原产L－苯丙氨酸的产L－色氨酸的基因工程重组大肠杆菌以及用所述微生物来生产L－色氨酸的方法

实施本发明的最佳方式

本发明实际和目前优选的方式在以下实施例中示出。

然而，本领域的技术人员应当明白，参考本说明书可以在本发明实质和范围内作出改变和改良。

实施例1：构建失去色氨酸缺陷型性质的菌株

在该实施例中，将存在于产L-苯丙氨酸的色氨酸缺陷型菌株的染色体上的色氨酸操纵子基因修复成野生型。

为此，使用了用P1噬菌体感染的野生型大肠杆菌的细胞裂解液。准确地说，将一个大肠杆菌接种环接种到LB液体培养基(Lurina-Bertani，下称LB；胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l)中，接着在37℃下培养过夜。回收培养的细胞并重悬于LB-GMC液体培养基(0.2％葡萄糖，1mM硫酸镁(MgSO₄)，0.05mM氯化钙(CaCl₂)，)，然后用2μlP1噬菌体感染。在37℃下培养30分钟后，用0.1M的柠檬酸钠洗涤两遍培养产物以去除剩余的P1噬菌体。将所述细胞重悬于0.1ml的柠檬酸钠中，再将其涂布到补充了20mg/l酪氨酸的M9固体基本培养基。所获得的菌落被证实能够在不含色氨酸的培养基中生长，表明所述菌株失去了色氨酸缺陷型的特性。所构建的菌株命名为“CJ001(Trp⁺)”。

实施例2：构建具有钝化pheA基因的产L-色氨酸的重组菌株

在该实施例中，通过同源重组钝化大肠杆菌的pheA基因。

为了钝化所述pheA基因，采用了一步钝化法，这是由Datsenko KA等人开发的一种使用λRed重组酶的方法(One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products，DatsenkoKA，Wanner BL.，Proc Natl Acad Sci USA.2000 Jun 6；97(12)：6640-5)。为了证实该基因的插入，采用pKD3的耐氯霉素基因作为标记。聚合酶链反应(下称PCR)利用pKD3作为模板和表1所示的引物1和2进行，其包含部分pheA基因和部分pKD3的耐氯霉素基因序列，结果是大约1100bp的基因片段的扩增[Sambrook等，Molecular Cloning，a LaboratoryManual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratories]。该实施例中使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒(BIONEER，Korea)。PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸1分钟(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表1

为获得大肠杆菌pheA基因的5’DNA片段，PCR采用野生型大肠杆菌W3110的染色体作为模板以及表2所示的引物3和4实施，得到大约250bp的扩增的基因片段。这里使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒，PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸20秒(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表2

为获得大肠杆菌pheA基因的3’DNA片段，PCR采用野生型大肠杆菌W3110的染色体作为模板以及表3所示的引物5和6实施，得到大约250bp的基因片段的扩增。这里使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒，PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸20秒(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表3

这里，引物1和引物4的18对核苷酸序列互补，引物2和引物5的20对核苷酸序列互补。因此，利用引物1和2通过PCR获得的片段、利用引物3和4通过PCR获得的片段以及利用引物5和6通过PCR获得的片段可以连接成一个片段。所述PCR产物通过PCR五个循环无引物扩增。向其中加入引物3和引物6，接着PCR 25个循环。结果，扩增出大约1600bp的基因片段。

将通过Datsenko KA等人的方法用pKD46转化的大肠杆菌CJ001制备成感受态菌株，然后导入通过PCR获得的1600bp大小的基因片段，将所述菌株涂布在补充有30mg/L氯霉素的LB固体培养基中。证实利用引物3和6通过PCR获得的1600bp大小的基因片段，所获得的菌株具有钝化的pheA。所得到的重组菌株命名为“CJ100(Trp⁺ΔpheA)”。

实施例3：构建具有钝化trpR基因的产L-色氨酸的重组微生物

在该实施例中，通过同源重组钝化大肠杆菌的trpR基因。

PCR利用pKD3作为模板和表4所示的引物7和8进行，其包含部分trpR基因和部分pKD3的耐氯霉素基因序列，得到大约1100bp的基因片段的扩增。该实施例中使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒。PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸1分钟(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表4

为获得大肠杆菌trpR基因的5’DNA片段，PCR采用野生型大肠杆菌W3110的染色体作为模板以及表5所示的引物9和10实施，得到大约250bp的基因片段的扩增。这里使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒，PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸20秒(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表5

为获得大肠杆菌trpR基因的3’DNA片段，PCR采用野生型大肠杆菌W3110的染色体作为模板以及表6所示的引物11和12实施，得到大约250bp的基因片段的扩增。这里使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒，PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸20秒(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表6

这里，引物7和引物10的20对核苷酸序列互补，引物8和引物11的20对核苷酸序列互补。因此，利用引物7和8通过PCR获得的片段、利用引物9和10通过PCR获得的片段以及利用引物11和12通过PCR获得的片段可以连接成一个片段。所述PCR产物通过PCR五个循环无引物扩增。向其中加入引物9和引物12，接着PCR 25个循环。结果，扩增出大约1600bp的基因片段。

将通过Datsenko KA等人的方法用pKD46转化的大肠杆菌CJ100生成感受态菌株，然后导入所述用PCR获得的1600bp大小的基因片段，将所述菌株涂布在含氯霉素的LB固体培养基中。

证实利用由引物9和12通过PCR获得的1600bp大小的基因片段，所获得的菌株具有钝化的trpR。所得到的重组菌株命名为“CJ200(Trp⁺ΔpheAΔtrpR)”。

实施例4：构建具有钝化mtr基因的产L-色氨酸的重组菌株

在该实施例中，通过同源重组钝化大肠杆菌的mtr基因。

PCR利用pKD3作为模板和表7所示的引物13和14进行，其包含部分mtr基因和部分pKD3的耐氯霉素基因序列，得到大约1100bp的基因片段的扩增。该实施例中使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒。PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸1分钟(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表7

为获得大肠杆菌mtr基因的5’DNA片段，PCR采用野生型大肠杆菌W3110的染色体作为模板以及表8所示的引物15和16实施，得到大约500bp扩增的基因片段。这里使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒，PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸30秒(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表8

为获得大肠杆菌mtr基因的3’DNA片段，PCR采用野生型大肠杆菌W3110的染色体作为模板以及表9所示的引物17和18实施，得到大约500bp的基因片段的扩增。这里使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒，PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸30秒(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表9

这里，引物13和引物16的20对核苷酸序列互补，引物14和引物17的20对核苷酸序列互补。因此，利用引物13和14通过PCR获得的片段、利用引物15和16通过PCR获得的片段以及利用引物17和18通过PCR获得的片段可以连接成一个片段。所述PCR产物通过PCR五个循环无引物扩增。向其中加入引物15和引物18，接着PCR 25个循环。结果，扩增大约2100bp的基因片段。

将通过Datsenko KA等人的方法用pKD46转化的大肠杆菌CJ200制备成感受态菌株，然后导入所述用PCR获得的2100bp大小的基因片段，将所述菌株涂布在含氯霉素的LB固体培养基中。

证实利用由引物15和18通过PCR获得的2100bp大小的基因片段，所获得的菌株具有钝化的mtr。所得到的重组菌株命名为“CJ300(Trp⁺ΔpheAΔtrpRΔmtr)”。

实施例5：构建具有钝化tnaAB基因的产L-色氨酸的重组菌株

在该实施例中，通过同源重组钝化大肠杆菌的tnaAB基因。

PCR利用pKD3作为模板和表10所示的引物19和20进行，其包含部分tnaAB基因和部分pKD3的耐氯霉素基因序列，得到大约1100bp的基因片段的扩增。该实施例中使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒。PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸1分钟(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表10

将通过Datsenko KA等人的方法用pKD46转化的大肠杆菌CJ300制备成感受态菌株，然后导入所述用PCR获得的1100bp大小的基因片段，将所述菌株涂布在含氯霉素的LB固体培养基中。证实利用由引物21和22通过PCR获得的1900bp大小的基因片段，所述菌株具有钝化的tnaAB。所得到的重组菌株命名为“CJ400(Trp⁺ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB)”。

表11

实施例6：构建诱导特异性基因突变的pSKH载体

在该实施例中，构建了能够诱导大肠杆菌染色体上特异性基因突变的载体。

为此，将枯草杆菌(Bacillus subtilis)的sacB基因插入在公开号10-2006-0079297的韩国专利中使用的pKCG119载体中。为了选择没有插入外源基因的突变菌株，使用了sacB基因。

利用野生型枯草杆菌(Marurg 168)的染色体作为模板以及引物23和24，通过PCR扩增sacB基因(1.9kb)(Molecular organization ofintrinsic restriction and modification genes BsuM of Bacillus subtilisMarburg，Ohshima H，Matsuoka S，Asai K，Sadaie Y.J Bacteriol.2002 Jan；184(2)：381-9)。该实施例中使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒。PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸2分钟(30个循环)。

表12

将PCR产物用XbaI和BamHI消化，然后进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。结果，获得了1.9kb大小的DNA片段。将获得的片段连接到用Xba I和BamH(NEB连接试剂盒)消化的pKCG 119载体上。用连接混合物转化大肠杆菌Top 10。将转化的细胞涂布在含卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上，在37℃下培养过夜。

用牙签挑取菌落，将其接种在3mL含卡那霉素的LB液体培养基中并培养过夜。利用质粒小量制备试剂盒回收质粒DNA。通过DNA测序识别插入的sacB的核苷酸序列。将构建的载体命名为“pSKH”。

实施例7：构建具有突变的aroG基因的产L-色氨酸的重组菌株

在该实施例中，大肠杆菌的aroG基因发生了突变。

利用Genomic-tip系统(QIAGEN)从产色氨酸的菌株中提取染色体DNA。利用该染色体DNA作为模板以及表13所示的引物25和26进行PCR，得到扩增出含aroG基因ORF的大约660bp的DNA片段。该实施例中使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒。PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸30秒(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表13

利用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将通过上述PCR获得的aroG基因片段连接到pCR2.1-TOPO载体上。用连接混合物转化大肠杆菌Top 10。将转化的细胞涂布在含氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上并在37℃下培养过夜。所构建的载体命名为“TOPO2.1-aroG”。

用牙签挑取菌落，将其接种在3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中并培养过夜。利用质粒小量制备试剂盒(QIAGEN)回收质粒DNA并测量TOPO2.1-aroG的大小。为了生成aroG基因的突变形式，利用TOPO2.1-aroG载体作为模板和表14所示的引物27和28进行定点突变(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit，STRATAGENE)。反应条件如下：95℃下变性30秒，55℃下退火1分钟，68℃下延伸6分30秒(18个循环)。用12μL各种反应溶液转化大肠杆菌Top 10，将其涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，接着在37℃下培养过夜。所构建的载体命名为“TOPO2.1-maroG”。

表14

用牙签挑取菌落，将其接种在3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中并培养过夜。利用质粒小量制备试剂盒回收质粒DNA。通过DNA测序识别突变aroG基因的核苷酸序列。用BamHI和SalI消化含突变aroG基因的TOPO2.1-maroG，然后进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。结果，获得了660bp大小的DNA片段。将获得的片段连接到用BamHI和SalI消化的pSKH载体上。用连接混合物转化大肠杆菌Top 10。将转化的细胞涂布在含卡那霉素的LB固体培养基上并在37℃下培养过夜。所构建的载体命名为“pSKH-maroG”。

用牙签挑取菌落，将其接种在3mL含卡那霉素的LB液体培养基中并培养过夜。利用质粒小量制备试剂盒(QIAGEN)回收质粒DNA，测量pSKH-maroG的大小。通过NheI消化来去除所述质粒的复制起点然后连接。将DNA片段引入制备成感受态细胞的CJ400中。将所述CJ400涂布到含卡那霉素的LB固态培养基上并在37℃下过夜。利用所生成的菌落和引物25和26进行PCR，结果证实了4.4kb条带。根据该结果，可以证实含所述突变aroG基因的pSKH载体被成功引入到染色体DNA。为了从染色体DNA中去掉除突变aroG基因部分之外的载体，将所述菌株在LB+10％蔗糖的培养基中培养16小时，并涂布到LB平板培养基上。将所生成的菌落在含卡那霉素和不含卡那霉素的固体培养基上培养。选择在不含抗生素的培养基上生长的菌落，然后进行DNA测序。然后，最终选出由亮氨酸取代第150位的aroG基因的氨基酸的突变菌株。该突变菌株命名为“CJ500(Trp⁺ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB aroG^m)”。

实施例8：构建具有突变的trpE基因的产L-色氨酸的重组菌株

在该实施例中，大肠杆菌的trpE基因发生了突变。

利用Genomic-tip系统(QIAGEN)从产色氨酸的菌株中提取染色体DNA。利用该染色体DNA作为模板以及表15所示的引物29和30进行PCR，得到含trpE基因的ORF部分的大约600bp的DNA片段的扩增。该实施例中使用的反应方案为PCR HL premix试剂盒。PCR实施如下：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸30秒(30个循环)。PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。通过洗脱获得靶条带。

表15

利用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将通过上述PCR获得的trpE基因片段连接到pCR2.1-TOPO载体上。用连接混合物转化大肠杆菌Top 10。将转化的细胞涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，在37℃下培养过夜。所构建的载体命名为“TOPO2.1-trpE”。

用牙签挑取菌落，将其接种在3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养过夜。利用质粒小量制备试剂盒(QIAGEN)回收质粒DNA，测量TOPO2.1-trpE的大小。为了生成trpE基因的突变形式，利用TOPO2.1-trpE载体作为模板和表16所示的引物31和32进行定点突变。反应条件如下：95℃下变性30秒，55℃下退火1分钟，以及68℃下延伸6分30秒(18个循环)。用各种反应溶液12μL转化大肠杆菌Top 10，将其涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，接着在37℃下培养过夜。所构建的载体命名为“TOPO2.1-mtrpE”。

表16

用牙签挑取菌落，将其接种在3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中并培养过夜。利用质粒小量制备试剂盒回收质粒DNA。通过DNA测序识别突变trpE基因的核苷酸序列。用BamHI和SalI消化含突变trpE基因的TOPO2.1-mtrpE，然后进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。结果，获得了660bp大小的DNA片段。将获得的片段连接到用BamHI和SalI消化的pSKH载体上。用连接混合物转化大肠杆菌Top 10。将转化的细胞涂布在含卡那霉素的LB固体培养基上并在37℃下培养过夜。所构建的载体命名为“pSKH-mtrpE”。

用牙签挑取菌落，将其接种在3mL含卡那霉素的LB液体培养基中并培养过夜。利用质粒小量制备试剂盒(QIAGEN)回收质粒DNA，测量pSKH-mtrpE的大小。通过NheI消化来去除所述质粒的复制起点然后连接。将DNA片段引入CJ500，再将其涂布到含卡那霉素的LB固态培养基上并在37℃下过夜。利用所生成的菌落和引物29和30进行PCR，结果证实了4.4kb条带。根据该结果，可以证实含所述突变trpE基因的pSKH载体被成功引入染色体DNA。为了从染色体DNA中去掉除突变trpE基因之外的载体，将所述菌株在LB+10％蔗糖的培养基中培养16小时，接着涂布到LB平板培养基上。将所生成的菌落在含卡那霉素和不含卡那霉素的固体培养基上培养。选择在不含抗生素的培养基上生长的菌落，然后进行DNA测序。然后，最终选出由亮氨酸取代trpE基因第21位氨基酸的突变菌株。该突变菌株命名为“CJ600(Trp⁺ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB aroG^mtrpE^m)”，并于2006年12月8日保藏在KFCC(Korean Federation of Culture Collection)的KCCM(Korean CultureCenter of Microorganisms)中，该国际保藏单位位于361-221，Hongje-1-Dong，Seodaemungu-Gu，Seoul，Korea(Accession No.KCCM10812P)。

实施例9：比较通过基因重组构建的所述微生物的色氨酸产率

在该实施例中，将实施例1-实施例6中构建的重组菌株CJ001、CJ100、CJ200、CJ300、CJ400、CJ500和CJ600(KCCM 10812P)的菌落每个都用接种环涂布到LB固体培养基上，并培养过夜。每个生长的菌株都用一个接种环接种到滴定烧瓶培养基中，该培养基成分如表17中所示。接种之后，将菌株在37℃、200rpm下培养48小时。比较从上述培养物中获得的色氨酸和L-苯丙氨酸水平以及从产L-苯丙氨酸的突变大肠杆菌KFCC 10066培养物中获得的色氨酸和苯丙氨酸水平。光密度(OD)、L-色氨酸和L-苯丙氨酸水平由三个烧瓶中获得的平均值来表示。

表17

结果，如表18中所示，产L-苯丙氨酸的大肠杆菌突变KFCC 10066中没有产生L-色氨酸，而本发明中开发的大肠杆菌CJ600(KCCM10812P)中产生了6.5g/L的L-色氨酸。

表18

工业实用性

通过释放色氨酸缺陷型并突变或钝化基因，本发明的发明者从产L-苯丙氨酸的大肠杆菌开发出了高浓度生产色氨酸而不再产L-苯丙氨酸的重组大肠杆菌菌株CJ600。特别地，所述重组大肠杆菌菌株CJ600(KCCM10812P)由产L-苯丙氨酸的突变大肠杆菌KFCC 10066，通过释放色氨酸缺陷型，钝化染色体上的pheA、trpR、mtr和tnaAB基因并突变aroG和trpE基因而制备。通过培养上述重组菌株可以高浓度地生产L-色氨酸，表明提高了L-色氨酸的产率。

本领域技术人员应当明白，上述说明书中披露的概念和特定实施方式可以很容易地用作改良或设计其它用于实施与本发明目的相同的实施方式的基础。本领域技术人员还应明白，这种等价实施方式并不偏离本发明的权利要求书中列出的实质和范围。

序列表

<110>CJ第一制糖株式会社

<120>原产L-苯丙氨酸的产L-色氨酸的基因工程重组大肠杆菌

     以及用所述微生物来生产L-色氨酸的方法

<130>FP09KR849

<160>39

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>38

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 1

<400>1

aggcaacact atgacatcgt gtaggctgga gctgcttc                      38

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 2

<400>2

ggtcgccatt aacaacgtgg catatgaata tcctccttag                    40

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 3

<400>3

tattgagtgt atcgccaac                                           19

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 4

<400>4

cgatgtcata gtgttgcc                                            18

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 5

<400>5

ccacgttgtt aatggcgacc                                                20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 6

<400>6

ttcattgaac gggtgatttc                                                20

<210>7

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 7

<400>7

tccgcacgtt tatgatatgc tatcgtactc tttagcgagt acaaccgggg gtgtaggctg    60

gagctgcttc                                                           70

<210>8

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 8

<400>8

gccacgtctt atcaggccta caaaatcaat cgcttttcag caacacctct catatgaata    60

tcctccttag                                                           70

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 9

<400>9

gcgccgggcg tatcgacgca                                                20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 10

<400>10

gcatatcata aacgtgcgga                                                20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 11

<400>11

tgtaggcctg ataagacgtg                                                20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 12

<400>12

aaggggcgat cggcgtgttt                                                20

<210>13

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 13

<400>13

atggcaacac taaccaccac ccaaacgtca ccgtcgctgc ttggcggcgt gtgtaggctg    60

gagctgcttc                                                           70

<210>14

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 14

<400>14

ttactgatac accggcagta aattaaagct cgataaaata tgcaccagtg catatgaata    60

tcctccttag                                                           70

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 15

<400>15

gcagccgtta cattggtaac                                                20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 16

<400>16

gtggtggtta gtgttgccat                                                20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 17

<400>17

tactgccggt gtatcagtaa                                                20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 18

<400>18

tcaaaccgtc agcacggctg                                                20

<210>19

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 19

<400>19

atgaaggatt atgtaatgga aaactttaaa catctccctg aaccgttccg gtgtaggctg    60

gagctgcttc                                                           70

<210>20

<211>70

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 20

<400>20

ttagccaaat ttaggtaaca cgttaaagac gttgccgaac cagcacaaaa catatgaata    60

tcctccttag                                                           70

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 21

<400>21

ttaagcgaaa tcaccgggga a                                              21

<210>22

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 22

<400>22

atgtccgagc actggcgc                                                  18

<210>23

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 23

<400>23

tgctctagag atccttttta acccatcaca tat                                 33

<210>24

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 24

<400>24

cgcggatcct cgtgatggca ggttgggcgt cgc                                 33

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 25

<400>25

cgcggatccg aaaagcgatc cataagatat                                30

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 26

<400>26

cgcgtcgact gctggcaggc ctgctttgtt                                30

<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 27

<400>27

cgatatgatc accctacaat atctcgctga                                30

<210>28

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 28

<400>28

tcagcgagat attgtagggt gatcatatcg                                30

<210>29

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 29

<400>29

cgcggatcca ccgtggaaat ttccacgccg                                30

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 30

<400>30

cgcgtcgact ttccgctgac agttgcggta                                      30

<210>31

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 31

<400>31

gcttatcgcg acaatgccac cgcgcttttt cac                                  33

<210>32

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 32

<400>32

gtgaaaaagc gcggtggcat tgtcgcgata agc                                  33

<210>33

<211>1161

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>33

atgacatcgg aaaacccgtt actggcgctg cgagagaaaa tcagcgcgct ggatgaaaaa     60

ttattagcgt tactggcaga acggcgcgaa ctggccgtcg aggtgggaaa agccaaactg    120

ctctcgcatc gcccggtacg tgatattgat cgtgaacgcg atttgctgga aagattaatt    180

acgctcggta aagcgcacca tctggacgcc cattacatta ctcgcctgtt ccagctcatc    240

attgaagatt ccgtattaac tcagcaggct ttgctccaac aacatctcaa taaaattaat    300

ccgcactcag cacgcatcgc ttttctcggc cccaaaggtt cttattccca tcttgcggcg    360

cgccagtatg ctgcccgtca ctttgagcaa ttcattgaaa gtggctgcgc caaatttgcc    420

gatattttta atcaggtgga aaccggccag gccgactatg ccgtcgtacc gattgaaaat    480

accagctccg gtgccataaa cgacgtttac gatctgctgc aacataccag cttgtcgatt    540

gttggcgaga tgacgttaac tatcgaccat tgtttgttgg tctccggcac tactgattta    600

tccaccatca atacggtcta cagccatccg cagccattcc agcaatgcag caaattcctt    660

aatcgttatc cgcactggaa gattgaatat accgaaagta cgtctgcggc aatggaaaag    720

gttgcacagg caaaatcacc gcatgttgct gcgttgggaa gcgaagctgg cggcactttg    780

tacggtttgc aggtactgga gcgtattgaa gcaaatcagc gacaaaactt cacccgattt    840

gtggtgttgg cgcgtaaagc cattaacgtg tctgatcagg ttccggcgaa aaccacgttg    900

ttaatggcga ccgggcaaca agccggtgcg ctggttgaag cgttgctggt actgcgcaac     960

cacaatctga ttatgacccg tctggaatca cgcccgattc acggtaatcc atgggaagag    1020

atgttctatc tggatattca ggccaatctt gaatcagcgg aaatgcaaaa agcattgaaa    1080

gagttagggg aaatcacccg ttcaatgaag gtattgggct gttacccaag tgagaacgta    1140

gtgcctgttg atccaacctg a                                              1161

<210>34

<211>327

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>34

atggcccaac aatcacccta ttcagcagcg atggcagaac agcgtcacca ggagtggtta     60

cgttttgtcg acctgcttaa gaatgcctac caaaacgatc tccatttacc gttgttaaac    120

ctgatgctga cgccagatga gcgcgaagcg ttggggactc gcgtgcgtat tgtcgaagag    180

ctgttgcgcg gcgaaatgag ccagcgtgag ttaaaaaatg aactcggcgc aggcatcgcg    240

acgattacgc gtggatctaa cagcctgaaa gccgcgcccg tcgagctgcg ccagtggctg    300

gaagaggtgt tgctgaaaag cgattga                                        327

<210>35

<211>1245

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>35

atggcaacac taaccaccac ccaaacgtca ccgtcgctgc ttggcggcgt ggtgattatc     60

ggcggcacca ttattggcgc agggatgttt tctctgccag tggtcatgtc cggggcgtgg    120

tttttctggt caatggcggc gctgatcttt acctggttct gtatgctgca ttccggcttg    180

atgattctgg aagctaacct gaattacaga atcggttcga gttttgacac catcaccaaa    240

gatttgctgg gcaaaggctg gaacgtggtc aacggcattt ccattgcctt tgtgctctat    300

atcctgacct atgcctatat ttctgccagt ggttcgattc tgcatcacac cttcgcagag    360

atgtcactaa acgtcccggc acgggcggcg ggttttggtt ttgcattgct ggtagcgttt    420

gtggtgtggt tgagcactaa agccgtcagt cgcatgacag cgattgtgct gggggcgaaa    480

gtcattacct tcttcctcac ctttggtagc ctgctggggc atgtgcagcc tgcgacattg    540

ttcaacgtcg ccgaaagcaa tgcgtcttat gcaccgtatc tgttgatgac cctgccgttc    600

tgtctggcat cgtttggtta tcacggtaac gtgccaagcc tgatgaagta ttacggcaaa    660

gatccgaaaa ccatcgtgaa atgtctggtg tacggtacgc tgatggcgct ggcgctgtat    720

accatctggt tgctggcgac gatgggtaac atcccgcgtc cggagtttat cggtattgca    780

gagaagggcg gtaatattga tgtgctggta caggcgttaa gcggcgtact gaacagccgt    840

agtctggatc tgctgctggt cgtgttctca aactttgcgg tagcgagttc gttcctcggc    900

gtaacgctgg gtttgtttga ctatctggca gatctgtttg gtttcgacga ctcggctgtg    960

ggccgcttga aaacggcatt gctgaccttt gccccgccag ttgtgggggg gctgttgttc    1020

ccgaacggat tcctgtacgc cattggttat gctggtttag cggctaccat ctgggcggca    1080

attgttccgg cgctgttagc ccgtgcatcg cgtaaacgct ttggcagccc gaaattccgc    1140

gtctggggtg gcaagccgat gattgcgctg attctggtgt ttggcgtcgg caacgcactg    1200

gtgcatattt tatcgagctt taatttactg ccggtgtatc agtaa                    1245

<210>36

<211>1416

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>36

atggaaaact ttaaacatct ccctgaaccg ttccgcattc gtgttattga gccagtaaaa     60

cgtaccactc gcgcttatcg tgaagaggca attattaaat ccggtatgaa cccgttcctg    120

ctggatagcg aagatgtttt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtgacg    180

cagagcatgc aggctgcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag tcgtagctac    240

tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatacaccat tccgactcac    300

cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa    360

aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggcg ttctctaact atttctttga taccacgcag    420

ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat    480

acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt    540

gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca    600

ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac    660

gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag    720

cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat    780

gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg    840

tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg    900

caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta    960

ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat   1020

ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca   1080

ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg   1140

ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg   1200

ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta   1260

accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa   1320

catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta   1380

ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa                             1416

<210>37

<211>1248

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>37

atgactgatc aagctgaaaa aaagcactct gcattttggg gtgttatggt tatagcaggt     60

acagtaattg gtggaggtat gtttgcttta cctgttgatc ttgccggtgc ctggtttttc    120

tggggtgcct ttatccttat cattgcctgg ttttcaatgc ttcattccgg gttattgtta    180

ttagaagcaa atttaaatta tcccgtcggc tccagtttta acaccatcac caaagattta    240

atcggtaaca cctggaacat tatcagcggt attaccgttg ccttcgttct ctatatcctc    300

acttatgcct atatctctgc taatggtgcg atcattagtg aaacgatatc aatgaatttg    360

ggttatcacg ctaatccacg tattgtcggg atctgcacag ccattttcgt tgccagcgta    420

ttgtggttaa gttcgttagc cgccagtcgt attacctcat tgttcctcgg gctgaagatt    480

atctcctttg tgatcgtgtt tggttctttt ttcttccagg tcgattactc cattctgcgc    540

gacgccacca gctccactgc gggaacgtct tacttcccgt atatctttat ggctttgccg    600

gtgtgtctgg cgtcatttgg tttccacggc aatattccca gcctgattat ttgctatgga    660

aaacgcaaag ataagttaat caaaagcgtg gtatttggtt cgctgctggc gctggtgatt    720

tatctcttct ggctctattg caccatgggg aatattccgc gagaaagctt taaggcgatt    780

atctcctcag gcggcaacgt tgattcgctg gtgaaatcgt tcctcggcac caaacagcac    840

ggcattatcg agttttgcct gctggtgttc tctaacttag ctgttgccag ttcgttcttt    900

ggtgtcacgc tggggttgtt cgattatctg gcggacctgt ttaagattga taactcccac    960

ggcgggcgtt tcaaaaccgt gctgttaacc ttcctgccac ctgcgttgtt gtatctgatc   1020

ttcccgaacg gctttattta cgggatcggc ggtgccgggc tgtgcgccac catctgggcg   1080

gtcattattc ccgcagtgct tgcaatcaaa gctcgcaaga agtttcccaa tcagatgttc   1140

acggtctggg gcggcaatct tattccggcg attgtcattc tctttggtat aaccgtgatt   1200

ttgtgctggt tcggcaacgt ctttaacgtg ttacctaaat ttggctaa                1248

<210>38

<211>1053

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>mutation

<222>(449)

<223>449 nucleotide c->t mutation，P150L

<400>38

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc     60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga    120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca    180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt    240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc    300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac    360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg    420

gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccta caatatctcg ctgacctgat gagctggggc    480

gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct    540

tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt    600

aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt    660

gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac    720

tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca    780

caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat    840

gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg    900

gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac    960

ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa   1020

ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa                                1053

<210>39

<211>1563

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>mutation

<222>(61)

<223>c->t mutation，P21S

<400>39

atgcaaacac aaaaaccgac tctcgaactg ctaacctgcg aaggcgctta tcgcgacaat     60

tccaccgcgc tttttcacca gttgtgtggg gatcgtccgg caacgctgct gctggaatcc    120

gcagatatcg acagcaaaga tgatttaaaa agcctgctgc tggtagacag tgcgctgcgc    180

attacagctt taggtgacac tgtcacaatc caggcacttt ccggcaacgg cgaagccctc    240

ctggcactac tggataacgc cctgcctgcg ggtgtggaaa gtgaacaatc accaaactgc    300

cgtgtgctgc gcttcccccc tgtcagtcca ctgctggatg aagacgcccg cttatgctcc    360

ctttcggttt ttgacgcttt ccgtttattg cagaatctgt tgaatgtacc gaaggaagaa    420

cgagaagcca tgttcttcgg cggcctgttc tcttatgacc ttgtggcggg atttgaagat    480

ttaccgcaac tgtcagcgga aaataactgc cctgatttct gtttttatct cgctgaaacg    540

ctgatggtga ttgaccatca gaaaaaaagc acccgtattc aggccagcct gtttgctccg    600

aatgaagaag aaaaacaacg tctcactgct cgcctgaacg aactacgtca gcaactgacc    660

gaagccgcgc cgccgctgcc agtggtttcc gtgccgcata tgcgttgtga atgtaatcag    720

agcgatgaag agttcggtgg cgtagtgcgt ttgttgcaaa aagcgattcg cgctggagaa    780

attttccagg tggtgccatc tcgccgtttc tctctgccct gcccgtcacc gctggcggcc    840

tattacgtgc tgaaaaagag taatcccagc ccgtacatgt tttttatgca ggataatgat     900

ttcaccctat ttggcgcgtc gccggaaagc tcgctcaagt atgatgccac cagccgccag     960

attgagatct acccgattgc cggaacacgc ccacgcggtc gtcgcgccga tggttcactg    1020

gacagagatc tcgacagccg tattgaactg gaaatgcgta ccgatcataa agagctgtct    1080

gaacatctga tgctggttga tctcgcccgt aatgatctgg cacgcatttg cacccccggc    1140

agccgctacg tcgccgatct caccaaagtt gaccgttatt cctatgtgat gcacctcgtc    1200

tctcgcgtag tcggcgaact gcgtcacgat cttgacgccc tgcacgctta tcgcgcctgt    1260

atgaatatgg ggacgttaag cggtgcgccg aaagtacgcg ctatgcagtt aattgccgag    1320

gcggaaggtc gtcgccgcgg cagctacggc ggcgcggtag gttatttcac cgcgcatggc    1380

gatctcgaca cctgcattgt gatccgctcg gcgctggtgg aaaacggtat cgccaccgtg    1440

caagcgggtg ctggtgtagt ccttgattct gttccgcagt cggaagccga cgaaacccgt    1500

aacaaagccc gcgctgtact gcgcgctatt gccaccgcgc atcatgcaca ggagactttc    1560

tga                                                                  1563

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