一种具有趋化作用的人类RANTES蛋白的异源表达和纯化方法

具体实施方式

材料：

1DNA Ligation Kit(Takara公司产品，中国大连)

2.pMD18-T载体克隆试剂盒(Takara公司产品，中国大连)

3.EcoRI、NitI、SalI等限制性内切酶(Takara公司产品，中国大连)

4.质粒载体pPIC9K(Invitrogen公司产品，美国)

5.质粒小量制备试剂盒(百泰克生物技术有限公司产品，中国北京)

6.DNA凝胶回收试剂盒(上海博亚公司产品，中国上海)

7.HiTrap prepacked columns(Pharmacia公司产品，美国)

8.大肠杆菌JM109(Takara公司产品，中国大连)

9.酵母菌GS115(Invitrogen公司产品，美国)

10.BCA蛋白定量试剂盒(北京天泰生物公司产品，中国北京)

11.G418、氨苄青霉素(Roche公司产品，德国)

12.酵母提取物、胰蛋白胨、右旋糖、无氨基酸酵母氮源(Oxford公司产品，美国)

13.LB培养基

酵母提取物      5g

胰蛋白胨        10g

NaCl            10g

溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌。

14.YPD培养基

酵母提取物       2g

胰蛋白胨         4g

溶于180ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml经滤器除菌后的20％的右旋糖和0.2ml浓度为100mg/ml的氨苄青霉素。

15.磷酸盐缓冲液

NaCl            8g

KCl             0.2g

Na₂HPO₄         1.44g

KH₂PO₄          0.24g

溶于水1000ml，并用HCl调节pH值至7.4，高压灭菌。

16.BMGY培养基

酵母提取物      2g

胰蛋白胨        4g

溶于140ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml滤器除菌后浓度为13.4％的无氨基酸酵母氮源贮存液、20ml 1mol/L磷酸盐缓冲液、20ml 10％甘油、0.4ml0.02％生物素和0.2ml 100mg/ml的氨苄青霉素。

17.BMMY培养基

酵母提取物        2g

胰蛋白胨        4g

溶于140ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml滤器除菌后浓度为13.4％的无氨基酸酵母氮源贮存液、20ml 1mol/L磷酸盐缓冲液、20ml 5％甲醇、0.4ml0.02％生物素和0.2ml 100mg/ml的氨苄青霉素。

18.MDS培养基：160ml 1mol/L山梨糖醇加入3.0g琼脂，高压灭菌，冷却至60℃后，依次加入20ml 13.4％的无氨基酸酵母氮源，20ml 20％葡萄糖，0.4ml0.02％生物素。

19.MD培养基：

1.34％       无氨基酸酵母氮源

4×10^-5％    生物素

2％          葡萄糖

20.MM培养基：

13.4％       无氨基酸酵母氮源

4×10^-5％    生物素

0.5％        甲醇

实施例1：人类RANTES基因的克隆

根据已报道人类RANTES基因序列(NCBI登录号：NM 002985)设计二条引物F1(SEQ ID NO：3)和R1(SEQ ID NO：4)，从人体血液提取RNA，采用RT-PCR扩增人类RANTES基因片段。引物序列如下：

上游引物F1：5’----ATGAAGGTCTCCGCGGCAGCCC----3’

下游引物R1：5’----CTAGCTCATCTCCAAAGAGTTGATG----3’

反转录体系为20ul，其中含10×RT反应缓冲液2ul，25mM MgCl₂ 4ul，10mMdNTP 2ul，200U/ul RNase Inhibitor 0.5ul，AMV Reverse Transcriptase 1ul，下游引物R1(20μM)1ul，总RNA(2μg/μl)2ul。反应条件为：42℃温育60min，80℃加热5min，冰上冷却5min。然后以上述反转录产物cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR的反应体系为50μl，其中含引物F1和R1各20pmol，200μmol的dNTP，2μl cDNA，10×Taq反应缓冲液5μl，Taq聚合酶1U。PCR的反应条件为：第一阶段95℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环35次；第三阶段72℃延伸10分钟。所得PCR产物(SEQ ID NO：5)经1.5％琼脂糖电泳检测可见约300bp大小电泳带(图1)，将PCR产物回收、纯化后与pMD18-T载体进行连接。连接产物通过电转化法转化JM109大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB平板上的克隆于LB液体培养基中37℃振荡过夜，次日提取质粒DNA，用PCR鉴定，对于有约300bp大小DNA片段出现的重组质粒进行测序，测序结果表明阳性重组质粒多克隆位点中插入的DNA片段即是完整的RANTES基因，该重组质粒命名为pMD18-T/rantes。

实施例2：人类RANTES融合蛋白表达载体的构建

为了便于人RANTES蛋白的分离纯化，在目的蛋白N端融合一个6×His纯化标签，并在His-tag和RANTES蛋白之间加入肠激酶(EK)酶切位点构建人RANTES融合蛋白。为此，设计一对引物F2和R2，引物序列如下：

F2：5’----GCGAATTC CATCATCATCATCATCAT GATGACGATGACAAG ATGAAGGTC----3’

R2：5’----GC GCGGCCGC CTA GCT CAT CTC CAA AGA GT----3’

在上游引物F2的5’端顺次加入EcoR I酶切位点、，6个组氨酸的DNA序列和1个肠激酶识别位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)(SEQ ID NO：6)，在下游引物R2的5’端加入NotI酶切位点(SEQ ID NO：7)，然后以重组质粒pMD18-T/rantes为模板，PCR扩增出人类RANTES融合蛋白基因片段(SEQ ID NO：2)，该融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。以EcoR I和Not I分别酶切上述PCR产物和毕赤酵母载体pPIC9K质粒DNA，然后利用DNA连接试剂盒将人类RANTES融合蛋白基因片段连接到pPIC9K载体上，构建成重组表达质粒pPIC9K/rantes，构建过程参见图2。

实施例3：人类RANTES融合蛋白工程酵母的构建

pPIC9K是一种整合性载体，可以通过同源重组把外源基因整合到毕赤酵母细胞染色体中，并且能够发生多位点整合获得多拷贝，一般来说，外源蛋白的表达量和拷贝数正相关。由于pPIC9K含有可抗G418的Kanamycin(Kan)基因，转化时Kan基因与外源基因将一起整合到染色体上，使转化子具有G418抗性，其抗性水平与Kan基因的数目呈正相关。因此我们通过转化子的G418抗性筛选来获得高表达量的重组转化子。筛选出的转化子还需鉴定表型，即确定是Mut+还是Muts。可以把转化子同时点在MD和MM两块平板上。在MD和MM平板上生长差别不大的转化子为Mut+；相反，在MD上生长快，MM上生长很慢的转化子为Muts，对于分泌表达的外源蛋白，可以优先选用Mut+转化子以缩短后续的发酵时间。

本实施例中采用限制性内切酶SalI线性化人类RANTES融合蛋白表达载体pPIC9K/rantes，利用电穿孔法转化毕赤酵母GS115。由于毕赤酵母GS115菌株具有HIS4营养缺陷标记，可用于阳性转化子的筛选，首先用不含His的MDS平板初筛，选取该培养基上生长良好的菌落150个，接种到添加2mg/LG418的YPD平板上进行复筛，并同时接种到对应的MD和MM平板上完成表型Mut+鉴定。菌落PCR鉴定RANTES融合基因DNA片段的存在，结果选出在MD和MM平板上都能正常生长，并能在G418抗性平板上生长的抗G418、Mut+转化子，并加甘油于-80℃冻存。

实施例4：人RANTES融合蛋白的诱导表达与纯化

取-80℃保存的含有pPIC9K/rantest的酵母工程菌种接种于YPD平板活化，挑取外观优良的单个菌落接种于5ml BMGY培养基，30℃恒温摇床300rpm振荡培养16～18小时，室温下1500g离心5min，去上清，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600＝1.0左右，将重悬菌液置于250ml三角瓶中，用双层灭菌纱布封口，300rpm，30℃震荡培养，每24h向培养基中添加无菌甲醇至终浓度为1.0％，96h后停止培养，离心菌液收集上清液。对摇瓶培养的菌液离心得到的上清液进行超滤离心，去除培养基成分，同时更换为亲和层析进样缓冲液。用AKTA层析仪和HiTrap Chelating HP Columns(Pharmacia)对蛋白质进行亲和层析纯化，经二次重复上样，通过柱洗脱将带His-tag的蛋白经亲和层析纯化出来。对纯化产物进行SDS-PAGE电泳(如图3)，样品1为未诱导的表达对照，样品2为亲和层析纯化前的超滤产物，样品3为亲和层析纯化后的产物。纯化结果表明，经纯化后3号产物的杂蛋白较少，有一条单一明亮的目的蛋白条带，纯化效果好。根据常用的BCA法，取纯化后的蛋白溶液，测定溶液中总蛋白的浓度为0.943mg/ml。

实施例5：人RANTES融合蛋白的Western Blot鉴定

融合蛋白的N端有6×His-tag，因此可以用Anti-His Antibody对目的蛋白进行Western Blot鉴定。分离纯化的人RANTES融合蛋白经过SDS-PAGE电泳后，通过电转移将PAGE胶上的蛋白质转移至PVDF膜上。PVDF膜用高浓度蛋白质进行封闭，然后用His抗体进行结合反应，用洗液漂洗PVDF膜，加显色试剂进行显色。蛋白质印迹结果如图4所示，样品2为亲和层析纯化后产物，样品3为亲和层析纯化前的超滤产物，样品1为未诱导表达对照。结果表明，目的蛋白在甲醇诱导前无表达，甲醇诱导能使重组菌株表达外源蛋白，经超滤离心和亲和层析纯化后，在菌液上清中分离出单一的目的蛋白。

实施例6：人RANTES蛋白的分离纯化

利用蛋白酶EK切割人RANTES融合蛋白，然后采用亲和层析去除6×His-tag，操作同实施例4所述，纯化得到人类RANTES蛋白。

结论：

本发明通过RT-PCR扩增、载体构建、蛋白的甲醇诱导表达以及纯化鉴定等分子生物学技术和蛋白纯化技术，采用毕赤酵母表达系统来实现人RANTES蛋白的分泌表达，得到了纯度较高、产量较大的人RANTES蛋白，该蛋白可用于制备治疗多发性硬化关节炎、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾病、肿瘤以及HIV的药物。

序列表

<110>重庆大学

<120>一种具有趋化作用的人类RANTES的异源表达和纯化方法

<130>

<160>2

<170>Patent In version 3.2

<210>1

<211>102

<212>氨基酸

<213>人RANTES融合蛋白的氨基酸序列

<400>1

his his his his his his asp asp asp asp lys met lys val ser

 1               5                  10                   15

ala ala ala leu ala val ile leu ile ala thr ala leu cys ala

                 20                  25                  30

pro ala ser ala ser pro tyr ser ser asp thr thr pro cys cys

                 35                  40                  45

phe ala tyr ile ala arg pro leu pro arg ala his ile lys glu

                 50                  55                  60

tyr phe tyr thr ser gly lys cys ser asn pro ala val val phe

                 65                  70                  75

val thr arg lys asn arg gln val cys ala ash pro glu lys lys

                 80                  85                  90

trp val arg glu tyr ile asn ser leu glu met ser

                 95                 100

<210>2

<211>325

<212>DNA

<213>人RANTES融合蛋白的DNA序列

<400>2

gcgaattcca tcatcatcat catcatgatg acgatgacaa gatgaaggtc tccgcggcag    60

ccctcgctgt catcctcatt gctactgccc tctgcgctcc tgcatctgcc tccccatatt    120

cctcggacac cacaccctgc tgctttgcct acattgcccg cccactgccc cgtgcccaca    180

tcaaggagta tttctacacc agtggcaagt gctccaaccc agcagtcgtc tttgtcaccc    240

gaaagaaccg ccaagtgtgt gccaacccag agaagaaatg ggttcgggag tacatcaact    300

ctttggagat gagctaggcg gccgc                                          325

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人类RANTES基因引物F1的序列

<400>3

atgaaggtct ccgcggcagc cc                      22

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人类RANTES基因引物R1的序列

<400>4

ctagctcatc tccaaagagt tgatg                   25

<210>5

<211>276

<212>DNA

<213>以F1和R1为引物，PCR扩增人类RANTES基因产物的序列

<400>5

atgaaggtct ccgcggcagc cctcgctgtc atcctcattg ctactgccct ctgcgctcct    60

gcatctgcct ccccatattc ctcggacacc acaccctgct gctttgccta cattgcccgc    120

ccactgcccc gtgcccacat caaggagtat ttctacacca gtggcaagtg ctccaaccca    180

gcagtcgtct ttgtcacccg aaagaaccgc caagtgtgtg ccaacccaga gaagaaatgg    240

gttcgggagt acatcaactc tttggagatg agctag                              276

<210>6

<211>50

<212>DNA

<213>在人RANTES蛋白N端融合6×His标签，His-tag和RANTES蛋白之间加入肠激酶酶切位点构建人RANTES融合蛋白的引物F2的序列

<400>6

gcgaattcca tcatcatcat catcatgatg acgatgacaa gatgaaggtc              50

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>在人RANTES蛋白N端融合6×His标签，His-tag和RANTES蛋白之间加入肠激酶酶切位点构建人RANTES融合蛋白的引物R2的序列

<400>7

gcgcggccgc ctagctcatc tccaaagagt                                    30