率和产物光学纯度之间的折衷。长反应时间通常导致以光学纯度为代价的高收率，而较短的反应时间为产物带来了高光学纯度，但是损害了整体收率。因此明智的是根据反应物的属性和所选择的条件，记录在试验室初步实验中的反应动力学，并且从中推导最佳反应时间。

酶催化反应的反应时间很大程度上还取决于所选择的温度。所述反应可以在较宽的温度范围内进行，优选在所用脂肪酶具有充分活性的温度下进行。优选的温度为5-70℃，尤其为10-50℃。

所述反应可以连续或间歇地进行。对于工业规模，建议进行连续合成，尤其使用载体酶。

在前体(I)和(II)已经反应后，产物(III)和(IV)共同存在。由于化学结构不同，可以通过传统方法分离产物(III)和(IV)。蒸馏或萃取方法优选用于所述分离。如果(III)是酸的形式(R³＝H)，那么(III)可以且优选以其碱金属盐或铵盐的形式与(IV)分离。

不期望的对映体(IV)还可以在外消旋作用后返回到反应混合物中。但是，还可以由(IV)通过水解获得相应的3-羟基羧酸或酯(III)且保持了光学活性中心。

本发明还用于制备基本对映纯的通式(IV)氧杂环丁-2-酮。

因此，本发明进一步涉及一种制备基本对映纯的通式(IV)氧杂环丁-2-酮的方法，其中在来自南极洲假丝酵母或伯克霍尔德氏菌的脂肪酶存在下使通式(I)的外消旋氧杂环丁-2-酮与通式(II)的化合物R³-OH反应，并且使形成的式(III)和(IV)产物彼此分离；

其中的基团具有如下意义：

R¹、R²、R³彼此独立地为H；取代或未取代的C₁-C₁₀烷基，取代或未取代的芳基或杂芳基，其中R¹和R²可以不同时具有相同的意义。术语“取代或未取代的C₁-C₁₀烷基”还包括环烷基如环戊基、环己基、环庚基、环戊基甲基、环戊基乙基、环己基甲基、环己基乙基。

实验部分

实施例1(使用南极洲假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶的反应)

设备：4000ml BASF-Miniplant搅拌釜，具有4个隔板的3-桨金属推进器搅拌器，164rpm，内部自动调温装置

混合物：

3-丁基-氧杂环丁-2-酮(6)         121g(0.95mol)

甲基叔丁基醚                    1200ml(反应)

                                4300ml(萃取)

Novozym 435                     1.94g(1.6％)

去离子水                        10.05ml(0.56mol)

NaHCO₃溶液(10％)               795ml(0.95mol)

硫酸(50％)                      111.3g(0.57mol)

步骤：

将121g(0.95mol)外消旋-内酯6加入1200ml甲基叔丁基醚中，并加入1.94g(1.6％)Novozym435，接着加入10.05ml(0.56mol)去离子水。在25.0℃下搅拌17小时。过滤酶。用795ml、pH 8.65的NaHCO₃溶液(10％)洗涤有机溶液。相分离，用2×800ml甲基叔丁基醚反萃取，相分离。合并全部3种有机相(内酯)。用H₂SO₄(pH＜3.0)酸化水相并且用(3×)900ml甲基叔丁基醚萃取3次。合并全部3种有机相(酸)。在硫酸钠上干燥。过滤。在旋转蒸发器内除去溶剂。

收率：

酸＝58.2g(0.40mol)，42％         手性HPLC(GKA)：＞99％ee

内酯＝70.0g(0.55mol)，58％        手性GC(GVF-C)：80.03％

手性转化率＝44.7％

实施例2(使用伯克霍尔德氏菌(Burkholderia plantarii)脂肪酶(DSM8246)的反应)

在与实施例1相同的条件下，但是用源自伯克霍尔德氏菌(Burkholderia plantarii)的脂肪酶替代Novozym435(40mg，75U/mg(三丁酸甘油酯单位)，获得具有相反立体化学的产物。由rac-1(2g，15.60mmol)获得(S)-2(0.85g；5.6mmol；37％；94ee)和(R)-1(1.08g；8.2mmol；54％；95ee)。

实施例3

使用南极洲假丝酵母和伯克霍尔德氏菌脂肪酶进行各种取代的氧杂环丁-2-酮的反应。

在下表中提及的通式(I)底物按照与实施例1和2相似的方式反应，获得具有所示立体化学的相应通式(III)的酸(“R或S酸”)或通式(IV)的氧杂环丁-2-酮(“R和S内酯”)。