准确鉴定鲶和大口鲶的试剂盒及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种准确和批量鉴定鲶(Silurus asotus)和大口鲶的试剂盒，以及使用该试剂盒鉴定鲶和大口鲶(Silurus meridionalis)的方法。

背景技术

鲶和大口鲶在分类上都属于鲶属(Silurus)鱼类，鲶是世界上的广布种类，而大口鲶主要分布在我国长江、闽江、湘江等水系，一般有大口鲶分布的水系都有鲶分布。成体时鲶(S.asotus)的个体比大口鲶(S.meridionalis)小很多，可通过个体大小和外部特征区分它们。然而，在种苗阶段，一般在250g以下，两种鲶鱼形态极相似，仅凭外形特征很难将它们正确区分开，即便是很有经验的鱼类分类学工作者也难以正确鉴定它们。所以，急需建立准确的鉴定技术，让非专业人员也能准确鉴定两种鲶。近年来，分子鉴定(尤其是PCR)技术已开始在鱼类分类中应用，为了准确鉴定两种鲶，有必要建立PCR鉴定技术和研制PCR鉴定试剂盒。通过RAPD技术在鲶和大口鲶筛选到一差异条带，对该条带克隆测序后，将该序列在GenBank中比对发现没有找到与其高度同源的序列，说明是未知序列，以该序列为摸板设计特异引物(NS和NA)来区分鲶和大口鲶。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种准确鉴定鲶和大口鲶的试剂盒，特别是提供一对特异引物NS和NA，使用该试剂盒可准确区分鲶和大口鲶。本发明建立了准确鉴定两种鲶的PCR检测技术并研制了检测试剂盒，以满足科学研究和生产中种苗准确鉴定的需要。

本发明的另一目的在于提供上述检测试剂盒鉴定两种鲶的方法。

本发明的目的是由下述技术方案实现的：

一种准确鉴定鲶(Silurus asotus)和大口鲶(Silurus meridionalis)的试剂盒，包括DNA提取试剂、聚合酶链式反应(PCR)试剂、电泳和显色试剂：

(a)DNA提取试剂，包括

试剂1：DNA提取缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，2mmol/L EDTA(pH8.0)，0.4mol/L NaCl，1％SDS。

试剂2：蛋白酶K 20mg/mL。

试剂3：氯化钠6mol/L。

试剂4：异丙醇(分析纯)。

试剂5：70％乙醇。

(b)聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂6和试剂7。

试剂6：含有10倍聚合酶链式反应缓冲液(含MgCl₂ 15mM)、特异引物对NS和NA、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)和灭菌双蒸水，含量分别为2.5μl、0.5-0.75μl(10μM)、0.5-0.75μl(10μM)、0.5μl(10μM each)和19.375-20.375μl。

试剂7：Taq酶(5个单位/μl)。

(c)电泳和显色试剂，包括试剂8、试剂9、试剂10和试剂11。

试剂8：为50倍TAE(电泳缓冲液)，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；(实际使用时用蒸馏水稀释50倍)。

试剂9：为凝胶加样缓冲液，含w/v为40％的蔗糖和0.25％的溴酚蓝和二甲苯青FF；

试剂10：电泳级琼脂糖。

试剂11：溴化乙锭0.5μg/μl。

为了更好地实现本发明，所述特异引物NS和NA序列如下：

特异引物NS指5′AACTGTAGTCCACGAACAACATCTT 3′，

特异引物NA指5′CTAAACTTTCTTACGGCTTCTCCC 3′。

所述聚合酶链式反应试剂的优选组成为：试剂6：2.5μl 10×PCR Buffer，0.5μl NS，0.5μl NA，0.5μl dNTP(10mM each)，20.375μl ddH₂O；试剂7：0.125μl Taq酶。

采用上述的试剂盒鉴定鲶和大口鲶的方法，包括以下步骤：

(1)取鱼鳍50-100mg，剪碎，加400μl试剂1；

(2)加入10μl试剂2，55-65℃水浴2h，至颗粒完全溶解；

(3)加300μl试剂3，振荡混匀30秒，然后10,000×g离心30min，取上清至新离心管；

(4)加入等体积试剂4，-20℃放置1h，然后10,000×g离心15min，弃去上清；

(5)用1ml试剂5洗涤沉淀，10,000×g离心5min，空气中控干，灭菌双蒸水溶解，即为DNA提取液；

(6)PCR扩增：取0.5-1μl DNA作为PCR扩增的模板；取23.875-24.375μl试剂6与0.125μl试剂7混合；在热循环仪上通过94℃解链3-5分钟；然后用94℃变性20-30秒，60-62℃复性30-40秒钟，72℃延伸45-90秒钟，如此循环30-35次，最后在72℃保温8-12分钟，将扩增目的特异片段增加到10⁸mol以上。

(7)电泳和显色检测：取5-10μl扩增后的样品，与1-2μl试剂9(凝胶加样缓冲液)混合，在1.0％(W/V)的琼脂糖凝胶(0.1g试剂10中加入10ml已稀释50倍的试剂8)中电泳(试剂8用蒸馏水稀释50倍作为工作电泳缓冲液)，在紫外光下显色检测。如果出现一条约640核苷酸对(bp)的条带，说明该鱼为鲶；如果出现一条约420核苷酸对(bp)的条带，说明该鱼为大口鲶。

附图说明

图1为鉴定鲶和大口鲶试剂盒对两种鱼的鉴定实验结果图。

其中M：DNA marker，1：为鲶特征性条带(约640bp)，2：为大口鲶特征性条带(约420bp)。