阿片样物质或阿片样物质模拟物在治疗抗性癌症患者中的用途

技术领域

本发明涉及治疗抗性(resistant)癌症患者的新策略。

背景技术

由于肿瘤细胞对放射和或化学疗法的抗性，抗癌疗法常常无效。当抗性是在治疗过程中获得时，其通常表现为相同剂量下(辐射(radiation)或细胞毒性物质)的肿瘤消退的量减少或等量肿瘤消退所需的剂量增加。当抗性是内在的，即不是在抗癌治疗过程中获得或诱导的，肿瘤细胞原本已经对一种或多种抗癌药物或电离辐射缺乏敏感性。

癌细胞的化学敏感性通常因人而异。例如对于胰腺癌而言，已知仅25％的全部患者受益于抗癌药物吉西他滨。其余75％对该化学疗法有内在性抗性(intrinsic resistance)。具有内在化学抗性或辐射抗性的其他肿瘤细胞的实例为成胶质细胞瘤或黑色素瘤细胞。

肿瘤细胞对放射疗法和/化学疗法的内在性抗性或获得性抗性(或不响应)可以有多种原因，并且如上所示可以因人而异。尽管已进行了大量研究，确切机制仍然不清楚。然而已知单个突变，例如在药物结合位点或细胞解毒过程中的突变可以被解释为化学敏感性缺乏或降低。对多种抗癌药物的交叉抗性通常限制抗癌治疗的有效性。

所谓的多重抗药性(MDR)具有重要的临床意义。根据这一观点，膜蛋白，即ATP结合区(ABC)转运蛋白，诸如P-糖蛋白或多重抗药性相关蛋白(MRP)表达增加，从而导致药物经细胞膜的主动转运流出增加。表现出多重抗药性的患者常常对广谱细胞毒性药物有抗性。

抗性不限于化学治疗或抗癌药物，癌症患者还可以表现出对在放射疗法中应用的离子化放射(irradiation)的内在性或获得性抗性。已知存在例如来自于黑色素瘤和成胶质细胞瘤的内在辐射抗性。

可以通过暴露于小剂量或分次剂量的离子化辐射诱导辐射抗性。多项研究在体外甚至是人类细胞中以及多个动物模型中证明了该效应。可能有不同的细胞放射防护机制参与，诸如某些细胞质和核蛋白的改变，增加的基因表达或DNA修复过程。

因此肿瘤学非常需要新的可以使癌症治疗更有效的策略。特别地，本发明的目的是提供治疗癌症患者的新方法，所述患者表现出对常规抗癌疗法，诸如抗癌药物(化学疗法)或放射疗法的抗性，或提供治疗具有凋亡(apoptosis)抗性细胞的癌症患者的新方法。

目前发现能够抑制细胞增殖或癌症细胞生长的阿片样物质可以战胜这些细胞中的抗性，因此通过在治疗放射疗法和/或化学疗法抗性癌症患者的过程中使用阿片样物质或阿片样物质模拟物实现本发明的目的。因此这些阿片样物质提供了治疗患者的新策略，所述患者到目前为止被认为是通过常规抗癌方法无法治疗的或无法有效治疗的。该组被称为无法治疗的癌症患者也可以被称为“无响应者”、“响应差者”或“非-化学敏感性的”或“非-放射敏感性的”癌症患者。

进一步发现阿片样物质和阿片样物质模拟物可以战胜癌症细胞的凋亡抗性，因此可以有效地在临床上用作抗癌物质。特别地，最令人惊讶地，发现阿片样物质，特别是美沙酮，对非抗性(即敏感性)白血病细胞的效果与常规化学疗法(例如多柔比星)和辐射治疗相同，并且正常外周血淋巴细胞在治疗后存活。因此，根据本发明的一个实施方式，阿片样物质也可有效地杀死肿瘤细胞，但基本上不影响患者的正常健康细胞。

在本发明的上下文中，术语“阿片样物质”被定义为一组在化学上不同的天然、合成或半合成物质，起激动或拮抗的作用，全部可以结合于已知的阿片受体，优选结合于μ阿片受体并且能够阻止癌细胞增殖。阿片样物质组包括天然阿片，诸如生物碱，如吗啡、二氢可待因、可待因和蒂巴因，以及衍生自天然麻醉剂(opiate)的半合成阿片(例如氢吗啡酮、氢可酮、羟考酮、羟吗啡酮、二氢脱氧吗啡、二乙酰吗啡(海洛因)、尼可吗啡、二丙酰基吗啡(dipropanoylmorphine)、苄吗啡和乙基吗啡)，或全合成阿片样物质，诸如芬太尼、哌替啶和美沙酮、曲马多或右丙氧芬。还包括内源性阿片肽，其是可以在体内天然生成的内啡肽、强啡肽或脑啡肽，也可以被合成。

已知阿片样物质用作镇痛剂。事实上以前已知阿片受体，特别是μ阿片受体参与导致凋亡的信号通路的活化(Polakiewicz等人，1998)。在过去的十年中，发现阿片样物质可以促进凋亡(Hatsukari等人，2003)。进一步讨论了使用阿片样物质在小肺癌细胞中诱导凋亡(Heusch&Maneckjee 1999)。然而，潜在的机制并未揭示，那些结果也未显示应用阿片样物质克服对常规抗癌治疗的抗性。

发明内容

根据本发明，阿片样物质能够抑制癌细胞增殖和/或生长。该活性包括，例如细胞抑制(cytostatic)或细胞毒活性以及细胞和/或肿瘤生长阻滞活性。癌细胞增殖是细胞分化抑制的结果。特别地，阿片样物质或阿片样物质模拟物诱导肿瘤中的细胞死亡。本发明上下文中的细胞死亡包括所有类型的细胞死亡。这可以包括坏死性以及凋亡性细胞死亡或自吞噬。在本发明的一个实施方式中，细胞死亡由半胱天冬酶依赖性或半胱天冬酶非依赖性通路的活化而诱导。然而，阿片样物质可以通过多种通路诱导细胞死亡。在本发明的一个优选的实施方式中，阿片样物质在癌细胞中诱导凋亡。

一般而言，已知可以通过两种主要的生物化学通路诱导凋亡。“死亡受体通路”(或外源性通路)包括TNF-受体诱导(肿瘤坏死因子)的模型和Fas-受体诱导的模型(Fas-受体还被称作Apo-1或CD95)。结合于这些受体导致细胞中形成死亡-诱导信号传导通路，包括半胱天冬酶-8的活化。“线粒体通路”(或内源性通路)涉及细胞色素c从线粒体中释放，与Apaf-1结合以及前-半胱天冬酶-9活化。已知数种调节剂可活化或灭活凋亡通路，诸如促凋亡蛋白Bax和Bak或抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl_XL或XIAP。

在本发明的上下文中，术语“阿片样物质模拟物”被定义为这样的物质，该物质能够在癌细胞中直接或间接诱导基本上与阿片样物质相同效应，特别是鉴于阿片样物质与阿片受体(例如μ受体)结合和/或诱导细胞死亡，尤其是通过线粒体通路诱导凋亡的效应。术语“阿片样物质模拟物”还包括导致阿片受体超表达的物质，诸如，例如可卡因，以及以此间接诱导细胞死亡的物质。

在本发明的一个实施方式中，阿片样物质或阿片样物质模拟物通过下述一种或多种机制诱导凋亡：

i.切割肿瘤细胞中的半胱天冬酶-3和PARP

ii.切割半胱天冬酶-9并下调XIAP

iii.下调Bcl_XL

根据本发明的一个优选的实施方式，阿片样物质是美沙酮组的成员，包括D-/L-美沙酮、左美沙酮、左旋乙酰美沙酮和哌腈米特。这些阿片样物质均能作为盐使用。D-/L-美沙酮的外消旋形式优选以盐酸盐的形式提供。在本发明的一个优选的实施方式中，阿片样物质美沙酮在癌细胞中通过线粒体通路诱导凋亡。

根据本发明，术语“抗性”、“辐射抗性”或“化学抗性”被定义为癌细胞对至少一种常规癌症疗法，即抗癌药物或放射疗法的敏感性降低。患有此类癌症的患者被确定为“抗性”癌症患者。由于抗性可以是内在性的或获得性的，因此所观察的敏感性的降低是与完全敏感的“正常”癌细胞比较，所述“正常”癌细胞与治疗开始时初始敏感性相比对所应用的治疗有效量抗癌药物和/或放射有响应。在后一种情况中，抗性表现为相同剂量(放射或抗癌药物)下肿瘤消退的量减少或等量肿瘤消退所需要的剂量增加。

在一个特别优选的实施方式中，阿片样物质或阿片样物质模拟物用于治疗表现出一种或多种下述抗性的癌症患者：

○凋亡抗性

○多重抗药性

○抗癌药物抗性

○细胞毒性药物抗性

○对活性氧类别的抗性

○对DNA损伤剂的抗性

○对毒性抗体的抗性

○多柔比星抗性

○单一或交叉抗性，特别是对一种或多种下述药品的抗性：甲氨蝶呤、阿糖胞苷、顺铂、依托泊苷、长春新碱、紫杉醇(泰素)、卡铂、替尼泊苷、地塞米松、泼尼松龙、环磷酰胺、异环磷酰胺、多柔比星、表柔比星、柔红霉素、巯嘌呤、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶

○放射抗性(例如α、β、γ或俄歇电子)

因此，在本发明的上下文中“抗性”可以是全部的或部分的；换言之，根据本发明认为可以治疗的患者可以表现出对常规抗癌治疗敏感性降低或甚至完全缺乏敏感性。这些患者还可以被定义为“无应答者”或“应答差者”。

“抗性”癌症或肿瘤的进一步的同义词是“难治”型癌症，其可以是完全或部分难治的。内在性抗性因此还可以被确定为“原发性难治性癌症”。一种特殊形式的难治性或抗性癌症细胞是所谓的“动态难治性细胞”；这是一种已知例如来白血病细胞的现象，当细胞首次被杀死后可迅速复发以至于几乎不可能获得有效的治疗。

如本发明上下文中所使用的，术语“常规”治疗或疗法是指基于过去的研究结果和/或法规批准，目前公认的并广泛使用的对于确定类型癌症的治疗。

常规抗癌药物包括可以杀死癌症细胞或减少和/或停止其生长或增殖的细胞毒和细胞抑制剂。这些抗癌药物的作用模式可以不同；实例包括抗代谢剂(例如阿糖胞苷、甲氨蝶呤、巯嘌呤或氯法拉滨)、DNA交联剂(例如顺铂及其衍生物)、DNA嵌入物(intercalating substance)(例如多柔比星)、拓扑异构酶毒剂(例如依托泊苷)、激酶抑制剂(例如西妥昔单抗)、甾类(steroids)(例如地塞米松)或有丝分裂抑制剂(例如长春新碱)。一个白血病常规抗癌治疗的实例是给予多柔比星。

常规放疗还可以包括放射疗法，即，使用来自X-射线，α、β、γ射线，俄歇电子，紫外线，中子，质子和其他辐射源的高能辐射杀死癌细胞和使肿瘤萎缩。辐射可以源自身体外部的设施(外线束放射疗法)或其可以源自放置在身体内部癌细胞附近的辐射源(内部放射疗法)。全身性放射疗法使用能够在血流中移动至靶组织的放射性物质，诸如放射标记的单克隆抗体。辐射抗性癌细胞对这些治疗无响应或仅有部分响应。

如上所述，根据本发明的一个实施方式，使用阿片样物质或阿片样物质模拟物克服或“破坏”癌细胞对常规抗癌治疗和/或放射治疗的内在性抗性或获得性抗性或凋亡抗性。在本发明的一个实施方式中，根据本发明认为可治疗的癌细胞表达阿片受体，特别是μ阿片受体。

在一个进一步的实施方式中，癌症包括但不限于白血病、乳腺癌、成胶质细胞瘤、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑癌、结肠癌、结直肠癌。

根据本发明认为可治疗的对放射具有内在性抗性的癌症类型的实例为成胶质细胞瘤、黑素瘤或胰腺癌细胞。乳腺癌、膀胱癌或白血病通常对化学疗法有抗性。常常获得抗性的癌症类型的实例为黑色素瘤、结肠癌、脑瘤、成胶质细胞瘤、脑癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、乳房癌、肺癌、慢性白血病或骨肉瘤(osteosarkoma)。

在本发明一个进一步的实施方式中，阿片样物质或阿片样物质模拟物可以与常规抗癌物质或治疗，例如细胞抑制或细胞毒物质或放疗联用，即作为合成物(composite)使用。例如阿片样物质或阿片样物质模拟物可以与天然和/或合成抗癌物质、天然和/或合成细胞毒物质、抗生素、细胞毒抗体、激素、精神药物、天然或基因修饰的有机体以及来自有机体的物质(例如植物、微生物、水果)、治疗疼痛的物质和/或不同种类的与底物(例如抗体)结合或未结合的辐射联用。患者可以对该治疗有抗性或无抗性。

“合成物”是指含有治疗有效量的根据本发明定义的阿片样物质或阿片样物质模拟物(组分A)和至少一种其它的抗癌物质(组分B)的药物制剂。该“合成物”可以由单一组合物或至少两种组合物构成，可以同时或相继给予患者。上述物质优选与美沙酮组合使用。

本发明的合成物可有利的用于癌细胞的有效治疗，其原因在于与单一组合物相比，其可以表现出协同效应。特别地，合成物具有美沙酮作为组分A，并且下述药剂之一可能作为组分B：甲氨蝶呤、阿糖胞苷、顺铂、依托泊苷、长春新碱。此外，组合治疗还可能包括放射治疗。

在本发明的一个优选的实施方式中，阿片样物质用于治疗抗性或敏感性非实体癌症，即影响血液、骨髓和淋巴结的全部恶性血液病，包括急性成淋巴细胞白血病、B细胞淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和所有白血病的前体形式(pro-form)、毛样细胞白血病(hairy cell leukaemia)、霍奇金病、非-霍奇金病、多发性骨髓瘤。

具体实施方式

实施例1：使用美沙酮处理白血病细胞，特别是处理常规疗法中常规抗癌药物未能杀死的白血病细胞。

药物和试剂

每项实验临用前将D，L-美沙酮盐酸盐(美沙酮，Sigma，Taufkirchen，Germany)溶解于无菌蒸馏水中确保制剂的恒定质量。

细胞培养

人髓性白血病细胞系HL-60和人成淋巴细胞白血病T-细胞系CEM在37℃和5％CO₂条件下生长于含有10％胎牛血清(Biochrom，Berlin，Germany)、pH 7.3的10mM HEPES(Biochrom)、100U/mL青霉素(GIBCO)、100μg/mL链霉素(GIBCO)和2mM L-谷氨酰胺(Biochrom)的RPMI 1640(GIBCO，Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。CEM^CD95R对1μg/mL抗-CD95(Friesen等人，1996)有抗性，CEM^DOXOR对0.1μg/mL多柔比星(Friesen等人，2004)有抗性。CEM^CD95R是凋亡抗性的并且具有多重抗药性。CEM^CD95R对诸如甲氨蝶呤、阿糖胞苷、顺铂、依托泊苷和长春新碱的数种抗癌药以及γ-和β-放射有交叉抗性(Friesen等人，1996，Los等人，1997，Friesen等人，2007)。本研究中使用的所有细胞系均不含支原体。

诱导凋亡

在150mL培养瓶或96孔板中用30、20、15、10μM美沙酮处理白血病细胞(1×10⁵个细胞/mL)。24h和48h后，如文献所述通过流式细胞仪测量凋亡的定量(Carbonari等人，1994，Friesen等人，2003)。简言之，为测定凋亡，如Nicoletti等(1991)所述用含有0.1％柠檬酸钠加0.1％Triton X-100和50μg/mL碘化丙啶的Nicoletti缓冲液裂解细胞。通过亚二倍体DNA(subG1)或FSC/SSC分析测定凋亡细胞百分比(Nicoletti等人，1991，Carbonari等人，1994)。通过流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)分析被碘化丙啶(PI)染色的核或细胞的前向散射/侧向散射(FSC/SSC)图。

分离外周血淋巴细胞

从健康人的新鲜血液中分离外周血淋巴细胞(PBLs)。在96孔板中用30、20、15、10μM美沙酮处理PBLs(1mL中含有1×10⁶个细胞)。24h和48h后如文献描述通过流式细胞仪对凋亡进行定量(Carbonari等人，1994)。

抑制美沙酮诱导的通过zVAD.fmk的半胱天冬酶的活化

如以前文献的描述进行半胱氨酸酶活化抑制实验(Friesen等人，2007)。简言之，使用浓度为50μmol/L的半胱氨酸酶广谱三肽抑制剂zVAD.fmk(苯甲酰基羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮，Enzyme Systems Products，Dubli，USA)。美沙酮处理前1h用zVAD.fmk预孵育HL-60和CEM细胞。24h和48h后通过亚二倍体DNA(subG1)或FSC/SSC分析测定凋亡细胞百分比。通过流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)分析被碘化丙啶(PI)染色的核(Nicoletti等人，1991)或细胞的前向散射/侧向散射(FSC/SSC)图(Carbonari等人，1994)。

蛋白质印迹分析

如文献所述进行蛋白质印迹分析(Friesen等人，2004，Friesen等人，2003)。使用兔抗-PARP多克隆抗体(1∶5000，Roche)、小鼠-抗-半胱天冬酶-3单克隆抗体(1∶1000，Cell-Signalling)、小鼠-抗-半胱天冬酶-8单克隆抗体(1∶1000，Cell-Signalling)、兔-抗-活性-半胱天冬酶-9多克隆抗体(1∶1000，Cell-Signalling)、小鼠-抗-XIAP单克隆抗体(1∶1000，Transduction-Laboratories，Lexington，Kentucky)、小鼠-抗-Fas(抗-CD95)单克隆抗体(1∶1000，Transduction-Laboratories)、小鼠-抗-Fas配体(抗-CD95-配体)单克隆抗体(1∶250，BD，Pharmingen)、兔-抗-Bax多克隆抗体(1∶250，Oncogene，Cambridge)、兔-抗-Bcl-X_S/L多克隆抗体(1∶1000，Santa-Cruz-Biotechnology，Santa-Cruz，CA)、兔-抗-p21多克隆抗体(1∶1000，Santa-Cruz)和小鼠抗-β-肌动蛋白单克隆抗体(Sigma)对PARP、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-8、XIAP、CD95、CD95-L、Bax、Bcl-x_L和β-肌动蛋白进行免疫检测。以过氧化物酶-结合的山羊-抗-小鼠IgG或过氧化物酶-结合的山羊-抗-兔IgG(1∶5000，Santa-Cruz)作为第二抗体用于增强化学发光系统(ECL，Amersham-Pharmacia，Freiburg，Germany)。通过检测β-肌动蛋白控制蛋白的等量上样。

美沙酮通过凋亡在CEM和HL-60细胞中诱导细胞杀伤而在非白血病PBLs中无毒性效应

研究显示抗癌药物在白血病和实体瘤中诱导凋亡并抑制增殖(Kaufmann&Earnshaw 2000)。因此，分析与已知的确定的抗癌药物相比，治疗用阿片样药物美沙酮是否能够在人成淋巴细胞白血病T-细胞系CEM和人髓性白血病细胞系HL-60中抑制增殖并引起凋亡(图1A，B)。用不同浓度美沙酮(30、20、15、10μM)处理24h和48h后，在CEM和HL-60细胞中检测到强的凋亡诱导(图1A)和强的生长抑制(图1B)。然后分析美沙酮是否也在非白血病外周血淋巴细胞(PBLs)中诱导凋亡(图1C)。用不同浓度美沙酮(30、20、15、10μM)孵育分离的PBLs。美沙酮处理24h和48h后发现与在处理诸如CEM的白血病细胞中使用的美沙酮浓度相当的浓度不能杀死PBLs(图1C)。这证明美沙酮在白血病细胞中诱导凋亡而对非白血病细胞无毒性效应。

美沙酮破坏白血病细胞中的多柔比星抗性、CD95-抗性和多重抗药性

对抗癌药物的抗性是治疗白血病和肿瘤患者的限制性因素(Bergman&Harris 1997，Friesen等人，2003)。已经发现美沙酮表现出强效的抗白血病活性并有效杀死白血病细胞。因此，分析美沙酮是否也可以在具有凋亡抗性的多柔比星抗性白血病细胞中诱导细胞死亡。用不同浓度的美沙酮(30、20、15、10μM)处理多柔比星抗性CEM白血病细胞(CEM^DoxoR)。美沙酮处理24h和48h后，通过流式细胞仪测定细胞死亡。用30、20、15μM美沙酮处理后，在多柔比星抗性细胞CEM^DoxoR中测定出强的凋亡诱导，与在敏感性白血病细胞CEM中观察到的相似(图2)，说明美沙酮克服多柔比星抗性和凋亡抗性。

然后分析美沙酮是否也可以杀死具有多重抗药性的白血病细胞。因此用不同浓度美沙酮(30、20、15、10μM)处理CD95-抗性白血病细胞CEM^CD95R，其对多种药物有抗性，诸如依托泊苷、顺铂、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、多柔比星、长春新碱。用30、20、15μM美沙酮处理24h和48h后，在CD95-抗性白血病细胞CEM^CD95R中测定出强的凋亡诱导，与在敏感性白血病细胞CEM中观察到的相似(图2)。这表明美沙酮不仅在敏感性白血病细胞中诱导凋亡，还可杀死常规抗癌药物未能杀死的多柔比星抗性白血病细胞和CD95-抗性白血病细胞(Friesen等人，1996，Los等人，1997)。

美沙酮在敏感性的、多柔比星抗性、CD95-抗性和多重抗药性白血病细胞中诱导半胱天冬酶依赖性细胞死亡并活化线粒体

美沙酮在敏感性和抗性白血病细胞中诱导凋亡而分子机制未知。因此要在白血病细胞中检测其机制和可能在美沙酮引起的细胞死亡中被改变的效应物分子。

半胱天冬酶在抗癌药物诱导的凋亡中发挥关键作用(Kaufmann&Earnshow 2000，Hengartner 2000)。因此使用蛋白质印迹分析法检测美沙酮在HL-60和CEM白血病细胞、具有凋亡抗性的多柔比星抗性白血病细胞CEM^DoxoR、具有多重抗药性和凋亡抗性的CD95-抗性白血病细胞CEM^CD95R中是否活化半胱天冬酶。用不同浓度美沙酮(20、15μM)处理后，HL-60和CEM白血病细胞(图3A)、以及多柔比星抗性白血病细胞CEM^DoxoR、和CD95-抗性白血病细胞CEM^CD95R(图3B)中半胱天冬酶-3和PARP被切割。抗癌药物可在白血病细胞中诱导半胱天冬酶-8的活化，美沙酮处理后未见其活化。为研究美沙酮在半胱天冬酶活化中的关键作用，用广谱半胱天冬酶抑制剂zVAD.fmk预孵育CEM和HL-60细胞。用zVAD.fmk孵育几乎完全抑制美沙酮-诱导的凋亡(图3C)，说明半胱天冬酶在美沙酮-诱导的白血病细胞凋亡中发挥关键作用。

研究已经显示抗癌药物在白血病和肿瘤细胞中活化线粒体通路和配体/受体通路(Kaufmann&Earnshow 2000)。研究线粒体是否在美沙酮诱导的白血病细胞凋亡中也发挥作用。用不同浓度美沙酮(20、15μM)处理CEM、HL-60、多柔比星-抗性白血病细胞CEM^DoxoR和CD95-抗性白血病细胞CEM^CD95R(图4)。24h和48h后，在HL-60和CEM白血病细胞(图4A)、以及多柔比星-抗性白血病细胞CEM^DoxoR和CD95-抗性白血病细胞CEM^CD95R中可见强的半胱天冬酶-9切割(37kDa片段)和强的半胱天冬酶抑制蛋白XIAP(X-连接的凋亡抑制蛋白)下调(图4B)。

通过促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族成员调节线粒体的改变。用不同浓度美沙酮(20、15μM)处理24h和48h后，在HL-60和CEM白血病细胞(图4A)、以及多柔比星-抗性白血病细胞CEM^DoxoR和CD95-抗性白血病细胞CEM^CD95R中可见强的Bcl-x_L下调(图4B)。美沙酮处理后在白血病细胞中未见Bax上调。

更进一步地，抗癌药物已经显示上调的死亡-诱导配体和死亡-诱导受体，诸如CD95，在美沙酮处理后的白血病细胞中未见上调(数据未显示)。这说明美沙酮在敏感性以及抗性白血病细胞中通过直接活化内源性线粒体通路诱导凋亡。

实施例2：美沙酮在成胶质细胞瘤细胞中诱导凋亡

成胶质细胞瘤是最具侵略性并且最常见的原发性脑部肿瘤。已知成胶质细胞瘤细胞对化学疗法和放射有高度抗性。治疗可以涉及化学疗法和放疗，但仅为缓解性措施，而无法治愈。此外，很多药物无法穿过血脑屏障，因此在成胶质细胞瘤的治疗中无效。美沙酮能够穿过血脑屏障。检测了美沙酮对成胶质细胞瘤的效应。更进一步地，检测了美沙酮与治疗浓度的多柔比星联用对成胶质细胞瘤细胞的效应。

人成胶质细胞瘤细胞系A172生长于37℃、5％CO₂条件下，含有10％胎牛血清(Biochrom，Berlin，Germany)、pH 7.3的10mMHEPES(Biochrom)、100U/mL青霉素(Invitrogen)、100μg/mL链霉素(Invitrogen)和2mM L-谷氨酰胺(Biochrom)的DMEN(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。在美沙酮处理前，将成胶质细胞瘤细胞以7000个细胞/cm²的密度接种，接种24h后处理细胞。

在75cm²培养瓶中，用30、20μg/mL美沙酮处理成胶质细胞瘤细胞A172(7000个细胞/cm²)。120h、144h、168h后，通过流式细胞仪对凋亡定量。为测定凋亡，用含有0.1％柠檬酸钠加0.1％TritonX-100和50μg/mL碘化丙啶的Nicoletti缓冲液裂解细胞。通过流式细胞仪分析碘化丙啶(PI)染色的核(FACSCalibur，Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)。

120h、144h、168h后，通过亚二倍体DNA分析测量凋亡细胞百分比。如下计算特定的细胞死亡百分比：100×(细胞培养基中实验性死亡细胞(％)-自发性死亡细胞(％))/(100％-培养基中自发性死亡细胞(％))。20μg/mL美沙酮处理120h后导致超过20％细胞死亡，168h后导致超过80％细胞死亡。30μg/mL美沙酮处理120h后导致超过85％细胞死亡，168h后导致接近100％细胞死亡(图5)。在三次独立的实验中获得相似的结果。这证明美沙酮在成胶质细胞瘤细胞中诱导高比例的凋亡。

实施例3：在成胶质细胞瘤细胞中美沙酮与多柔比星联用显示出协同诱导凋亡效应

用治疗浓度的0.1μg/mL多柔比星(多柔比星，白色柱)、低浓度的1μg/mL美沙酮(美沙酮，黑色柱)、和0.1μg/mL多柔比星加1μg/mL美沙酮(多柔比星+美沙酮，阴影柱)处理成胶质细胞瘤细胞A172(7000个细胞/cm²)。72h后通过流式细胞仪对凋亡定量。为测定凋亡，用含有0.1％枸橼酸钠加0.1％Trion X-100和50μg/mL碘化丙啶的Nicoletti-缓冲液裂解细胞。通过流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)分析被碘化丙啶(PI)染色的核。

治疗浓度的多柔比星与低浓度美沙酮联用对受试的成胶质细胞瘤细胞有强的凋亡效应(图6)。该测定表明美沙酮与其他化学疗法药物，此处为多柔比星联用时显示出协同效应。

实施例4：用可卡因在白血病细胞中诱导凋亡

用1000μg/mL可卡因处理CEM(白色柱)和HL-60(黑色柱)细胞。48h后通过亚二倍体DNA分析测量凋亡细胞百分比。如下计算特殊的细胞死亡百分比：100×(培养基中实验性死亡细胞(％)-自发性死亡细胞(％))/(100％-培养基中自发性死亡细胞(％))。数据是三次重复测定的平均值，其具有低于10％的标准偏差(SD)。在三次独立实验中获得相似的结果。

如图7所示，结果表明可卡因能够在CEM细胞中诱导凋亡。

实施例5：单独用D，L-美沙酮或联用氟达拉滨在从患者活体内分离出的癌细胞中诱导凋亡

从患者活体内分离出B-ALL(B-细胞淋巴性白血病)和CLL(慢性淋巴性白血病)细胞。用不同浓度的D，L-美沙酮或D，L-美沙酮加氟达拉滨处理这些细胞。

在第一项研究中，用30、20、15、10μM美沙酮处理B-ALL(B-细胞淋巴性白血病)细胞(50000个细胞/100μl)。48h和72h后通过流式细胞仪对凋亡定量测量。结果显示10μM美沙酮足以在处理72h的细胞中诱导高至超过80％的凋亡(见图8)。

在第二项研究中，单独用30、10、5、3、1、0.5、0.3和0.1μg/mL美沙酮或添加0.1μM氟达拉滨处理CLL(慢性淋巴性白血病)细胞(50000个细胞/200μl)。24h和48h后通过流式细胞仪对凋亡定量测量。结果显示3μg/mL美沙酮与0.1μM氟达拉滨联用在24h后即可在100％细胞中诱导凋亡(见图9)。

在第三项研究中，单独用30、10、5、3、1、0.5、0.3和0.1μg/mL美沙酮或添加0.1μM氟达拉滨处理CLL(慢性淋巴性白血病)细胞(50000个细胞/200μl)。24h和48h后通过流式细胞仪对凋亡定量测量。结果显示3μg/mL美沙酮与0.1μM氟达拉滨联用在48h后即可在接近50％细胞中诱导凋亡。30μg/mL美沙酮与0.1μM氟达拉滨联用时，48h后可在超过90％细胞中诱导凋亡(见图10)。

因此，这些研究显示在从患者活体内分离出的癌细胞中美沙酮单用或与细胞抑制剂联用是成功的。

实施例6：丁丙诺啡与多柔比星联用在白血病细胞中诱导凋亡

在体外HL-60白血病细胞中成功地使用丁丙诺啡与多柔比星联用诱导凋亡。丁丙诺啡是半合成的阿片样物质药物，也用作镇痛剂。它是部分μ-阿片受体激动剂。

单独用30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL丁丙诺啡或联用0.003μg/mL或0.001μg/mL多柔比星处理人急性髓性白血病HL-60细胞系(5000个细胞/100μl)。144h或168h后通过流式细胞仪对凋亡定量测量。

结果显示144h后20μg/mL丁丙诺啡足以在超过90％细胞中诱导凋亡。加入0.003μg/mL多柔比星可获得同样的结果。10μg/mL丁丙诺啡与0.003μg/mL多柔比星联用并孵育细胞168h后可在接近100％的细胞中诱导凋亡(见图13)。

实施例7：使用芬太尼与多柔比星联用在白血病细胞中诱导凋亡

在体外CEM白血病细胞中成功地使用芬太尼与多柔比星联用诱导凋亡。芬太尼是合成的阿片样物质，常作为镇痛剂用于治疗癌症疼痛。芬太尼是μ型阿片受体激动剂。

单独用30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL芬太尼或添加0.02μg/mL多柔比星处理人T-细胞白血病CEM细胞系(10000个细胞/100μl)。48h和72h后通过流式细胞仪对凋亡定量测量。

结果显示30μg/mL芬太尼与0.02μg/mL多柔比星联用时，72h后芬太尼在超过85％的细胞中成功诱导凋亡(见图14)。

实施例8：使用吗啡在白血病细胞中诱导凋亡

在HL-60白血病细胞中单独用吗啡或联用多柔比星成功地诱导凋亡。吗啡是目前作为镇痛剂用于治疗癌症疼痛的麻醉剂。吗啡是μ型阿片受体激动剂。

在第一项研究中，用30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1、0.03、0.01μg/mL吗啡处理人急性髓性白血病HL-60细胞(5000个细胞/100μl)。120h或144h后通过流式细胞仪对凋亡定量测量。结果显示应用40μg/mL吗啡144h后在40％细胞中诱导凋亡(见图15)。

在第二项研究中，用1、0.5、0.3、0.1、0.03、0.01μg/mL吗啡处理人急性髓性白血病HL-60细胞(5000个细胞/100μl)。96h、120h、144h和168h后通过流式细胞仪对凋亡定量。结果显示应用1μg/mL吗啡168h后在超过50％细胞中诱导凋亡(见图16)。

在第三项研究中，单独用30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL吗啡或添加0.003μg/mL或0.001μg/mL多柔比星处理人急性髓性白血病HL-60细胞(5000个细胞/100μl)。168h后通过流式细胞仪对凋亡定量测量。结果显示应用1μg/mL吗啡与0.001μg/mL多柔比星联用可在50％细胞中诱导凋亡(见图17)。

因此，如这些研究所示，麻醉剂和μ受体激动剂吗啡可用于在白血病细胞中成功地诱导凋亡。

下述在本文中引用的文献通过引用并入本文：

Bergmann JP，Harris D.Radioresistance，chemoresistance and apoptosis resistance.Radiation Oncology 1997；27：47-57.

Carbonari M，Cibati M，Cherchi M，etal.Detection and characterization of apoptotic peeipheral blood lymphocytes in human immunodeficiency virus-infection and cancer chemotherapy by a novel flow immunocytometric method.Blood 1994；83：1268-77.

Friesen C，Glatting G，Koop B，et al.Breaking chemo-and radioresistance with[²¹³Bi]anti-CD45 antibodies in leukaemia cells.Cancer Res 2007；67(5)：1950-8.

Friesen C，Herr I，Krammer PH，Debatin KM.Involvement of the CD95(APO-1/FAS)receptor/ligand system in drug-induced apoptosis in leukaemia cells.Nat Med 1996；2(5)：574-7.

Friesen C，Kiess Y，Debatin KM.A critical role of glutathione in deterninin gapoptosis sensitivity and resistance in leukaemia cells.Cell Death Differ 2004；11(Suppl 1)：S73-85.

Friesen C，Lubatschofski A，Kotzerke J，Buchmann I，Reske SN，Debatin KM.Beta-irradiation used forsystemic radioimmunotherapy induces apoptosis and activates apoptosis pathways in leukaemia cells.Eur J Nucl Med 2003；30：1251-61.

Hatsukari I，Hitosugi N，Matsumoto I，Nagasaka H，Sakagami H.Induction of early apoptosis marker by morphine in human lung and breast carcinoma cell lines.Anticancer Res.2003May-Jun；23(3B)：2413-7.

Hengartner MO.Thebiochemistry of apoptosis.Nature 2000；407(6805)：770-6.

Heusch WL，Maneckjee R.Effects of bombesin on methadone-induced apoptosis in lung cancer cells.Cancer Lett 1999；136：177-85.

Kaufmann SH，Eamshaw WC.Induction of apoptosis by cancer therapy.Experimental Cell Research 2000；256：42-9.

Los M，Herr I，Friesen C，Fulda S，Schulze-Osthoff K，Debatin K-M.Cross-resistance of CD95-and drug-induced apoptosis as a consequence of deficient activation of caspases (ICE/Ced-3 proteases).Blood 1997；90(8)：3118-29.

Milas L，Raju U，Liao Z，Ajani J.Targeting molecular determinants of tumour chemo-radioresistance.Semin Oncol 2005；32：78-81.

Nicoletti I，Migliorati G，Pagliacci MC，Grignani F，Riccardi C.Arapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.J Immunol Meth 1991；139：271-9.

Polakiewicz RD，Schieferl SM，Gingras AC，Sonenberg N，Comb MJ.Mu-Opioid receptor activates signalling pathways implicated in cell survival and translational control.J Biol Chem.1998 Sep 4；273(36)：23534-41.

附图说明

图1：

图1表明阿片样物质美沙酮在白血病细胞中有效地诱导凋亡，但不影响非白血病的健康的PBL细胞。

1A：用所示不同浓度的美沙酮处理CEM和HL-60细胞。24h(白色条)和48h(黑色条)后通过亚二倍体DNA分析测量凋亡细胞百分比。如下计算凋亡细胞百分比：100×(培养基中实验性死亡细胞(％)-自发性死亡细胞(％))/(100％-培养基中自发性死亡细胞(％))。数据是三次重复测定的平均值，其具有低于10％的标准偏差(SD)。在三次独立实验中获得相似的结果。

1B：用所示不同浓度的美沙酮处理CEM和HL-60细胞(2×10⁵个细胞/mL)或未作处理(Co，对照)。0h(白色条)、24h(黑色条)以及48h(阴影条)后，计数1mL中的细胞数。数据是三次重复测定的平均值，其具有低于10％的标准偏差(SD)。在三次独立实验中获得相似的结果。

1C：用所示不同浓度美沙酮处理CEM细胞(黑色条)和PBLs(白色条)。24h和48h后通过亚二倍体DNA分析测量凋亡细胞百分比。用如图1A中的方法计算特定细胞死亡的百分比。数据是三次重复测定的平均值，其具有低于10％的标准偏差(SD)。在三次独立实验中获得相似的结果。

图2：

图2表明阿片样物质美沙酮在CD95-抗性(CEM^CD95R)和多柔比星-抗性(CEM^DoxoR)细胞中诱导凋亡，其凋亡率与亲代敏感性CEM白血病细胞相当。

用所示不同浓度美沙酮处理CEM(黑色条)、CEM^CD95R(白色条)和CEM^DoxoR(阴影条)白血病细胞。24h和48h后通过亚二倍体DNA分析测量凋亡细胞百分比。用如图1A中的方法计算特定细胞死亡的百分比。数据是三次重复测定的平均值，其具有低于10％的标准偏差(SD)。在三次独立实验中获得相似的结果。

图3：

图3表明阿片样物质美沙酮在敏感性的(HL-60，CEM)、以及具有多重抗药性和凋亡抗性的多柔比星-抗性(CEM^DoxoR)和CD95-抗性(CEM^CD95R)白血病细胞中诱导半胱天冬酶依赖性死亡。

3A：和3B：美沙酮在HL-60、CEM、CEM^DoxoR和CEM^CD95R细胞中诱导半胱天冬酶-3活化和PARP切割。用所示不同浓度的美沙酮处理A、HL-60、CEM、B、CEM^DoxoR、CEM^CD95R细胞或未做处理(对照)。24h和48h后进行半胱天冬酶-3和PARP的蛋白质印迹分析。检测到半胱天冬酶-3的～19和17kDa活性片段以及PARP的～85kDa切割产物。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等量蛋白上样。

3C：在CEM和HL-60细胞中用zVAD.fmk抑制半胱天冬酶活化可阻断美沙酮诱导的凋亡。用所示不同浓度的美沙酮在不含有(黑色条，培养基)或含有(白色条，50μMz VAD.fmk)50μMz VAD.fmk的情况下处理CEM和HL-60细胞。48h后通过亚二倍体DNA分析测量凋亡细胞百分比。用如图1A中的方法计算特定细胞死亡的百分比。数据是三次重复测定的平均值，其具有低于10％的标准偏差(SD)。在三次独立实验中获得相似的结果。

图4：

图4表明阿片样物质美沙酮在敏感性的(HL-60，CEM)、以及具有多重抗药性和凋亡抗性的多柔比星-抗性(CEM^DoxoR)和CD95-抗性(CEM^CD95R)白血病细胞中活化线粒体通路。

4A和4B：美沙酮在HL-60、CEM、CEM^DoxoR和CEM^CD95R细胞中诱导半胱天冬酶-9活化，下调XIAP和Bcl-x_L。

用所示不同浓度的美沙酮处理HL-60、CEM(4A)、CEM^DoxoR、CEM^CD95R细胞(4B)或未做处理(对照)。24h和48h后进行半胱天冬酶-9、XIAP和Bcl-x_L的蛋白质印迹分析。检测到半胱天冬酶-9的～37kDa活性片段、XIAP的～58kDa活性片段以及Bcl-x_L的～30kDa活性片段。用抗-β-肌动蛋白抗体控制等量蛋白上样。

图5：

图5表明阿片样物质美沙酮在成胶质细胞瘤细胞中诱导凋亡。

用所述不同浓度的美沙酮处理A172成胶质细胞瘤细胞。120h(白色柱)、144h(黑色柱)和168h(阴影柱)后通过亚二倍体DNA分析测量凋亡细胞百分比。

如下计算特殊的细胞死亡百分比：100×(培养基中实验性死亡细胞(％)-自发性死亡细胞(％))/(100％-培养基中自发性死亡细胞(％))。数据是三次重复测定的平均值，其具有低于10％的标准偏差(SD)。在三次独立实验中获得相似的结果。

图6：

图6表明使用治疗浓度的多柔比星与低浓度美沙酮联用可在成胶质细胞瘤细胞中成功地诱导凋亡。

用治疗浓度的0.1μg/mL多柔比星(多柔比星，白色柱)、低浓度的1μg/mL美沙酮(美沙酮，黑色柱)、0.1μg/mL多柔比星加1μg/mL美沙酮(多柔比星+美沙酮，阴影柱)处理成胶质细胞瘤细胞A172(7000个细胞/cm²)。72h后通过流式细胞仪对凋亡定量测量。为测定凋亡，用含有0.1％枸橼酸钠加0.1％Triton X-100和50μg/mL碘化丙啶的Nicoletti-缓冲液裂解细胞。通过流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)分析被碘化丙啶(PI)染色的核。

图7：

图7表明使用阿片样物质可卡因可在CEM细胞中成功的诱导凋亡。

用1000μg/mL可卡因处理CEM(白色柱)和HL-60(黑色柱)细胞。48h后通过亚二倍体DNA分析测量凋亡细胞百分比。如下计算特殊的细胞死亡百分比：100×(培养基中实验性死亡细胞(％)-自发性死亡细胞(％))/(100％-培养基中自发性死亡细胞(％))。数据是三次重复测定的平均值，其具有低于10％的标准偏差(SD)。在三次独立实验中获得相似的结果。

图8：

图8表明D，L-美沙酮在从患者活体内分离出的前体B-ALL(B-细胞淋巴性白血病)细胞中诱导细胞死亡。

用30、20、15、10μM美沙酮处理B-ALL(B-细胞淋巴性白血病)细胞(50000个细胞/100μl)。48h(黑色条)和72h(白色条)后通过流式细胞仪对凋亡定量测量。

图9：

图9表明D，L-美沙酮联用氟达拉滨在从患者活体内分离出的抗性CLL(慢性淋巴性白血病)细胞中诱导细胞死亡。

单独用30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL美沙酮(白色条)或添加0.1μM氟达拉滨(黑色条)处理CLL(慢性淋巴性白血病)细胞(50000个细胞/200μl)。24h和48h后通过流式细胞仪对细胞凋亡定量测量。

图10：

图10表明D，L-美沙酮联用氟达拉滨在从患者活体内分离出的抗性CLL(慢性淋巴性白血病)细胞中诱导细胞死亡。

单独用30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL美沙酮(白色条)或添加0.1μM氟达拉滨(黑色条)处理CLL(慢性淋巴性白血病)细胞(50000个细胞/200μl)。24h和48h后通过流式细胞仪对细胞凋亡定量测量。

图11：

图11显示在体外多柔比星+美沙酮处理的人B细胞白血病细胞系Tanoue中诱导凋亡。

单独用30、10、5、3、1μg/mL美沙酮(白色条)或添加0.03μg/mL多柔比星(黑色条)处理B-ALL(B-细胞淋巴性白血病)细胞系Tanoue(5000个细胞/100μl)。96h后通过流式细胞仪对细胞凋亡定量测量。

图12：

图12显示在体外多柔比星+美沙酮处理的人B细胞前体白血病细胞系Nalm6中诱导凋亡。

单独用30、10、5、3、1μg/mL美沙酮(白色条)或添加0.01μg/mL多柔比星(黑色条)处理B-ALL(B-细胞淋巴性白血病)细胞系Nalm6(5000个细胞/100μl)。96h、120h、144h、168h后通过流式细胞仪对细胞凋亡定量测量。

图13：

图13显示在体外多柔比星+丁丙诺啡处理的人急性髓性白血病细胞系HL-60中诱导凋亡。

单独用30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL丁丙诺啡(白色条)或添加0.003μg/mL或0.001μg/mL多柔比星(黑色条)处理人急性髓性白血病HL-60细胞系(5000个细胞/100μl)。144h或168h后通过流式细胞仪对细胞凋亡定量测量。

图14：

图14显示在体外多柔比星+芬太尼处理的人T细胞白血病细胞系CEM中诱导凋亡。

单独用30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL芬太尼(白色条)或添加0.02μg/mL多柔比星(黑色条)处理人T细胞白血病CEM细胞系(10000个细胞/100μl)。48h或72h后通过流式细胞仪对细胞凋亡定量测量。

图15：

图15显示在体外用吗啡处理的人急性髓性白血病细胞系HL-60中诱导凋亡。

用30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1、0.03、0.01μg/mL吗啡处理人急性髓性白血病HL-60细胞系(5000个细胞/100μl)。120h(白色条)或144h(黑色条)后通过流式细胞仪对细胞凋亡定量测量。

图16：

图16显示在体外用吗啡处理的人急性髓性白血病细胞系HL-60中诱导凋亡。

用1、0.5、0.3、0.1、0.03、0.01μg/mL吗啡处理人急性髓性白血病HL-60细胞系(5000个细胞/100μl)。96h(白色条)、120h(黑色条)、144h(阴影条)、168h(灰色条)后通过流式细胞仪对细胞凋亡定量测量。

图17：

图17显示在体外用多柔比星+吗啡处理的人急性髓性白血病HL-60中诱导凋亡。

单独用30、10、5、3、1、0.5、0.3、0.1μg/mL吗啡(白色条)或添加0.003μg/mL(黑色条)或0.001μg/mL多柔比星(灰色条)处理人急性髓性白血病HL-60细胞系(5000个细胞/100μl)。168h后通过流式细胞仪对细胞凋亡定量测量。