使用蛋白酶活化的受体鉴别调节蛋白质-蛋白质相互作用的分子

发明领域

本发明涉及用于确定所研究分子间相互作用的材料和方法。更具体地说，本发明涉及确定某特定物质例如一种“受试化合物”是否能调节所研究的两个或两个以上特定蛋白质之间的相互作用。确定蛋白质之间相互作用涉及监测报道分子的活化，该报道分子可存在于细胞中、溶液中，或存在于含有一种或多种所研究反应物的人工包装或单元中，其中报导基的因激活与否取决于调节作用是否发生。这种确定一般是利用转化或转染的细胞而实现的。这些转化或转染细胞以及用于转化或转染细胞的试剂，也是本发明的一个方面。此外，还可采用一种无细胞体系，或一种利用携带一种或多种所研究试剂的人工包装或单元如病毒、病毒样颗粒、脂质体等的体系。

发明背景和相关技术

通过受体配体的鉴别而对蛋白质-蛋白质相互作用进行研究是一个令人很感兴趣的领域。即使某一特定受体的一个或多个配体是已知的，人们仍希望能鉴别出更有效或更具选择性的配体。本文将把G-蛋白偶联受体GPCR，又称为七跨膜受体(7TMR)，作为一类可以这种方式表征的蛋白质的非排它性实例而进行讨论。但是，任何能够相互作用的蛋白质，如一个代谢途径或一个级联的成员，均适用于本分析方法。

GPCR是人类已知的最大一类细胞表面受体，因此被认为是本发明的主要应用对象。调节GPCR信号的配体包括激素、神经递质、肽、糖蛋白、脂质、核苷酸和离子。GPCR也已知为感觉受体，例如光觉、嗅觉、信息素和味觉的受体。由于GPCR具有如此众多和多样化的作用，它们是许多积极研究的对象，例如，化学战防御和生物战防御应用方面的研究，以及用于治疗各种病症的药物方面的研究。业已成功地发现许多药物。例如，Howard等人估计，50％以上的市售药物对这些受体起作用(Howard，et al.，Trends Pharmacol.Sci.，22：132140(2001))。

本文所用的“GPCR”系指GPCR受体超家族的任何成员。这一超家族的特征是具有一个七跨膜域(7TM)结构。这些受体的实例包括但不限于，A类或“视紫红质样”受体；B类或“促胰液素样”受体；C类或“代谢谷氨酸样”受体；Frizzled和Smoothened相关的受体；粘着受体家族或EGF-7TM/LNB-7TM受体；脂连蛋白受体和相关的受体；以及化学感觉受体，包括嗅觉、味觉、犁鼻和信息素受体。例如，人类的GPCR超家族包括但不限于下列文献所描述的受体分子：Vassilatis，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：4903 4908(2003)；Takeda，et al.，FEBS Letters，520：97 101(2002)；Fredricksson，et al.，Mol.Pharmacol.，63：1256 1272(2003)；Glusman，et al.，Genome Res.，11：685 702(2001)；以及Zozulya，et al.，Genome Biol.，2：0018.1 0018.12(2001)。

简言之，GPCR功能的一般作用机制如下：1)GPCR与配体结合，2)引起构象变化，从而3)激发导致细胞生理学变化的细胞事件级联。GPCR通过调节一批细胞内蛋白质，如异三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)和β抑制蛋白(βarrestins)的活性而转导信号。在G蛋白的情况下，配体-受体复合物激发鸟嘌呤核苷酸的交换，并使G蛋白的异质三聚体解离为α和βγ亚基。在其它一些情况下，β抑制蛋白可取代G蛋白、抵制G蛋白信号转导、协同G蛋白信号转导等。

业已观察到GTP结合的α亚基和βγ异二聚体均可调节各种细胞效应蛋白，包括腺苷酰环化酶和磷脂酶C(PLC)。在常规的基于细胞的GPCR分析中，受体活性是通过测定G蛋白调节的效应物通道的输出，如由腺苷酰环化酶产生的cAMP的积聚或由PLC活性刺激而导致的分子内钙的释放来监测的。

由于种种原因，对于某些分析对象，很难研发出常规的基于G蛋白的信号转导分析方法。首先，例如，不同的GPCR与不同的G蛋白调节的信号转导途径偶联。常规的基于G蛋白的分析方法依赖于对目标受体的G蛋白特异性的了解，或者此分析方法要求构建细胞体系，迫使目标受体与选定的G蛋白效应物途径偶联。其次，由于GPCR超家族是如此之大，所有细胞都表达许多内源的GPCR(以及其它受体和信号传递因子)。因此，除了目标GPCR之外，测得的效应物途径也能被内源分子调节。这一现象可能导致假阳性或假阴性结果，例如在试图鉴别目标GPCR的选择性调节剂时即是如此。

G蛋白活性的调节并不是配体/GPCR结合的唯一结果。参阅如Luttrell，et al.，J.Cell Sci.，115：455465(2002)，以及Ferguson，Pharmacol.Rev.，53：124(2001)。这些文献评述了一些可能导致GPCR信号衰减或终止的活动。这些终止过程对于防止细胞过度刺激以及在细胞外信号和相应细胞内途径之间强制建立一种暂时的连接是很有用的。

一般而言，激动剂与GPCR的结合将导致该受体分子C端的丝氨酸和苏氨酸残基在GPCR激酶的作用下发生磷酸化。络合了激动剂的C端磷酸化的GPCR的激动剂然后与抑制蛋白家族成员如α抑制蛋白、β抑制蛋白或β抑制蛋白2相互作用，这些抑制蛋白下调或抑制受体信号转导。这一结合能抑制受体与G蛋白的偶联，从而使受体发生内化，然后降解和/或再循环。例如，抑制蛋白的结合，如β抑制蛋白2与磷酸化GPCR的结合，可以不同的方式降低目标GPCR的活性。抑制蛋白抑制其目标活化的最简单机制就是与GPCR的胞内域结合，从而阻断异三聚体G蛋白的结合位点并防止细胞外信号激活信号途径(脱敏作用)。抑制蛋白使用的另一种调节机制是使受体与膜内化机构的元件相连(如网格蛋白介导的内吞作用)，这将引起受体在被膜小泡中内化而与核内体融合。一旦到达核内体，该受体即可被(例如溶酶体)降解，或可再循环至质膜，在此再次被激活。

因此，可以说，配体与GPCR的结合“调节”了GPCR和抑制蛋白之间的相互作用，因为配体与GPCR的结合导致了抑制蛋白与GPCR的结合，籍此调节其活性。在本文中，当述及相互作用或结合的时候，“调节”或其任何其它形式只是指本发明的两个蛋白质之间相互作用方式的某些变化，例如，在一种受试化合物或配体存在与不存在的情况下，比较这两个蛋白质之间如何相互作用。因此，调节仅包括两个分子的结合。例如，受试化合物的存在可能以某种可检测的方式或形式加强或增强、减弱、阻断、抑制、改向、降低或改变两个蛋白质之间的相互作用，或者受试化合物可促进相互作用的可能性等。

在某些情况下，7TMR信号转导的发生可独立于G蛋白。因此，当配体与7TMR结合时，是β抑制蛋白而不是G蛋白被募集参与或引发细胞中的信号级联放大。参阅如Violin & Lefkowitz，Trends Pharm Sciences28(8)416-422，2007和DeFea，Br J Pharm 1-12，doi：10.1038/si.bjp.0707508，2007，作者总结了两个始于激活的7TMR的独立又相互依赖的信号途径，这些信号途径可同时涉及G蛋白和β抑制蛋白；或者也可能仅涉及G蛋白或仅涉及β抑制蛋白。

因此，例如7TMR的某些已知拮抗剂能激活β抑制蛋白的信号传递。普萘洛尔(Propranolol)是一种β₂肾上腺素能受体(ADRB2)和G蛋白信号传递的已知拮抗剂；如实施本发明时所观察到，它是一种β抑制蛋白信号传递的部分激动剂，能激活β抑制蛋白启动的途径。

响应细胞外刺激的细胞信号传递事件通常都是由蛋白质-蛋白质相互作用介导的。因此，蛋白质-蛋白质相互作用对细胞生理学家来说具有非常重要的意义。一种监测这些相互作用的工具涉及使用一种分裂的或序列改变的报道分子活化蛋白质，如烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶。当与相互作用的蛋白质共表达为一种融合构建体时，蛋白酶的分裂部分就重新获得活性。Wehr，et al.，“Monitoring Regulated Protein-protein Interactions UsingSplit TEV”，Nature Methods，3：985-993(2006)。这一特性已经与转录偶联的报道分子体系结合使用。

这一理解导致了测定GPCR的激活和抑制的其它方法。其中一个方法涉及在带有转录机构的完整细胞中监测蛋白质与抑制蛋白之间的相互作用。这一方法的优点是不需要拥有G蛋白途径方面的知识。参阅Lee等人的美国第7,049,076号专利：“测定蛋白质-蛋白质相互作用的方法”。Lee等人教导了一种需要转录偶联报道分子体系的报道分子体系。按照Lee等人的观点，当两个蛋白质相互作用时，一个肽转录因子将从第一蛋白上切割下来。第二蛋白是激活报道分子的转录因子。该转录因子转移到细胞核而实现一种可检测的报道分子的转录，从而实现报道分子的功能。由于该方法依赖于转录，故不能用于例如血小板、人工包装或单元，如脂质体、蜗形细菌、病毒样颗粒和病毒颗粒。

Oakley，et al.，Assay Drug Dev.Technol.，1：2130(2002)以及Barak等人的美国第5,891,646和6,110,693号专利“Methods Of Assaying ReceptorActivity and Constructs Useful in Such Methods”描述了一些分析方法，其中测量了细胞质中萤光标记的抑制蛋白分子向细胞表面被激活受体的重新分布。这些方法依赖于细胞的高分辨率成像来测量抑制蛋白的重新定位和报道分子的活化。本领域技术人员认识到，这是一个繁杂耗时的程序，可由于所使用的互补性酶片段的亲和力和相互作用而导致失败，这些相互作用可能与所期待的调节剂诱导的相互作用形成竞争。因此，该方法的缺点是酶将独立于配体结合而自动重新缔合，从而导致假阳性结果。希望能有一种更简单可靠、假阳性结果较少出现并较易适应高通量筛选的分析方法。

有关这些内容，已经颁发了各种其它美国专利，并提交了多项专利申请。例如，授予Bohn等人的美国第6,528,271号专利“Inhibition Ofβ-Arrestin Mediated Effects Prolongs and Potentiates OpioidReceptor-Mediated Analgesia”介绍了一些筛选镇痛药物的试验方法，其中测量了对β抑制蛋白结合的抑制作用。已公布的美国专利申请，如2004/0002119、2003/0157553和2003/0143626，以及美国第6,884,870号专利描述了涉及GPCR的不同形式的试验方法。美国第7,128,915号专利介绍了类似的GPCR技术。上面提到的美国第7,049,076号专利主要介绍GPCR活性或筛选方法，显示了GPCR研究的重要性。

因此，本发明的一个特点，即提供简单的分析方法用于监测和/或确定特定的蛋白质-蛋白质相互作用的调节，例如受体介导的生理作用如GPCR介导的细胞响应，能够令人满意地处理本领域内的需求，其中所述的蛋白质包括但不限于膜结合蛋白，一般而言包括受体，而GPCR则是一个重要的实例。

发明概要

本发明提供了一些方法，以确定受试化合物是否能调节所研究的特定的蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质-蛋白质相互作用是生物学中常见的机制，细胞籍此与其周围环境相互作用。这是一种细胞外事件，例如一个配体与一个受体结合，能够产生一种伴随配体内化或不伴随内化的内部响应。内化可能涉及两个或两个以上的其一部分在膜上或膜外的蛋白质。因此，二聚体、异二聚体或多聚体的形成可能产生一种内部响应。细胞内蛋白质-蛋白质相互作用也可能出现在信号级联放大中。本发明的一般原理适用于任何类型的蛋白质-蛋白质相互作用。例如，相互作用可以发生于两个膜结合蛋白之间、一个膜结合蛋白和一个胞质蛋白质之间、或胞质蛋白质之间等。一个实施方案描述了一个胞质蛋白质转移至另一个细胞器如细胞核，其中报道分子被激活从而产生信号。最好是采用基于细胞的分析方法，但也可使用无细胞的体系，如使用切割物、膜级分、核级分等。本发明还包括含有一种或多种所研究试剂的人工包装或单元，如脂质体、病毒样颗粒等等。本发明改善了以上讨论的Lee等人的方法，因为不需要转录。因此，能更快地获得结果，且能从基于细胞或无细胞的体系中获得结果。以下是关于特别优选的一些实施方案的总说明。这些实施方案仅出于示范的目的，并非意在限制本文所述及权利要求书所定义的本发明之范围。

本发明提供的一个特征包括让至少一种受试化合物与表达所研究蛋白质的细胞表面接触。可对受试化合物调节所研究蛋白质如某种受体蛋白质活性的能力进行评估。所研究蛋白质在细胞中的表达可通过用下列物质转化或转染某种选定的细胞例如昆虫或哺乳动物细胞系而引起：(1)含有下列组分的一个或多个核酸分子：(a)编码第一目的蛋白的多核苷酸，和(b)编码报道分子活化蛋白质的多核苷酸，该报道分子活化蛋白质具有对蛋白酶或蛋白酶的活性部分或可激活部分敏感的切割位点，以及(2)含有下列组分的一个或多个核酸分子：(a)编码第二蛋白的多核苷酸，当一种调节剂例如一种阳性受试化合物存在时，该第二蛋白与第一目的蛋白之间的相互作用发生变化，以及(b)编码对核酸(1)编码的切割位点具有特异性的蛋白酶或蛋白酶的活性部分或可激活部分的多核苷酸。对于调节(所研究的两个蛋白质之间)相互作用的分子如阳性受试化合物的评估或分析，可通过在必要时在表达所研究的第一蛋白和第二蛋白的细胞中以及本文所述的报道分子体系中加入报道分子活化蛋白质底物来进行。

因此，本发明的一种方法可以是采用一种可重新排序的酶作为所研究的蛋白质-蛋白质相互作用的读出。作为报道分子或报道分子活化蛋白质所用的可重新排序的激活蛋白质，例如酶，可处于一种非活性状态，可通过切割来激活，例如可通过与所研究的第二蛋白相关的酶活性来激活。另一个选项包括一种非活性的报道分子活化蛋白质，当所研究的第一蛋白和第二蛋白相互作用时，该蛋白质就被激活。如此，就可以筛选出调节所研究的第一和第二蛋白之间相互作用的化合物。这一体系的一个成就是能够高通量地鉴别能调节选定的蛋白质-蛋白质相互作用的分子。

能够(单独或与一个或多个相关分子一起)产生“肽A”这一读出的酶以一种活性可改变的形式存在。这种活性变化可使酶活化或失活。例如，可在酶中建立一个切割位点使它在切割时失活，例如，可用与所研究的第二蛋白偶联的第二种酶来使它切割。

备选地，切割也可导致激活。可用一个或多个核酸将所选择的酶构建到所希望的宿主细胞中。例如，一种载体可包含一种多核苷酸，该多核苷酸编码选定的分子作为非活性酶，其可通过在切割割位点切割非活性酶而被活化。该切割位点可以是天然出现的，但更优选的则是设法将该切割位点加入多核苷酸中，使得它作为一种重排的酶而得以表达。例如，一个本不属于该细胞蛋白质的切割位点和/或一个本不属于该宿主细胞的蛋白质可以被转染到宿主细胞中。备选实施方案包括通过切割而使酶活化，可以采取除去一个阻断肽的方式，或可以让两个多肽改变构型使它们重新排列而激活酶的活性。

因此，一个实施方案的特点是一种活性的多肽，例如一种酶。本文所述的“酶”可通过切割而失活。从特异性方面考虑，也许希望在酶中构建一个能被本不属于宿主细胞的蛋白酶识别的切割位点。该切割位点可以一种连接成分把“酶”的两个部分连在一起接头的形式引入，该接头可以是一个本来就属于“酶”的切割位点，例如，带有切割位点的酶可能来自于另一种细胞类型或另一种物种，且在宿主细胞中不存在，或者切割位点也可通过一个或多个氨基酸的保守取代而产生。保守取代为本领域已知的技术。例如，电荷、大小、芳香性或其它特性都可以被保留以维持活性。此活性不必与序列未经重排的“酶”完全相同，但是必须在切割位点通过切割而加以改变。可在一个酶的两个部分之间插入一个切割位点。这一位点的切割可能干扰酶，从而导致失活或可能引起催化活性，例如，通过除去肽上阻断结合位点或催化位点的部分或让重排的酶的两个部分以一种能恢复活性的方式相互作用。

因此，在切割位点的切割可能灭活或激活产生读出的蛋白质。切割可在一种受试化合物存在的情况下实现，例如，当包含一个编码所研究的第二蛋白的多核苷酸的核酸分子的表达产物与所研究的第一蛋白发生作用时实现，从而引发蛋白酶的活性，该蛋白酶能识别和切割重排的报道分子活化蛋白质中对蛋白酶敏感的切割序列。

所研究的第二蛋白与所研究的第一蛋白在第三分子存在或不存在的情况下发生相互作用。此第三分子因此就被认为是调节了多肽A和B之间的蛋白质-蛋白质相互作用。于是，由第三分子例如一种受试化合物调节的蛋白质-蛋白质或肽-肽之间的相互作用(出于讨论的目的，蛋白质和肽可互换使用)可被本发明的体系有效地报导。调节蛋白质-蛋白质相互作用的分子(标记为1和2、第一和第二、A和B等的多肽之间，本文中这些短语和术语可互换使用)可由活性的报道分子激活分子来测量，或通过将活性的报道分子活化蛋白质的底物加入表达含有所研究蛋白质的体系的细胞来测量。

蛋白质A和B的选择是一种设计上的选择，因为已知或怀疑可能相互关联、相互作用的分子对都可以使用。如本文所讨论，一个适当的分子对是带有G蛋白或β抑制蛋白的7TMR。另一个实例是一种卷曲的受体和一种散乱的结合蛋白，等等。还有一个实例则是一种在细胞相互作用期间以及细胞相互作用之后起作用的蛋白质。因此，蛋白质A和B在细胞1中。当细胞1被细胞2接触或与细胞2接触时，这一相互作用在细胞1中触发了一种由细胞1引起的活动，该活动由蛋白质A和B的相互关联、相互作用等现象所揭示，并进一步为本发明的试剂所揭示，产生了一种可察觉和可检测的信号。

另一个实例是使蛋白质A表达在细胞1上，使蛋白质B表达在细胞2上。这一点可通过把G蛋白或β抑制蛋白构建成具有一个胞外域，或把报道分子活化蛋白构建成具有一个胞外域的方式来实现，该胞外域在细胞1被一种配体或候选药物活化后受到细胞1的作用。或者，两个细胞上的内源分子也可自发地缔合。在另一个实施方案中，蛋白酶和报道分子活化分子被构建成作为胞外域在细胞或单元的表面上表达。

在另一个实施方案中，相互关联、装配的蛋白质形成一种包含蛋白质A和B的复合结构。本分析方法可用于鉴别那些促进或阻止关联或装配的分子。一个实例则是病毒壳体的形成、病毒样颗粒装配或核糖体的形成。

在G蛋白偶联受体(GPCR又称为7TMR，这些术语在本文中可互换使用)的常见机制中，GPCR的激动剂活化导致一个细胞内分子如G蛋白或β抑制蛋白的募集，该分子涉及一种信号途径，如启动、终止、增强、抵制等等。因此，G蛋白偶联受体激酶可作用于被激活的受体，导致受体的磷酸化。磷酸化受体促进β抑制蛋白与受体的结合。对某些GPCR而言，这一机制是相当保守的。在其它一些情况下，活化的受体却与β抑制蛋白相互作用。

为了评估调节蛋白质-蛋白质相互作用如GPCR活化的分子，设计了一种体系来测定蛋白质-蛋白质相互作用并在一种GPCR-重排的报道分子体系中进行了测试。例如，报道分子体系可以是一种萤光素酶/萤光素分析体系。一般而言，报道分子是一种外源分子，即对于宿主细胞或信号机制而言是外来的。这就最大限度地降低了报道分子被宿主细胞活化或在宿主细胞中自发活化的程度，从而也最大限度地降低了信号产生，并因此最大限度地减少了假阳性结果。报道分子活化分子可以是一个带有域结构的分子，或是一个序列可重排以产生非活性的报道分子活化蛋白质的分子，该蛋白质在操作时有可能具有报道分子的活性。因此，本申请考虑到使用一种潜在的报道分子活化分子。重排的报道分子活化分子最大限度地降低了自发报道分子活化分子的活性，并因此最大限度地减少了假阳性结果。例如，在酶片段互补分析中，酶片段的亲和力可超越所筛选的目标分子、配体或分子的反应动力学，使得酶片段自发重新缔合而成为功能分子，从而导致更高的背景值和/或假阳性。所研究的重排的报道分子活化蛋白质可构建成带有这样一个位点，该位点在受到作用时可使重排的报道分子活化分子形成功能分子。此位点可以是蛋白酶位点。此蛋白酶位点最好是一个在宿主细胞中很少存在或不存在的独特位点，或所研究方法的一个或多个组分所存在的单元。这就提供了另一种手段来避免完整的报道分子活化分子的自发重新缔合，从而最大限度地减少假阳性结果。只有当接合的配体最终将蛋白酶引导到非活性的报道分子活化蛋白的附近并使之切割，才能获得特定的信号，也只有在这个时候，才能实现一种活性信号活化或产生实体。本领域内已知有许多蛋白酶可用于本发明的实践。例如，病毒来源的蛋白酶可能很有用，因为它们对于完整的宿主细胞来说通常都是外源的。有一项应用包含重排的报道分子活化蛋白质基因，其中萤火虫萤光素酶的编码序列被标记在GPCR序列的C端终点上，β抑制蛋白2(Ar2或Arr2)则与烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶基因连接。在另一个实施方案中，重排的萤光素酶被标记在β抑制蛋白(Ar或Arr)上，TEV基因则被连接到受β抑制蛋白作用或与β抑制蛋白有关的信号途径下游的一个蛋白上，或被连接到一个受体，如疑为独立于G蛋白起作用的7TMR上。当设计用来表达上述两者的质粒在细胞中表达时，调节GPCR-抑制蛋白-2之间相互作用的化合物将Arr2-蛋白酶融合蛋白募集到重排的萤光素酶中的蛋白酶识别位点，然后TEV蛋白酶切割该重排的萤光素酶。受试化合物的效用可通过报道分子活化蛋白重构导致的酶活性变化来测量，在这种情况下，通过作用于一种适当的底物如萤光素，萤光素酶成为活性并能产生可检测的信号。

本发明并不仅限于萤光素酶，甚至不仅限于酶。切割引起的活化是一种已知的现象，如酶原。也可使用非酶报道分子体系。例如，可使用绿色荧光蛋白(GFP)。一种重排的GFP，例如其组成部分重排的GFP，可用作报道分子活化蛋白和报道分子。重排的多肽所包含的蛋白酶如TEV或其它带有识别位点的蛋白酶的作用可切割重排的报道分子活化蛋白/报道分子，从而允许产生信号的重排。GFP的优势在于其本身就是一种可检测的报道分子信号分子。或者，可在报道分子中引入一些不会明显干扰信号的切割位点。蛋白质-蛋白质相互作用所导致的切割会使报道分子信号减弱。可在报道分子构建体中引入多个切割位点。

可用蛋白质三级结构来指导熟练技术人员，将切割位点放在最适合的位置。例如，当多肽的两个部分紧密接触时，以扰动序列的方式分开这两个部分预期将会降低或消除活性。当切割时，预期此两部分会相互作用，从而恢复活性。

所研究的第一蛋白可以是一种跨膜受体之类的膜结合蛋白，例如GPCR。跨膜受体的实例包括β-肾上腺素能受体(ADRB2)、精氨酸加压素受体2(AVPR2或V2)、血清素受体1a(HTR1A)、m2蕈毒碱乙酰胆碱受体(CHRM2)、趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)、多巴胺D2受体(DRD2)、κ-阿片样物质受体(OPRK)，或α1a-肾上腺素能受体(ADRA1A)等等。膜结合受体在本领域内众所周知。应当理解，在所有情况下，本发明并不限于作为本发明实例而描述的特定实施方案。例如，作为一种酪氨酸激酶的胰岛素生长因子-1受体(IGF-1R)之类的分子，以及通常不是膜结合的蛋白，如雌激素受体1(ESR1)和雌激素受体2(ESR2)，均可用于本发明。与蛋白质B缔合的蛋白酶或蛋白酶之一部分可以是烟草蚀刻病毒核包涵物A(TEV)蛋白酶。TEV有一个七残基识别位点，因而比具有较小的统计学上更常见的识别位点的蛋白酶更具特异性。其它蛋白酶也适用于本发明。例如，具有5残基识别序列的肠激酶和Xa因子蛋白酶，具有6残基识别序列的凝血酶和PureAct^TM或CleanCut^TM，以及具有7残基识别序列的PreScission^TM也是可用于本发明的蛋白酶。本发明并不限于使用任何特定的蛋白酶。但是，该蛋白酶必须在某一位点切割，从而产生或改变来自受体的信号。

激活报道分子的蛋白质可为任何能作用于底物而产生可检测信号的酶。例如，酶可直接或间接地增加或减少荧光或化学发光，或可导致颜色变化。报道分子底物可以是一种生物物质，如蛋白质，或可以是一种化学物质，其反应被报道分子酶所催化。所研究的第二蛋白可以是一种抑制性蛋白质，如抑制蛋白。抑制蛋白通常响应配体/受体相互作用而与GPCR相互作用以调节活性。细胞可以是一种真核生物细胞或一种原核生物细胞。报道分子可以是一种外源成分，如β半乳糖苷酶或萤光素酶。为了简化起见，将“报道分子酶”用作报道分子活化分子、报道分子活化体、报道分子调节分子、报道分子调节蛋白质或报道分子活化蛋白质的等同物，并作为一种能改变报道分子输出的分子之简称。例如，报道分子酶可以酶学方式造成报道分子信号的变化，也可以酶学方式或非酶学方式导致信号的变化，如荧光信号的变化。本领域熟练技术人员了解能调节或激活报道分子信号的各种报道分子体系和蛋白质。

可以修饰编码第一蛋白的核苷酸序列以增加与第二蛋白的相互作用。此类修饰包括但不限于将第一蛋白C端区域的全部或部分核苷酸序列用编码一个比原序列对第二蛋白具有更高亲和力的氨基酸序列的核苷酸序列来取代。例如，该C端区域可被编码AVPR2、AGTRLI、F2RL1、CXCR2/IL-8b或CCR4的C端区域的核苷酸序列所取代。此类修饰在本领域内是众所周知的，是本发明一个任选的特征。

本发明的方法可包括让多种受试化合物与多种细胞样品或单元接触。每种样品都可与一种或多种受试化合物接触。在另一实施方案中，一个细胞或单元带有两个不同的分子，而这些分子的胞外域又带有不同的报道分子活化分子，两者均与β抑制蛋白相互作用。筛选过程可通过测定报道分子的活性来完成，例如通过监测样品中的酶活性来确定是否有任何化合物或化合物混合物调节特定的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法可包括让每个样品与单一的受试化合物接触，让每个测试样品与受试化合物的混合物接触，或组合这两种方式。可利用本发明来测试或筛选能抑制化合物与蛋白质A之间的结合的化合物。例如，一项分析可包括蛋白质A的一种已知的配体，也可鉴别和/或鉴定调节配体与蛋白质之间的结合的化合物，如同竞争分析法。对照样品可用于每次分析，或与样品一起进行平行分析。

在某些实施方案中，本发明提供了一种方法来确定一种受试化合物是否能调节所研究的许多蛋白质之间的一种或多种相互作用。这些实施方案一般具有以下特征：让一种受试化合物与用下列物质转化或转染的一些细胞样品接触：(a)含有下列组分的第一核酸分子：(i)编码第一蛋白的多核苷酸和编码蛋白酶切割位点的多核苷酸序列，(ii)编码在细胞中激活报道分子的蛋白质的多核苷酸；以及(b)含有下列组分的第二核酸分子：(i)编码第二蛋白的多核苷酸，该第二蛋白在所研究的受试化合物存在的情况下与第一蛋白的相互作用有待测量，(ii)编码蛋白酶或编码对切割位点的切割具有特异性的多肽的多核苷酸。在多个样品中，第一蛋白可与其它第一蛋白不同。然后，该方法包括在多个样品中的一个或多个样品中确定报道分子的活性，从而确定对所研究的蛋白质之间一种或多种相互作用的调节。

在每个样品中，第二蛋白可以是不同的，也可以是相同的。所有样品可合并在一个共同的容器中，每个样品可包含不同的第一和第二蛋白对。或者，每个样品也可在不同的容器中测试。某一给定样品中的报道分子可与其它样品中的报道分子不同。受试化合物的混合物可包含一种生物样品或存在于一种生物样品中，如脑脊液、尿液、血液、血清、脓、腹水、滑液、组织提取物、植物或草药提取物，或渗出液。

在其它实施方案中，本发明提供了一种用以下物质转化或转染的重组细胞：(a)包括下列组分的核酸分子：(i)编码第一蛋白的多核苷酸，(ii)编码蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽的切割位点的多核苷酸，以及(iii)编码激活细胞中报道分子的蛋白质的多核苷酸；以及(b)含有下列组分的核酸分子：(i)编码第二蛋白的多核苷酸，该第二蛋白在所研究的受试化合物存在的情况下与第一蛋白的相互作用有待测量，以及(ii)编码蛋白酶、蛋白酶的一部分或多肽的多核苷酸，所述蛋白酶、蛋白酶的一部分或多肽具有对对所述切割位点特异的蛋白酶活性。

该核酸分子之一或两者都可稳定地整合进宿主受试细胞的基因组。该细胞还可以是用报道分子转化或转染的。第一蛋白可以是一种膜结合蛋白，如跨膜受体，例如GPCR。代表性的跨膜受体包括ADRB2、AVPR2、HTR1A、CHRM2、CCR5、DRD2、OPRK或ADRA1A。

如上所述，蛋白酶或蛋白酶之一部分不限于烟草蚀刻病毒核包涵物蛋白质A酶，而可以是激活报道分子活化蛋白质的任何蛋白质，且可以是任何能作用于底物而产生一种可用的或可检测的信号的酶。第二蛋白可以是一种抑制性蛋白质。细胞可以是真核生物细胞或原核生物细胞，一般而言，用于筛选药物的目的时，优选是真核生物细胞。以与药物的最终目标类似的方式糖基化的细胞则尤为优选。该细胞可以是培养的或改造的以提供所需的糖基化特征。使用与建议的最终目标之糖基化性质不匹配的原核生物细胞对于筛选和鉴定可以是有用的。

报道分子可以是外源的，例如β半乳糖苷酶、GFP或萤光素酶。可以修饰编码第一蛋白的核苷酸序列以增加与第二蛋白的相互作用，例如通过用编码一个比原序列对第二蛋白具有更高亲和力的氨基酸序列的核苷酸序列来取代第一蛋白C端区域的全部或部分核苷酸序列。该C端区域可被一个编码例如AVPR2、AGTRLI、F2RL1、CXCR2/IL-8b或CCR4的C端区域的核苷酸序列所取代。

作为一个实施方案，本发明包括提供一种分离的核酸分子，包括(i)编码蛋白质的多核苷酸，(ii)编码蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽的切割位点的多核苷酸，以及(iii)编码激活细胞或其它分析体系中报道分子的蛋白质的多核苷酸。该蛋白质可以是一种跨膜受体之类的膜结合蛋白，例如GPCR。代表性的跨膜受体包括ADRB2、AVPR2、HTR1A、CHRM2、CCR5、DRD2、OPRK或ADRA1A。蛋白酶或蛋白酶之一部分可以是烟草蚀刻病毒核包涵物蛋白质A酶。如上所述，激活报道分子的蛋白质可为任何与一种底物反应而产生信号的蛋白质，不需要限制于本文所讨论的TEV实例。本发明的这一实例或其它实例不应被视为是将本发明限制于特定的实施方案。

在某些实施方案中，本发明的特点是一种包含分离的核酸分子的表达载体，该核酸分子包含如下组分：(i)编码蛋白质的多核苷酸，(ii)编码蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽的切割位点的多核苷酸，以及(iii)编码能激活细胞中报道分子的蛋白质并进一步与启动子有效连接的多核苷酸。

在某些实施方案中，本发明的特点是分离的核酸分子，其包含：(i)编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质在受试化合物存在的情况下与另一个蛋白质的相互作用有待测量，以及(ii)编码对所述切割位点具有特异性的蛋白酶、蛋白酶的一部分或多肽的多核苷酸。该蛋白质或其它蛋白质可以是一种抑制性蛋白质，如抑制蛋白。

本发明某些实施方案的特点还在于含分离的核酸分子的表达载体，该核酸分子包含以下组分：(i)编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质在受试化合物存在的情况下与另一个蛋白质的相互作用有待测量，以及(ii)编码对所述切割位点具有特异性的蛋白酶、蛋白酶的一部分的多核苷酸，且所述核酸可进一步与启动子有效连接。

另一个实施方案的特点是一种由分离的核酸分子的表达所产生的融合蛋白，该核酸分子包含以下组分：(i)编码蛋白质的多核苷酸，(ii)编码蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽的切割位点的多核苷酸，以及(iii)编码一个能激活细胞中报道分子的蛋白质并进一步与启动子有效连接的多核苷酸；或一个包含以下组分的分离的核酸分子：(i)编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质在所研究的受试化合物存在的情况下与另一个蛋白质的相互作用有待测量，以及(ii)编码对所述切割位点具有特异性的蛋白酶、蛋白酶的一部分的多核苷酸。

在其他实施方案中，本发明的描述了试剂盒，用于测定一种受试化合物是否能调节所研究的特定蛋白质-蛋白质相互作用。该试剂盒包括以下一个或几个组成部分，且各部分相互分离：(a)包含编码第一蛋白的多核苷酸的核酸分子，(i)编码蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽的切割位点的多核苷酸，(ii)编码能激活细胞中报道分子的蛋白质的多核苷酸，以及(b)一个包含以下组分的核酸分子：(i)编码第二蛋白的多核苷酸，该第二蛋白在受试化合物存在的情况下与第一蛋白的相互作用有待测量，(ii)编码对所述切割位点具有特异性的蛋白酶或蛋白酶的一部分的多核苷酸；以及任选地，还可包括使(a)和(b)保持分离的手段。该试剂盒还可包括使用说明。或者，该试剂盒还可包括改造的细胞以表达所研究的两个融合蛋白的任意一个或两者。

第一蛋白可以是一种膜结合蛋白，如跨膜受体。跨膜受体的一个具体类型是GPCR。一种具体的跨膜蛋白质是GPCR。代表性的跨膜受体包括ADRB2、AVPR2、HTR1A、CHRM2、CCR5、DRD2、OPRK或ADRA1A。蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽可以是烟草蚀刻病毒核包涵物蛋白质A酶。激活所述报道分子的蛋白质可以是例如任何作用于一个可检测的、对切割活化有反应的报道分子活化分子的蛋白酶。该报道分子可为任何由切割产物产生可检测信号的分子。第二蛋白可以是一种抑制性蛋白质，如抑制蛋白。该试剂盒还可进一步包括单独的编码报道分子活化基因的分离核酸分子。报道分子激活子可以例如是一种β半乳糖苷酶或萤光素酶。可以修饰编码所述第一蛋白的核苷酸序列以增加其与第二蛋白的相互作用，例如通过用编码一个比原序列对第二蛋白具有更高亲和力的氨基酸序列的核苷酸序列来取代所述第一蛋白C端区域的全部或部分核苷酸序列。所述C端区域的核苷酸序列可被编码例如AVPR2、AGTRLI、F2RL1、CXCR2/IL-8B以及CCR4的C端区域的核苷酸序列所取代。

应该考虑到，相对于本文所述的任何其它方法或组合物，本文所述的任何方法或组合物都是可实施的。在权利要求书和/或本说明书中，冠词“一个”当与“包含”一词联用时，可表示“一个”的意思，但也可以表示“一个或更多”、“至少一个”以及“一个或一个以上”的意思。当以略微不同的措词描述对应的组分时，它们并不意味着是区别各项实施方案，整体而言，各种不同的措词是广义地描述对应的成分。

当与下面的说明和附图一起考虑时，将能够更好地理解本发明的这些和其它实施方案。应当理解，下面的说明虽然指出了本发明的各种实施方案及其许多具体细节，但是这些内容仅仅是为了示范之目的，而不是限制本发明。在不偏离本发明的精神实质前提下，可在本发明的范围内进行许多替换、修改、添加和/或重排，而且本发明包括所有这样的替换、修改、添加和/或重排。

附图简要说明

所附的附图构成本发明说明书的一部分，被包括在此以进一步显示本发明某些方面的特点。在阅读本文提供的关于特定实施方案的详细说明时，通过参阅所附的一个或一个这些附图将能更好地理解本发明。

图1显示本发明之一个实施方案的示意图，其中调节剂4与一个与蛋白酶相连的蛋白质1结合，导致该蛋白质与第二蛋白2相互作用，该第二蛋白与一个报道分子调节剂3相连，如一个重排的非活性调节蛋白质。调节剂4代表一种能调节蛋白质-蛋白质相互作用的化合物。在本实例中，Ar或抑制蛋白2与一个非活性的重排的报道分子调节或活化蛋白质3融合。蛋白酶7与蛋白酶1相连。在报道分子调节蛋白质3的两个片段之间显示了一个切割位点8。当与附在蛋白质1如7TMR上的调节剂4相互作用后而发生蛋白酶切割时，报道分子活化蛋白质的活性被重构，最终产生了一个如灯泡6代表的可检测信号。

图2是本发明一种蛋白质-蛋白质相互作用分析方法的一个图解。一个带有细胞内蛋白酶22的膜结合蛋白21与调节剂4相互作用。一个与蛋白质23相连的非活性报道分子带有一个非活性报道分子3或报道分子激活子3。当发生相互作用时，与蛋白质21相连的蛋白酶22使该重排的报道分子活化蛋白质23在切割位点发生切割，从而在调节剂4与蛋白质21接合时，使报道分子活化蛋白质3的蛋白质部分重排成5。该报道分子激活子从而实现了报道分子或报道分子激活子3的重组，以引起或激活一个报道分子。

图3显示一个实施方案的示意图，其中两个跨膜蛋白质相互作用。分子4引起(调节)了两个膜蛋白质(例如至少一个受体蛋白质)之间的相互作用。图中，蛋白酶22，如TEV(图1中的7)，与蛋白质1相连并被带到与第二个膜蛋白质33相连的重排的报道分子激活子融合蛋白3的附近。由于蛋白质1、33接近而在切割位点8处发生的蛋白质水解导致了报道分子活化蛋白质3的活化5。

图3还可以看成是显示调节报道分子同二聚体或异二聚体形成之分子的鉴定技术应用的图解。图中蛋白质1和33为膜结合蛋白。蛋白质1和33被构建成各自包含一个蛋白酶22或一个被蛋白酶22激活的报道分子3。调节相互作用的分子4与蛋白质1和/或33结合。当1和33相互作用时，蛋白酶22作用于报道分子激活子3，从而产生一个改变的信号。异二聚化可扩展至包括常规的同二聚化。例如，1和33可以是同一报道分子的两个拷贝，但所不同的是与蛋白酶或报道分子的结合。如别处所述，报道分子和报道分子激活子这两个术语经常可以互换使用，以描述本发明不同的实施方案。

图4显示了一个涉及细胞内蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用的实例。蛋白质41是一个与激活子22如TEV融合的核激素受体。一个重排的报道分子活化分子43位于细胞核40中。利用一种具有细胞核定位肽序列功能的基本多肽，可将报道分子定位在该细胞核中。在与配体如激素(此处未显示)结合时，NHR融合体41转移位置至细胞核中，并在细胞核中与报道分子体系相互作用。

图5显示由细胞中的TEV蛋白酶在重排的萤光素酶融合蛋白中重新产生的萤光素酶活性可通过修饰蛋白酶的切割位点来控制。因此信噪比是可以控制的。此处显示了两个构建体，ADRB2是β2肾上腺素能受体，Luc234-550和2-233是由X(即带有可变的C端氨基酸的TEV切割位点)连接的萤光素酶的两个片段。例如，X可为丝氨酸S、精氨酸R、或缬氨酸V。当两个构建体都出现在一个细胞中时，在哺乳动物细胞中从重排的萤光素酶融合蛋白中观察到了重构的萤光素酶活性。对TEV切割的敏感性取决于切割位点的具体残基。此处和别处的RLU表示相对发光(或光)单位。本实验中未使用配体。

图6显示在一个基于GPCR-重排的萤光素酶细胞分析中，激动剂诱导的萤光素酶活性，该分析使用与重排的萤光素酶连接的ADBR2受体，该重排的萤光素酶带有不同的TEV蛋白酶切割位点，在TEV切割位点X位置为R(左图)，在X位置为V(右图)。TEV蛋白酶与抑制蛋白融合。每张图的x-轴显示零值(无激动剂)和10μM激动剂。

图7显示在共瞬时转染和部分瞬时转染体系中基于GPCR-重排的萤光素酶细胞分析中，萤光素酶活性依赖于剂量的响应。在左图中，蛋白酶切割位点构建体的缬氨酸被用在CHO细胞中。ADRB2-luc和Arr-TEV构建体均被瞬时共转染。在右图中，用与ADRB2融合且含有R的萤光素酶构建体稳定地转染细胞，然后再用Arr-TEV构建体对细胞进行瞬时转染。

图8显示备选的GPCR-重排的萤光素酶分析。表达构建体带有与报道分子激活子结合的ADRB2，和与蛋白酶结合的抑制蛋白2。这些构建体都被瞬时转染到HEK 293细胞中。反应动力学在图中以1小时(▲)和5小时(■)反应培养表示。

图9显示一个在X位点带有V并被受体ADRB2-TEV瞬时转染的稳定表达抑制蛋白/重排的酶构建体的HEK细胞系(左图)的生成，以及一个稳定表达Arr-luc234S233并被受体-TEV构建体瞬时转染的CHO细胞系的生成。

图10显示在稳定表达抑制蛋白/重排的酶构建体且被ADRB2-TEV瞬时转染的HEK细胞中，关于激动剂(异丙肾上腺素)(■)、部分激动剂(▲)、拮抗剂加异丙肾上腺素(▼)、拮抗剂(◆)以及一种非特异内源受体(●)响应的Per-Luc分析。

图11显示V2(加压素受体2)激动剂和反向激动剂的GPCR Per-Luc分析评估。用抑制蛋白/重排的萤光素酶构建体稳定转染的HEK细胞被V2-TEV构建体瞬时转染，并被激动剂、8AVP、精氨酸加压素诱导(左图)。当这些细胞用反向激动剂分析时，观察到了剂量依赖性，信号由抑制蛋白介导，而不是由G蛋白介导(右图)。

图12显示ADRB2的几项基于β抑制蛋白的分析。在右图中，按制造商的说明用ADRB2瞬时转染DiscoveRX HEK细胞，并用一种拮抗剂(普萘洛尔)(■)、激动剂(异丙肾上腺素)(▲)以及两者的组合(●)测试(左边)，右边则用激动剂(■)、反向激动剂(▲)以及两者的组合(●)测试。将右边的分析结果与本发明对拮抗剂、异丙肾上腺素激动剂以及两者组合的响应的分析结果进行了对比。左边本发明的分析提供了更大的区分能力和更高的比活性。

图13显示V2的基于β抑制蛋白的分析。图中，V2反向激动剂(SR121463)诱导了一种独立于G蛋白而依赖于抑制蛋白的信号。

图14显示了几种表达构建体，它们包含一个基本上是全长、但不是萤光素酶的完整拷贝的重叠，它们按本文讲授的方法连接以形成一种重排的萤光素酶。CMV是巨细胞病毒启动子。Luc2-456和Luc234-550基本上是全长的萤光素酶片段。在本例中，GS是一个由甘氨酸和丝氨酸组成的肽接头。TEV切割位点在C-端有一个缬氨酸。

图15显示一个监测细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的分析实例。雷帕霉素(Rapamycin)是一种免疫抑制药物，可与雷帕霉素结合的蛋白质(FKBP12或FKBP)以及雷帕霉素哺乳动物目标(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素(FRB)结合域同时结合。mTOR是一种包含雷帕霉素结合域151的鼠丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，雷帕霉素结合域151是雷帕霉素154的哺乳动物目标。FKBP 152是具有雷帕霉素结合位点的12kDa FK506-结合的蛋白质。TEV蛋白酶与mTOR的雷帕霉素结合域即FRB 151融合。重排的报道分子活化蛋白质则与FKBP 152，即FKBP12的雷帕霉素结合域融合。雷帕霉素154与FRB 151和FKBP 152反应、介导与它们的结合并使它们接近，导致重排的报道分子的活化。

图16显示一种分析的构造，其中蛋白质A 21和B 23是两个膜结合受体，它们在与配体结合时自发地发生二聚化(从左至由)或解离(从右至左)。此分析方法可监测两个受体之间自发的相互作用或诱导的相互作用，其中一个受体或两个受体与一个相同或不同的配体结合。或者，蛋白质A21和B 23可自发地发生二聚化，或不必与一个配体或调节剂(未显示)结合。在这一实施方案中，蛋白酶和融合蛋白的重排的报道分子激活子部分被表达在细胞表面或人工包装或单元的外表。本分析方法也可以构造成监测相互作用受体的破坏，如由信号衰减、减小或消失所表明的破坏，无论这种破坏是自发的还是由一个或多个分子介导的。

图17显示一种细胞分析，其中蛋白质A 171和B 172存在于不同的细胞中，这些细胞可能结合、邻接或相互作用等等。同样，A 171或B 172可以带有蛋白酶177或重排的信号活化蛋白质173。该分析可检测两个细胞上两个标记受体之间的自发相互作用或诱导相互作用，以作为细胞-细胞之间相互作用或邻近的证据，其中一个受体或两个受体与一个相同或不同的配体结合。在这一实施方案中，蛋白酶177和融合蛋白的重排的报道分子激活子部分173在细胞表面或人工包装的外表表达。活化的重排的报道分子175产生于蛋白质A 171和B 173的相互结合。或者，所研究的受体融合和细胞内蛋白质融合可存在于同一细胞中，所监测的诱导事件、配体等则表达在第二个细胞上或就是第二个细胞。本分析方法也可以构造成监测相互作用的受体和细胞的破坏，如随着细胞的分离由信号衰减、减小或消失所表明的破坏，无论这种破坏是自发的还是由一个或多个分子介导的。

一些代表性实施方案详述

本发明的分析方法检测蛋白质-蛋白质相互作用，而无需事先了解调节该相互作用的化合物或由该相互作用引起的细胞途径方面的知识。该分析方法可检测膜蛋白质之间的相互作用，如同二聚体或异二聚体的形成。该分析方法可检测膜蛋白与细胞质蛋白之间的相互作用。该分析方法可检测两个细胞质蛋白质的相互作用。该分析方法可检测到蛋白质向细胞内空间或细胞内细胞器的易位。该分析方法可检测两个细胞或包装或单元之间的相互作用。蛋白质A或B可与一种可能对蛋白质-蛋白质相互作用并非必不可少的配体、辅因子或其它化合物、分子或物质结合。

如本领域技术人员所知，术语“序列”在遗传工程、核酸和蛋白质领域中有多种用法，在某个句子、段落、概念、想法、一节文字等上下文中可能具有不同的含义。例如，一个序列可代表一个多肽的特定的氨基酸残基列表(一级结构)，或代表一个多核苷酸的核苷酸碱基列表。在另外的上下文中，序列可能指的是广义的复合分子，如一个指整个分子而无需知道一级氨基酸结构的多肽序列。基因序列可与基因为同义词且指的是多核苷酸本身或整体。序列可以指单个多肽或多核苷酸，也可以指它们的一部分。因此，当使用“序列有效连接”这样的说法时，即表示单个基因、结构域或转录单元可以某种功能形式被连接或结合在一起，从而能够表达所述结合或连接的单个基因、结构域、转录单元等。这些序列也可以是一个特定的表达基因或蛋白质的组成部分，如具有多个功能部分或结构域的蛋白质的结构域。如本领域内已知，所研究的多核苷酸可以是DNA或RNA，或两者的混合物。在本发明的实践中制造和使用这些多核苷酸的方法在本领域内是已知的。

例如，图4显示对于细胞核激素受体调节后活性的分析。由于报道分子活化蛋白质和任选地一种可检测而可作为报道分子的分子的重排，细胞核激素受体向细胞核的转运引起或激起一个信号，例如作为对活化蛋白质例如萤光素酶的活性的响应而出现的荧光改变或荧光的存在。生成的信号可为任何可检测的变化，如强度的变化或激发/发射参数的变化。化学发光是另一种常见的报道分子信号。本领域熟练技术人员将会理解，一个蛋白酶或一个重排的报道分子都可被构建成具有细胞核和其它目标多肽。这样的目标多肽可包含碱性氨基酸。两者在目标区域产生相互作用时，信号将得到调节。

对于GPCR而言，本分析方法是特异的、灵敏的，且不需要事先知道特定G蛋白偶联方面的知识。该分析方法不受内源GPCR的影响，可用来鉴别分子、包括激动剂、拮抗剂以及(某些受体)的反向激动剂。本发明的分析方法是对Lee等人的方法的改进，避免了对转录扩增的需求。本发明提供了一个更迅速和更直接的读数。

本发明提供了一种比Lee等人的更简单、更可靠的分析体系，其部分原因是本体系不需要将试剂转移至细胞核并在其后转录扩增信号。因此，读数可接近受体调节事件。本发明不像Lee等人的方法那样，需要细胞核。事实上，本发明的一种应用就是检测分泌的蛋白质。细胞质中的报道分子和蛋白酶均可激活(或失活)来自分泌的伴侣蛋白质的信号。另一个实施方案是用于去核细胞，或人工细胞、包装或单元。

对于能调节任何蛋白质-蛋白质相互作用的分子的鉴别，本发明尤其有用。DiscoveRX^TM分析是一项使用β抑制蛋白的分析，要求两个相互作用的蛋白质组分在所有时间都保持在一起，用以产生信号。大多数先前的GPCR分析均基于G蛋白信号，如FLIPR和cAMP分析法。任何影响Ca⁺⁺或cAMP水平的分子都易产生假阳性信号。另一方面，本发明的方法快速、可靠且成本低廉，同时独立于可能影响灵敏度和特异性的酶组分结合或G蛋白信号。

本发明通过使蛋白质A(或蛋白质B)与报道分子活化蛋白质(报道分子调节蛋白质/分子或报道分子活化蛋白质/分子是与其相当的)融合而提供了一种分析或筛选任何蛋白质-蛋白质相互作用的手段。该手段的一个实例就是含有蛋白水解切割位点的重排的酶。蛋白质B与蛋白酶融合。蛋白质A和蛋白质B的相互作用可以是组成型的或由第三个分子诱导的。本领域熟练技术人员可使用本发明的分析方法来鉴别增强或干扰蛋白质-蛋白质相互作用的分子。或者，蛋白质A可与一种蛋白酶融合，蛋白质B则可与一种报道分子活化蛋白质融合。

本发明的报道分子活化蛋白质是潜伏的，可在与第二蛋白的蛋白酶作用时被激活。一种令人感兴趣的做法就是产生一个报道分子活化蛋白质，该报道分子活化蛋白质是重排的分子，被构建为包含蛋白酶切割位点。当切割时，报道分子活化蛋白质的部分可结合、装配以及诸如此类以产生一个活性的报道分子活化多肽或装配。这一活性的，例如酶学上活性的报道分子活化蛋白质然后可作用于适当的底物如报道分子，从而产生可检测的信号。例如，当该重排的、非活性分子是萤光素酶时，当切割而形成生物上活性的萤光素酶时，此萤光素酶可作用于适当的底物如萤光素，以产生可检测的信号，在本例中即为发光。

在另一个实施方案中，报道分子活化蛋白质是报道分子。因此，这可被看作是报道分子活化蛋白质在切割时发生的自活化。一个实例是GFP，GFP在切割时发生重排并产生一个独立于报道分子体系的可检测信号；如当报道分子激活子为萤光素酶时，该报道分子体系为一种提供萤光素的试剂。

重排的报道分子活化基因可构建成为活性的或非活性的形式。例如，在研发这一技术的时候，构建了一种GPCR-非活性的重排萤光素酶融合物，其中萤光素酶氨基酸序列的次序被改变。原来的N端片段被移到了C端，原来的C端片段被移到了N端，一个蛋白酶识别位点被用于融合这两个次序改变了的片段。GPCR-非活性的重排萤光素酶融合蛋白与β抑制蛋白2-TEV蛋白酶融合蛋白之间的相互作用导致非活性的重排萤光素酶的切割，以及一种重构萤光素酶活性的产生。采用备选策略，本发明人构建了一个GPCR-活性的重排萤光素酶融合构建体，其中将一个蛋白酶识别位点引入到原来次序的萤光素酶序列，而没有显著地影响萤光素酶活性。GPCR-活性的重排萤光素酶融合蛋白与β抑制蛋白2-TEV蛋白酶融合蛋白之间的相互作用导致活性的重排萤光素酶的切割，并产生两个非活性的萤光素酶片段，结果导致了活性丧失，信号也因此变小或丧失。

报道分子活化蛋白质可从基于重排的蛋白质的报道分子中选择，如Gaussia萤光素酶；水母萤光素酶；β内酰胺酶；β半乳糖苷酶；以及荧光蛋白质，如包含蛋白水解切割位点如TEV切割位点的绿色荧光蛋白质(GFP)或DsRed蛋白质等。虽然“酶”是作为一个通用术语使用的，报道分子活化蛋白质本身却并不限于“酶”，而是指任何能够使信号发生变化的报道分子活化蛋白质。例如，结合或螯合一个荧光蛋白就可能产生一种足够的信号变化，而无需改变分子结构的化学反应。

作为本发明的一个特点，熟练的分子生物学家或蛋白质化学家可使用不同的断开点和不同的重叠区域以降低或增加蛋白酶活性、基本萤光素酶活性或重构的萤光素酶活性来构建重排的萤光素酶变体。参阅Rachel B.Kapust，et al.Biochemical & Biophysical Research Communications，294(2002)949-955。

蛋白酶是本领域人士所熟知的，可从各种各样的来源选择，如细菌、酵母、真菌、植物、昆虫、哺乳动物等。生物体需要蛋白酶来处理肽，因此，生物世界提供许多各种各样的适用于本发明的蛋白酶。对于一种所需的酶而言，适当切割位点的选择通常可以从文献中或产品目录中查到。这样的蛋白酶切割位点是各种长度的寡肽，如两个氨基酸、三个氨基酸、四、五、六、七、八、九、十个或更多个氨基酸等。

重排的报道分子活化蛋白质也可以用备选的蛋白酶切割位点取代或连接到一个或多个在切割后能够转化为活性酶的非活性酶原前体。例如，酶原前体的切割位点可被修饰成对一种能识别与野生型序列不同的序列的酶敏感。或者，还可以修饰切割位点以获得特别希望的效果，如更高的特异性，对切割更敏感等。

也可以用一种带有蛋白酶切割位点的活性酶来完成分析，该活性酶在切割后转变成非活性酶。这一特点具有某种简单性，因为多种具有不同特异性的蛋白水解酶可根据需要而作用于活性酶，不需要或仅需要极少的重新构建。

哺乳动物细胞，如HEK293、COS-7、NIH3T3等，以及酵母细胞可用来建立蛋白质-蛋白质相互作用重排报道分子活化蛋白质的分析。也可使用无细胞的体系。此类无细胞体系包括裂解物、膜制备物、病毒储备液、病毒样颗粒、脂质体、血小板、膜制备物、蜗形菌(cochleates)、其它人工制备的基于脂质的单元或包装，它们刺激生物膜而形成一种能够封闭、附着、携带、包含一个生物实体如跨膜蛋白质的结构。生物体如转基因生物体也可用于本分析方法，或能够提供可用于本分析方法的细胞或试剂。

本发明的分析方法还提供一种可检测的报道分子。该报道分子是所研究的报道分子活化蛋白质的底物。因此，在重排的萤光素酶的情况下，适合的报道分子是萤光素，它在萤光素酶作用下，能产生一种可检测的发光信号。报道分子也可以是细胞内的，从而可提供一种避免细胞裂解的分析方法。例如，融合到麦芽糖结合蛋白质(MBP)羧基端的GFP当MBP信号序列存在时是不发萤光的。当MBP信号肽被除去后，就可以观察到荧光。参阅Feilmeier et al.，J Bacteriol 182(14)4068-4076，2000。因此，如本文所教导，蛋白酶切割位点可被引入到MBP信号肽的下游，以产生一种可使用活细胞的分析。

本分析方法可利用重排的萤光素酶或荧光蛋白质来监测蛋白质相互作用复合体的亚细胞位置和位移。图4是这样一个实施方案的图示。

本发明涉及一些方法，用于确定所研究的物质是否调节以下蛋白之间的相互作用：i)第一蛋白，如膜结合蛋白，例如一种受体，如跨膜受体，与ii)第二蛋白，如一种细胞内分子、另一种跨膜蛋白质等，例如抑制蛋白家族的成员。一种方法涉及细胞的共转化或共转染，该细胞可以是原核或真核的且包含两个构建体。第一构建体包括编码以下物质的第一核酸：(a)第一蛋白，如跨膜受体和(b)蛋白酶的一个切割位点，以及(c)编码一个能活化报道分子的蛋白质的第二核酸。第二构建体包括(a)一个编码第二蛋白的核酸，该第二蛋白与第一蛋白的相互作用被测量和/或被测定，以及(b)一个编码蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性并作用于第一构建体切割位点的多肽的核酸。在某些实施方案中，一个或更多这样的构建体可稳定地整合到细胞中。

本发明一个实施方案的一些特点如图1所示。简言之，获得一个表达所研究第一蛋白的细胞。所研究的蛋白质可包括蛋白水解部分，或者该蛋白水解部分可在结合或释放结合的配体时与复合体结合。作为对配体结合状况变化的反应，一种非活性的酶与肽部分连接，所述肽部分结合所研究的第一蛋白。在本实施方案中，蛋白酶与非活性酶的接近使得酶活性如萤光素酶活性发生重构。重构的活性影响蛋白质-蛋白质相互作用的报导。

图1所示的实例显示一个跨膜蛋白质、一个TEV切割酶、一个重排的萤光素酶和一种萤光素酶底物，如萤光素。此例中的蛋白质“A”可以是抑制蛋白。所研究的第一蛋白可以是GPCR。萤光素酶的N端和C端可重排并与TEV蛋白酶切割位点连接，以产生一种非活性的重排的萤光素酶。所示的重排的萤光素酶与β抑制蛋白2融合。

蛋白质A可与蛋白酶融合。蛋白质B可与一个非活性的重排的报道分子活化蛋白质融合。蛋白酶识别和切割位点(被一个融合到蛋白质A的蛋白酶识别)被插入重排的报道分子活化蛋白质。蛋白质A和蛋白质B被例如调节蛋白质A和蛋白质B相互作用的第三个分子带到彼此接近的位置。重排的非活性报道分子活化蛋白质被附近的融合蛋白酶水解，导致重排的非活性报道分子活化蛋白质的两个片段融合，从而重新产生活性的报道分子活化蛋白质活性。报道分子活化蛋白质的活性可用适当的试剂、装置，使用一种适当的报道分子如萤光素使用市售的试剂和试剂盒来进行评估。

作为蛋白质A的GPCR可与TEV蛋白酶融合。或者，GPCR也可与重排的报道分子活化蛋白质融合。

图1中，一个与GPCR结合的分子导致β抑制蛋白与GPCR的相互作用。重排的萤光素酶内的切割位点被与蛋白质A连接或在蛋白质A附近的TEV蛋白酶水解而产生萤光素酶蛋白质片段。这些片段重构成活性的萤光素酶，可利用一个适合的能测量萤光素酶活性的报道分子，如细胞中或裂解产物中的萤光素来检测或推断其存在。

该方法可对受体蛋白质如与G蛋白或β抑制蛋白发生作用的GPCR产生特异的信号。

图1所示的一般方法通常适用于GPCR，因为β抑制蛋白的募集是一种常见的现象。但是，任何相互作用、结合或缔合等或怀疑有相互作用、结合、缔合等的分子对均可用于本发明的实践。

一个示范性的方法采用β抑制蛋白信号途径且不需要事先了解具体G蛋白偶联的知识，因为此分析方法对GPCR或对所涉及的G蛋白并非是特异的。因此，此分析方法对孤儿GPCR来说很理想，因为其中的G蛋白偶联途径未知。该方法产生立即的和生理学相关的读数，而无需像美国(Lee等人的)第7,049,076号专利那样进行转录扩增。

这些材料和方法也使得能够监测G蛋白独立的现象。在这种情况下，可用重排的报道分子活化蛋白质来标记β抑制蛋白。一个怀疑或已知与β抑制蛋白相互作用的分子可用适当的蛋白酶，如显示对β抑制蛋白有偏向性的GPCR来标记。

相对于酶片段互补分析(如DiscoveRX PathHunter^TM β抑制蛋白分析)，本发明具有优势，因为在酶片段互补分析中，相互作用的配偶体必须接合或在一起，以确保酶片段的互补。另一方面，在本发明的方法中，一旦因试剂接近而发生蛋白质水解，就生成了活性的报道分子激活子，不需要蛋白质相互作用配偶体保持结合状态即可获得有意义的分析。

编码这个第一融合蛋白的核酸和其它肽组分可被引入宿主细胞。此类细胞改造在本领域内是众所周知的。各种肽的核酸可构建成单一的分子，也可先后或同时引入。例如，某些构建体可以整合进宿主染色体，以获得稳定的转染，所使用的材料和方法是本领域内已知的。

在另一个备选体系中，所研究的两个蛋白质可以在无配体或受试化合物存在情况下相互作用。配体和受试化合物可导致两个蛋白质离解，改变构象，或减少或抑制其相互作用。在这种情况下，细胞中游离的、具有功能活性的蛋白水解酶的水平在一种阳性受试化合物存在的情况下就会降低，导致水解程度减少，报道分子活化蛋白的活性也明显降低。

在一个典型的实施方案中，抑制蛋白是在激动剂存在情况下与跨膜受体结合的第二蛋白；但是，应该理解，由于受体只是一种类型的蛋白质，此分析并不依赖于受体分子的使用，激动剂结合也不是能够发生的唯一相互作用。任何能与第二蛋白相互作用的蛋白质都可以用，尽管人们感兴趣的是跨膜蛋白质，因为受体暴露于调节剂时，它们引起细胞、器官和组织反应，所述调节剂加速细胞结合的受体进入活性状态。此外，激动剂与受体的结合并不是可分析的唯一结合类型。反向激动剂也可以用本分析方法进行分析。可以按照本发明的方法测定拮抗剂本身，也可以测定不同的拮抗剂和/或激动剂的相对强度。

本发明的其它细节，包括制造和使用本发明主题内容的具体方法和技术将在下面描述。

如同本文所述的方法，作为本发明特点的产品也可以简单地予以描述。例如，在“三部分构建体”中，即一种含有编码以下组分的序列的构建体：i)一种蛋白质，ii)切割位点，以及iii)报道分子活化蛋白质；该蛋白质可以是例如细胞内蛋白质或膜结合蛋白，如跨膜受体，例如GPCR家族的一个成员。该切割位点可为任何可水解的位点，其水解可在蛋白质-蛋白质相互作用的配偶蛋白质的蛋白酶作用下实现。切割可直接产生报导，或者切割也可使报道分子活化蛋白质进行重排，从而从另一个分子产生报导。第三部分则可以是一种蛋白酶或具有蛋白酶活性的多肽。

可以修饰这些序列，使得它们编码的蛋白质的C端与第二蛋白有更好、更强的相互作用。例如，此类修饰可包括用AVPR2、AGTRLI、F2PLI、CCR4、CXCR2/IL-8等的C端编码区取代该蛋白质如GPCR的C端编码序列。基因序列可以重新编码以优化宿主细胞中所研究的蛋白质的翻译。

活化报道分子的蛋白质可以是一个在细胞质内或细胞器如细胞核内作用的蛋白质，或者也可以是一个引发级联反应而引起另一蛋白质起作用的分子。本领域熟练技术人员对此类级联反应很了解，因为它们是已经过深入研究的细胞事件。例如，易位信号，如一个细胞核易位序列可被整合至报道酶中。定位序列在本领域内为人们所熟知。

第二个构建体，如上所述，包括一个编码与第一蛋白作用的蛋白质的区域，导致某种可测量的现象。该蛋白质可以是一种激活子、竞争者、抑制剂、或一种产生协同响应的组分等等，或者更广义地说，就是第一蛋白的“调节剂”。抑制蛋白家族的成员是范例，尤其当第一蛋白为GPCR时更是如此，但是，其它蛋白质编码序列也可以使用，尤其是当第一蛋白不是GPCR时更是如此。这些两部分构建体的第二部分编码蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽，该多肽切割由第一个构建体编码的报道分子活化蛋白质，以生成能直接或间接地产生一种可检测信号的报道分子活化蛋白质。

但是，这些作为范例的实施方案并不限制本发明，如下文另一些实施方案中所讨论的，例如，作为一种设计上的选择，蛋白酶可以融合到蛋白质A或蛋白质B中。

宿主细胞

本文中所用的术语“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”可互换使用。宿主细胞也可以指一种可从其获得裂解物的源细胞。所有这些术语还包括其后代，即任何和所有的后代。应当理解，由于有意或无意的突变、选择或分化，所有后代并不是完全相同的。宿主细胞可经工程改造以表达一种可筛选的或可选择的标记物或报道分子，后者在受到第一个构建体的报道分子活化蛋白质作用时，会发出一种信号，其中第一个构建体的报道分子活化蛋白质是由作为第二构建体的融合蛋白之一部分的蛋白酶所切割。可筛选的标记物或报道分子可以任何方式引入宿主细胞或分析体系。

无数的细胞系和细胞培养物都可用作宿主细胞。例如，可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得很多宿主细胞，ATCC是一个保存活培养物和遗传材料的机构。根据载体骨架特征和需要的结果，本领域熟练技术人员可确定适当的宿主细胞。例如，质粒或粘粒可被引入原核生物宿主细胞中以复制许多载体。可用于载体复制和/或表达的细胞类型包括但不限于细菌，如大肠杆菌(如大肠杆菌菌株RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776(ATCC No.31537)、大肠杆菌W3110(F^-，lambda^-，原养型，ATCC No.273325)、DH5α、JM109和KC8)，芽孢杆菌如枯草杆菌；以及其它肠细菌如鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、各种假单孢菌，以及一些市售的细菌宿主如SURECompetent Cells和SOLOPACK^TM Gold Cells(STRATAGENE，LaJolla)。在某些实施方案中，细菌细胞如大肠杆菌LE392可作为噬菌体病毒的宿主细胞使用。

用于载体复制和/或表达的真核宿主细胞的实例包括但不限于HeLa、NIH3T3、Jurkat、293(HEK)、COS、CHO、Saos以及PC12。其它细胞，如酵母细胞和昆虫细胞，如Sf9细胞，也是适合的。根据使用目的，本领域熟练技术人员可以选择他或她希望使用的宿主细胞。本领域熟练技术人员知道，有许多来自各种细胞类型和生物体的宿主细胞可供使用。

类似地，病毒载体(包括噬菌体)可与真核或原核宿主细胞，尤其是允许载体复制或表达的细胞结合使用。宿主细胞不必为一个永生化细胞系。宿主细胞可来自干细胞培养物或原代细胞培养物，如造血干细胞、血管、上皮、平滑肌、脾脏、T细胞、B细胞、单核细胞等。宿主细胞可以是转基因的，如包含另一生物体的遗传物质。Lee等人的方法中不能使用的细胞也可用于本发明的分析方法，因为本发明的方法不需要活性转录。例如，去核细胞如红细胞或血小板均可用于本发明。

在本发明的分析中，宿主细胞意在包括人工包装和单元，如脂质体和病毒样颗粒。这样的结构通常模仿或模拟一个细胞或其部分，产生一种带有由薄膜或其它结构与外部完全或部分隔离的内部空穴的封闭结构。如上所述，这样的人工制备的包装和单元包括脂质体、蜗形菌、病毒样颗粒、病毒等。

蛋白质

本发明考虑使用任何两种已知或怀疑具有物理相互作用的蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质以融合蛋白的形式存在或构建成以融合蛋白的形式存在，第一蛋白融合到一个潜伏的或非活性的报道分子活化多肽上，第二蛋白融合到一个能够识别第一融合蛋白上切割位点的蛋白酶上，第一融合蛋白的切割释放出报道分子活化多肽或使其具有活性。

至于所研究的第一蛋白，它可以是一种天然出现的膜结合蛋白，或通过构建使之成为膜结合蛋白。例如，第一蛋白可以是跨膜受体如GPCR，或任何其它所研究的跨膜受体，包括但不限于受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、细胞因子受体等等。此外，众所周知，蛋白质的某些部分将和全长的第一蛋白以同样的方式起作用，这样的第一蛋白的活性部分、如分子外结构域或跨膜结构域，都属于本文蛋白质的定义之内。

本发明可用于分析与任何蛋白质的相互作用，而不限于仅分析膜结合的受体，如GPCR，这对于本领域熟练技术人员来说是很显然的。例如，其它类别的跨膜受体的活性，包括但不限于：受体酪氨酸激酶(RTKs)，如IGF1R，如上皮成长因子受体(EGFR)、ErbB2/HER2/Neu或相关的RTK；受体丝氨酸/苏氨酸激酶，如转化生长因子-β(TGFβ)、激活蛋白或骨形成蛋白(BMP)受体；细胞因子受体，如白细胞介素、红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF或肿瘤坏死因子(TNF)的干扰素家族的受体；瘦蛋白受体；以及其它通常不必是膜结合的受体，如雌激素受体1(ESR1)和雌激素受体2(ESR2)。在每种情况下，该方法可能涉及用一种经修饰的受体多核苷酸来转染细胞，该多核苷酸指导嵌合的或融合的蛋白质的表达，包括所研究的受体、蛋白酶切割位点和报道分子活化多肽。该细胞可用第二种多核苷酸，如一种载体共转染，该载体指导嵌合的或融合的蛋白质的表达，包括一种与能识别并切割第一蛋白切割位点的蛋白酶融合的相互作用蛋白质。第一个和第二个多核苷酸可被包括在单一的分子内，从而避免了共转染。在RTK的情况下，如EGFR，这一相互作用蛋白质可由含有多肽如磷脂酶C(PLC)的SH2(Src同源域2)或含有转化蛋白质1(SHC1)的Src同源2域组成。在受体丝氨酸/苏氨酸激酶的情况下，如TGFβ、激活蛋白和BMP受体，这一相互作用的多肽可以是Smad蛋白或其一部分。在细胞因子受体的情况下，如干扰素α、干扰素β或干扰素γ受体，这一相互作用的蛋白质可以是一种信号转导和转录激活(STAT)蛋白，例如但不限于Stat1或Stat2；或Janus激酶(JAK)蛋白，Jak1、Jak2或Tyk2；或其部分，等等。该转染细胞可包含一个受报道分子活化蛋白作用的报道分子。然后进行了一项分析，其中用一种受试化合物对该转染细胞处理一定的时间，在测试末期，测量了报道分子的活性。如果受试化合物激活所研究的报道分子，则会激发所研究的受体和相互作用的蛋白质之间的相互作用，导致蛋白酶切割位点的切割和报道分子活化蛋白质的活化，结果使报道分子活性产生了可测量的变化或增加。

其它可能的蛋白质对包括抗体-抗原、酶-底物、二聚化蛋白质、信号转导级联组分，复合结构的组分，如核糖体或病毒，不同细胞上细胞间相互作用分子，如抗原呈递细胞和用于响应的免疫细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞等等，以及本领域所知的其它蛋白质对。至于哪一个蛋白质，如A或B结合到哪个蛋白质或从哪个蛋白质解离，蛋白酶和具有蛋白酶识别位点的蛋白质是可交换的。

报道分子

报道分子可以是响应活性报道分子活化分子的活性而改变外观或功能并产生一种可检测信号或可容易地监测以便跟踪这些变化的任何分子。这些术语旨在宽松地应用。报道分子活化蛋白质一旦被活化(或在某些可能的实施方案中被失活)，将在报道分子中产生一种可检测的变化。这种变化的检测可用来确定例如一种受试化合物是否已调节了蛋白质-蛋白质相互作用。其它非酶报道分子活化蛋白质也可以使用，只要能产生一种可检测信号即可。因此，某些已知的报道分子活化蛋白质，如半乳糖苷酶、过氧化物酶、萤光素酶等，都可以使用。某些已知的报道分子，如半乳糖苷酶底物、过氧化物酶底物、萤光素酶底物、GFP等，也可以使用。

蛋白酶和切割位点

蛋白酶是已被很好鉴定的酶，可在特定的位点切割其它蛋白质。一个蛋白酶家族，即Ser/Thr蛋白酶家族，可在丝氨酸和/或苏氨酸残基处切割。其它蛋白酶包括半胱氨酸或硫醇蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、氨肽酶、二肽酶和三肽酶、羧肽酶和肽基肽酶。这些酶的选择由本领域熟练技术人员决定，且不必限制于本文所述的分子。众所周知，酶具有催化域，这些催化域可用来取代全长的蛋白酶。这些内容也包含在本发明之中。一个特定的实施方案就是烟草蚀刻病毒核包涵物A蛋白酶(TEV)，或其活性部分。正如本领域熟练技术人员所理解，蛋白酶的其它特定的切割位点也可使用。

蛋白质的修饰

在本分析方法的一些实施方案中，第一蛋白可加以修饰以增强其与作用蛋白质的结合。例如，已知某些GPCR在受到配体刺激时，其与抑制蛋白的结合更为稳定或具有更大的亲和力，这种增强的相互作用是由分离的域，如C端尾部丝氨酸和苏氨酸残基簇介导的(Oakley，et al，J.Biol.Chem.，274：32248-32257，1999and Oakley，et al.，J.Biol.Chem.，276：19452-19460，2001)。利用这一实例可以清楚地理解，受体编码序列本身可被修饰，以增加膜结合蛋白如受体与其所结合蛋白质之间的亲和力。这些变化的范例是膜结合蛋白如7TMR的C端区域的修饰，其可能涉及利用与结合蛋白质有更高亲和力但不影响受体结合功能的另一个受体之对应的区域来取代其一个部分。

此外或备选地，也可修饰第二蛋白以增强其与第一蛋白的相互作用。例如，本分析方法可掺入点突变、截短或第二蛋白的其它变体，如抑制蛋白，已知抑制蛋白能更稳定地或以独立于磷酸化的方式与激动剂占据的GPCR结合(Kovoor，et al.，J.Biol.Chem.，274：6831-6834，1999)。这样的改变可用本领域已知的方法实施。

分析法形式

在几个实施方案中，本发明提供一种简单的方式来评估表达在同一细胞、单元或反应混合物中的两个蛋白质之间的相互作用。第一个构建体可包括一个编码第一个多肽的序列，该序列连接至一个编码蛋白酶、蛋白酶部分或具有蛋白酶活性的多肽之切割位点的多核苷酸，其本身也连接至一个编码报道分子酶的多核苷酸。“连接至”这一术语描述了这样一种情况，其中所述的序列被融合而形成一个单独、完整的可读框，该可读框可翻译成一个包含所有元素的单一多肽。这些可以但不必被另外的核苷酸所分离，那些核苷酸可能编码，也可能不编码另外的蛋白质或肽。被插入重组细胞中的第二个构建体可同时包含一个编码第二蛋白的多核苷酸以及蛋白酶、蛋白酶部分或编码蛋白酶活性的多肽。这些基本要素综合起来，当与一种其对目标蛋白质相互作用的影响待测的候选试剂相组合时，就形成了一种基本的分析法形式。

但是，通过同时采用不同的报道分子，本发明还可以用于分析一种以上的膜结合蛋白如受体，每种受体因一种本文所述的不同种类的蛋白质的活化而被激活。例如，这可通过混合用不同受体构建体和不同报道分子活化蛋白质转染的细胞来实现，或者也可以对每种受试受体融合不同的酶，并在用受试化合物处理时测量每种报道基因的活性。例如，可能希望确定所研究的分子是否激活第一个受体，并且希望确定是否应该预期作为与第二个受体相互作用的结果而出现副作用。在这种情况下，可能会涉及例如编码第一个受体和第一个受体活化蛋白质，如lacZ的第一细胞系，编码第二个受体活化蛋白质和第二个受体，如GFP的第二个细胞系。在那种情况下，如本发明所实施的，GFP可以重排。可以将两个细胞系混合，并加入所研究的化合物，然后寻找对一个细胞系的阳性结果，对另一个细胞系则没有影响。

本发明的备选形式既涉及只检验一对相互作用的蛋白质的分析，也涉及本文所说的“多重”分析。这类分析可以多种方式进行，但在所有情况下，都是同时分析一对以上的蛋白质。这可通过提供一个以上的细胞样品来实现，每个样品均被转化或转染，以分析每一对相互作用的蛋白质。可将不同的转化细胞合并在同一个容器中并同时测试，或可将每种不同的转化体放在不同的孔中再加以测试。或者，可对细胞进行处理使之带有多种标记的第一蛋白，如基于跨膜的蛋白质，以确定一种配体或候选分子是否能激活一种以上的受体。

本文所述的用于多重分析的细胞可以相同，但并非必须相同。类似地，每个样品中所用的报道分子体系可以相同，但并非必须相同。当样品放入容器如微阵列的孔后，可对照容器中多对相互作用的蛋白质筛选一种或多种化合物。

图10显示用本分析方法所得的常见结果。在低浓度或高浓度时(取决于调节作用是否是抑制或活化)，受试化合物可能会没有作用。随着受试化合物浓度的降低或升高，调节作用可能会发生变化。如图10所示的剂量反应曲线可用于评估调节作用。单一的点也可予以评估。例如，该单一点可以是一个与对照或背景不同的预先确定的值。该预先确定的值是通过积累一定的数据或对“正常”受试者的样品做多次测定，获得带标准误和标准差的样品群体平均值，从而通常在统计的基础上确定的。可以用某个常数作为预先确定的不同值。一般而言，将使用比值，如至少偏离对照样品10％，但更经常是用对照样品的倍数，如在另一次分析中预先确定的对照值的大约1.5、2、2.5、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1000或更多(或其倒数)倍。表明调节的预先确定的阈值通常是由本领域熟练技术人员根据情况的提示或需要，考虑情况提示或要求的平衡1型和2型误差后计算得到的。

试剂盒

本文所述的任何组合物及其任何组合均可以试剂盒的形式提供。因此，试剂盒将包括适当容器中的一种或多种组分，如本发明的载体或细胞，以及可按照本发明使用的任何其它试剂。

该试剂盒可包括一种或多种经适当等分的本发明组合物。试剂盒的组分可以水性介质或以冻干形式或以溶质在一种适当溶剂中的浓缩液形式提供。试剂盒的容器一般至少包括一个小瓶、试管、容量瓶、瓶子、注射器或其它容器，其中可装入或已经装入一种组分，且最好是已经适当等分。在试剂盒包括一种以上组分的情况下，该试剂盒通常还包括第二个、第三个或其它额外的容器，分别容纳其它组分。但是，也可将多种组分的各种组合装在一个单一的容器中，如小瓶中。另外，还可提供适当的稀释剂。本发明的试剂盒通常还包括封装试剂容器的手段，以供商业销售。这样的容器可包括注射成型或吹塑成型的塑料或泡沫容器，以保存所需的试剂瓶以及说明书。

当试剂盒的组分是以一种和/或多种液体溶液的形式提供时，该液体溶液可以是一种水性溶液，如特别有用的无菌水溶液。但是，试剂盒的组分也可以干粉的形式或附在固体支持体上的形式提供。当试剂和/或组分以干粉的形式提供时，可通过在干粉中加入一种适当的溶剂而进行重新配制。可以想见，该溶剂，如无菌水或适当的盐水或缓冲液，也可装在另一个容器内。

实施例

下面给出一些说明本发明实施方案的特定实施例，但是，不应认为本发明仅限制于这些实施例。

实施例1

图1显示一个实施方案，它包括一个重排的非活性萤光素酶，该非活性萤光素酶的活性由于TEV蛋白酶对所包含的TEV蛋白酶识别位点的作用而得以重构。如图所示，第一蛋白与一个蛋白酶融合。实施例1的设计是，用TEV蛋白酶的活性来重构重排的萤光素酶的活性作为第二蛋白的实施方案。如图所示，第二蛋白与一种非活性重排的报道分子活化蛋白质即萤光素酶融合。一个与所研究蛋白质融合的蛋白酶所识别的蛋白酶识别和切割位点被插入重排的报道分子活化蛋白质。第一蛋白和第二蛋白被调节第一蛋白和第二蛋白之间相互作用的第三个分子带到彼此相近的位置。重排的非活性报道分子活化蛋白质被附近的融合蛋白酶水解导致重排的非活性报道分子活化蛋白质的切割，形成两个片段，从而重新产生活性的报道分子活化蛋白质。报道分子活化蛋白质的活性可用适当的试剂和装置来评估。

重排的萤光素酶通过重排萤火虫萤光素酶N端氨基酸2至233以及逆序的C端氨基酸234至550而构建，并被一个TEV蛋白酶识别位点ENLYFQX(SEQ ID NO：3)中断。在这一位点的切割导致重排的萤光素酶的重构活性。X的位置可为任何决定TEV蛋白酶识别亲和力和切割效率的氨基酸。改变X已显示可调节TEV的酶动力学。识别序列中其它位点的类似的氨基酸取代也能改变酶动力学。调节动力学有利于优化诸如筛选过程中的培养时间和影响信/噪参数的背景活性。重排的萤光素酶(luc234X233，其中X是TEV七肽切割位点N端的具体氨基酸，SEQ IDNO：3)然后被融合到一个GPCR即ADRB2的C端，从而产生GPCR-重排的萤光素酶ADRB2-luc234X233，即表达质粒。

实施例2

通过使烟草蚀刻病毒蛋白酶A与β抑制蛋白2的C端融合，构建了人类β抑制蛋白2-TEV融合质粒。利用适当的模板由PCR生成了所有的DNA片段。GPCR-luc234X233融合基因被亚克隆在具有新霉素选择标记的pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，Arr-TEV融合基因被亚克隆在具有博来霉素(zeocin)选择标记的pcDNA3.1(+)(Invitrogen Cat.#43-0018)中。

实施例3

利用适当的市售的转染试剂盒，以ADRB2-luc234R233(实施例1)和Arr-TEV质粒(实施例2)共转染CHO-K1细胞。转染48小时后，细胞用或不用10μM ADRB2激动剂异丙肾上腺素处理2小时，向细胞中加入了Bright-GLO^TM或Steady-GLO^TM(Promega)并用适当的发光读出仪记录了裂解物的相对发光。在异丙肾上腺素存在的情况下，观察到发光活性增加了三倍以上。

图5显示加入或不加入Arr2-TEVp时GPCR/重排的萤光素酶的表达。图中所示的数据中，构建体被引入到细胞中，但是，转染的细胞没有接触任何调节剂。因此，数据表明，当切割位点含有丝氨酸时，有一些自发的活性，但是当X是R或V时，基本上没有背景噪音出现。如图6中所指出的，当表达R或V切割位点的细胞接触激动剂时，观察到了响应。图7显示瞬时和稳定表达GPCR-luc234V233和/或Arr-TEV的细胞中萤光素酶活性的依赖剂量的响应。

实施例4

图8显示，5小时或1小时的培养时间已足以分析蛋白质-蛋白质相互作用。图中清楚地显示了剂量响应关系。

通过使烟草蚀刻病毒蛋白酶A与ADRB2的C端融合并用zeocin选择标记(Invitrogen Cat #43-0018)将融合的基因插入pcDNA3.1(+)，从而构建了ADRB2-TEV融合基因表达质粒。利用本领域已知的适当模板通过PCR生成了所有的DNA片段。

通过使重排的萤光素酶luc234X233与β抑制蛋白2的C端融合，构建了β抑制蛋白2-重排的萤光素酶(Arr-luc234X233)融合基因表达质粒。TEV蛋白酶切割位点是ENLYFQ/X，(Rachel B.Kapust，et al.Biochemical & Biophysical Research Communications，294(2002)949-955)，其中E和Q一般是不变的，其中X可为任何氨基酸，尽管G和S是在该切割位点常见的氨基酸。切割发生在Q和X残基之间。X可决定切割的效率。在某些实施方案中，TEV萤光素酶切割位点被包括在重排的萤光素酶中。利用简单的常规实验可改善背景和信/噪比。例如，经发现，在某些应用中，在TEV的X水解位点用缬氨酸代替甘氨酸可降低背景。使用一种新霉素选择标记(Invitrogen)在pcDNA3.1(+)中克隆了融合的融合基因。

利用适当的市售的转染试剂盒，以ADRB2-TEV和Arr-luc234V233质粒共转染HEK293细胞，其中TEV识别序列为ENLYFQV(SEQ IDNO：12)。转染48小时后，用不同浓度的ADRB2激动剂异丙肾上腺素处理细胞1小时和5小时，然后向细胞中加入Bright-GLO^TM(Promega)，并在EnVison II^TM上记录了相对发光单位。用异丙肾上腺素培养1小时和5小时后，观察到了剂量依赖的发光活性。

实施例5

图9左边显示，稳定表达Arr-luc234V233以及瞬时表达ADRB2-TEV融合蛋白的HEK293细胞中配体诱导的萤光素酶活性。右边显示，CHO细胞中抑制蛋白报道分子活化蛋白质构建体的稳定表达和7TMR-蛋白酶融合物的瞬时表达。

在HEK293或CHO细胞中，产生了表达GPCR-luc234R233或Arr-TEV的稳定细胞系。在一个12孔板上用Lipofectamine以每种DNA 20ng/孔对HEK293和TranIT-CHO细胞进行转染。

在per-luc分析中，通常使用384孔板。其它板形式也是可接受的形式。将稳定表达GPCR-luc234R233或Arr-TEV的CHO细胞以每孔10,000个细胞接种在一个用组织培养物处理过的表面384孔白色分析板(BectonDickinson)上。第二天，细胞用浓度为10μM至0.7pM的激动剂处理(在无血清的细胞培养基中按3∶1系列稀释)。使用Steady-Glo Luciferase AssaySystem(Promega)来测量萤光素酶的活性。经过2小时激动剂处理后，抽掉培养液并向每孔中加入25μl萤光素酶分析试剂。相对发光单位(RLU)用Perkin Elmer公司的多标签读数仪EnVision读取。数据用PRISM软件绘图并分析。

通过选择对新霉素的耐受性而生成稳定表达Arr-luc234V233的HEK293细胞。耐受新霉素的基因存在于Arr-luc234V233表达质粒载体pcDNA3.1中。

实施例6

图9右边显示CHO细胞系中异丙肾上腺素对剂量的响应。

在CHO细胞中，产生了表达GPCR-luc234R233或Arr-TEV的稳定细胞系。利用TransfectIT-CHO转染试剂盒(Mirus Bio，Madison，WI)在一个12孔板上以每孔每种DNA 1μg进行转染。从转染物中按照对新霉素和zeomycin的选择性收获了单个菌落。

利用适当的市售的转染试剂盒，用ADRB2-TEV质粒转染了Arr-luc234V233稳定表达细胞。用异丙肾上腺素培养瞬时表达ADRB2-TEV和稳定表达Arr-luc-234V233的细胞2小时，然后向细胞中加入Bright-GLO^TM萤光素酶试剂。在EnVison II上记录剂量依赖的萤光素酶活性。

实施例7

图10显示用GPCR Per-Luc分析对激动剂、部分激动剂、拮抗剂以及非特异性内源受体响应的评估。

利用Lopofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)以ADRB2-TEV质粒转染了稳定表达Arr-luc234V233的HEK293细胞。转染48小时后，用不同浓度的已知激动剂异丙肾上腺素；部分激动剂BRL37344(Sigma-Aldrich)、拮抗剂ICI118551(ICI)、带有200nM异丙肾上腺素的拮抗剂ICI118551，以及HEK293内源EDG受体的激动剂S1P(鞘氨醇-1-磷酸酯)培养细胞2小时，然后向细胞中加入Bright-GLO^TM萤光素酶试剂。在EnVison II上记录剂量依赖的萤光素酶活性，如图10所示。

该分析的EC50和IC50值与FLIPR和cAMP分析所得的值类似。HEK293细胞中的内源受体EDG及其配体S1P不影响萤光素酶活性，而其它分析，如FLIPR和cAMP却产生阳性信号。激动剂异丙肾上腺素产生了一种响应。部分激动剂BRL37344产生了一种逐渐变化的响应。拮抗剂ICI18551抑制了异丙肾上腺素，但是单独没有活性。因此，本发明的分析方法是特异的，如图10(与其它可比的数据结合考虑)所示，产生较少的和较低的假阳性信号。

实施例8

图14显示一个实施例，其中利用一个TEV蛋白酶识别位点ENLYFQX并用V作为X，通过将萤火虫萤光素酶N端氨基酸2到456克隆到C端氨基酸234到550的后面，从而构建了一个重排的萤光素酶。该重排的萤光素酶(luc234V456)被融合到GPCR即ADRB2的C端，以产生GPCR-重排的萤光素酶构建体，ADRB2-luc234V456表达质粒。

利用适当的模板通过PCR生成了所有的DNA片段。用一种新霉素选择标记(Invitrogen)在pcDNA3.1(+)中克隆了ADRB2-luc234V456融合基因。

利用适当的市售的转染试剂盒，以ADRB2-luc234V456和Arr-TEV质粒共转染CHO-K1细胞。转染后48小时，用或不用10μM ADRB2激动剂异丙肾上腺素处理细胞2小时，向细胞中加入了Bright-GLO^TM或Steady-GLO^TM(Promega)并用适当的发光读出仪记录了相对发光。针对不同剂量的异丙肾上腺素，观察到了重构的萤光素酶活性。

根据对新霉素的耐受性而选择稳定表达Arr-luc234V233的HEK293细胞。耐受新霉素的基因存在于Arr-luc234V233表达质粒载体pcDNA3中。观察到了响应激动剂的萤光素酶活性。

实施例9

图13显示V2反向激动剂的剂量依赖性。

本实施例中，利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)以V2-TEV质粒转染了稳定表达Arr-luc234V233的HEK293细胞。转染48小时后，使用不同浓度的经标准方法分析被认为是拮抗剂的化合物SR121463(sanofi Recherché，Toulouse，FR)培养细胞2小时。将Bright-GLO^TM萤光素酶加入细胞。在EnVison II上记录剂量依赖的萤光素酶活性。随着SR121463(更适当地定义为反向激动剂)量的增加，发光水平也增加。

本分析中，反向激动剂表现出激动剂的行为，如同其它反向激动剂一样。现已了解，反向激动剂可阻断V2G蛋白质的信号通路，而促进β抑制蛋白介导的MAPK的活化(Azzi et al.，PNAS，2003，100：11406-11411)。因此，本发明的这一分析方法可表明G蛋白偶联受体独特的活性构象。

相反，在经典的分析体系中，GPCR的反向激动剂表现出拮抗剂的行为。这是因为反向激动剂可能结合到并稳定了GPCR的G蛋白信号的非活性构象。但是，某些反向激动剂既能稳定GPCR的非活性形式进行G蛋白信号传递，也能促进将β抑制蛋白募集到GPCR以活化β抑制蛋白信号途径。

实施例10

图6显示激动剂诱导的萤光素酶活性。

本实施例中，通过重排萤火虫萤光素酶N端氨基酸2至233以及逆序的C端氨基酸234至550而构建重排的萤光素酶，中间被一个TEV蛋白酶识别位点ENLYFQX隔开。位置X可以是任何氨基酸。已知这一位置的氨基酸决定TEV蛋白酶的识别亲和力和切割效率。然后，该重排的萤光素酶(luc234X233)被融合到GPCR即ADRB2的C端，以产生GPCR-重排的萤光素酶，即ADRB2-lucluc234X233表达质粒。

通过使烟草蚀刻病毒蛋白酶A与β抑制蛋白2的C端融合而构建了人类β抑制蛋白2-TEV融合质粒。利用适当的模板通过PCR生成了DNA片段。用新霉素选择标记(Invitrogen)，将GPCR-luc234X233融合基因在pcDNA3.1(+)中亚克隆，用zeocin选择标记，将Arr-TEV融合基因在pcDNA3.1(+)(Invitrogen Cat.#43-0018)中亚克隆。

利用适当的市售的转染试剂盒，以ADRB2-luc234R233和Arr-TEV质粒共转染CHO-K1细胞。转染48小时后，用或不用10μM ADRB2激动剂异丙肾上腺素处理细胞2小时，向细胞中加入Bright-GLO^TM或Steady-GLO^TM(Promega)并用适当的发光读出仪记录了相对发光。在异丙肾上腺素存在的情况下，观察到发光活性增加了三倍以上。

实施例11

图12显示了使用本发明(左面)和另一种测定法(右面)的激动剂、拮抗剂、和反向激动剂的结果。两个图显示了激动剂、拮抗剂和反向激动剂的区别和逆效应。本发明的方法提供了很好的比活性。

实施例12

图7显示带有ADRB2-重排的萤光素酶和Arr-TEV的CHO细胞。左图的ADRB2-luc234V233数据经过处理包含TEV识别位点ENLYFQV。利用适当的市售的转染试剂盒，以ADRB2-luc234V233和Arr-TEV质粒共转染CHO-K1细胞。转染48小时后，用不同浓度的ADRB2激动剂异丙肾上腺素处理细胞2小时，向细胞中加入Bright-GLO^TM或Steady-GLO^TM(Promega)并用适当的发光读出仪记录相对发光。

实施例13

图7的右面总结了使用带有不同切割位点的稳定转染细胞的数据。结果和左面的类似。因此，具有不同切割位点的两种GPCR-萤光素酶构建体对激动剂均有响应。

实施例14

图6显示比较X为R和X为V时的激动剂诱导的信号活性。结果是类似的，表明X通常可以改变。

本实施例中，通过重排萤火虫萤光素酶N端氨基酸2至233以及逆序的C端氨基酸233至550而构建重排的萤光素酶，中间被一个TEV蛋白酶识别位点ENLYFQ/X隔开。位于X的可以是任何决定TEV蛋白酶识别亲和力和切割效率的氨基酸。显示了V和R。该重排的萤光素酶(luc234X233)被融合到GPCR即ADRB2的C端，以产生GPCR-重排的萤光素酶，即ADRB2-lucluc234X233表达质粒。

本实施例中，通过使烟草蚀刻病毒蛋白酶A与β抑制蛋白2的C端融合而构建了人类β抑制蛋白2-TEV融合质粒。利用适当的模板通过PCR生成了所有的DNA片段。使用新霉素选择标记，GPCR-luc234X233融合基因亚克隆在pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中，使用zeocin选择标记，Arr-TEV融合基因亚克隆在pcDNA3.1(+)中(Invitrogen Cat.#43-0018)。

利用适当的市售的转染试剂盒，以ADRB2-luc234R233和Arr-TEV质粒共转染CHO-K1细胞。48小时后，用或不用10μM ADRB2激动剂处理细胞2小时，向细胞中加入了Bright-GLO^TM或Steady-GLO^TM(Promega)并用适当的发光读出仪记录了相对发光。在异丙肾上腺素存在的情况下，观察到发光活性增加了三倍以上。

实施例15

图11左面显示瞬时表达V2-TEV的细胞中8-AVP激动剂的结果。

本实施例中，利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)以V2-TEV质粒转染稳定表达Arr-luc234V233的HEK293细胞。48小时后，用不同浓度的激动剂8-AVP(Arg⁸加压素，一种已知的V2加压素受体的激动剂)培养细胞2小时，并向细胞中加入Bright-GLO^TM萤光素酶试剂。在EnVison II上记录剂量依赖的萤光素酶活性。

实施例16

利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)以V2-TEV质粒转染了稳定表达Arr-luc234V233的HEK293细胞。48小时后，用不同浓度的反向激动剂培养细胞2小时，并向细胞中加入Bright-GLO^TM萤光素酶试剂。在EnVison II上记录剂量依赖的萤光素酶活性。

本分析中，反向激动剂表现出激动剂的行为。现已了解，某些反向激动剂可阻断V2G-蛋白质的信号通路，而促进β抑制蛋白介导的MAPK的活化(Azzi et al.，PNAS，2003，100：11406--11411)。因此，本分析可以评估G蛋白偶联受体的独特的活性构象。

实施例17

图11右面显示通过促进β抑制蛋白与V2受体的相互作用，V2反向激动剂产生的依赖于剂量的萤光素酶活性。

本实施例中，利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)以V2-TEV质粒转染稳定表达Arr-luc234V233的HEK293细胞。48小时后，用不同浓度的反向激动剂培养细胞2小时，并向细胞中加入Bright-GLO^TM萤光素酶试剂。在EnVison II上记录剂量依赖的萤光素酶活性。

本发明的其它特点对于本领域熟练技术人员而言是很清楚的，无需在此赘述。本领域技术人员可进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。

本文引用的所有文献均通过引用以其整体纳入本文。

序列表

<110>H·埃辛德雷罗

     蔡济东

     P·S·怀特

     P·韦森瑟

<120>鉴别调节蛋白质-蛋白质之间相互作用的分子

<130>US2006/244

<160>15

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>烟草蚀刻病毒

<400>1

ggatccgcag agttgatcat catagtc                          27

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>烟草蚀刻病毒

<400>2

gggcccctat tgcgagtaca ccaattcatt c                     31

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>烟草蚀刻病毒

<220>

<221>SITE

<222>(7)..(7)

<223>改变TEV蛋白酶识别的肽。图5中X是S、R或V。

<400>3

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Xaa

1                5

<210>4

<211>1237

<212>DNA

<213>人1型腺病毒

<400>4

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<210>5

<211>1110

<212>DNA

<213>智人

<400>5

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<210>6

<211>951

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>萤光素酶

<400>6

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<210>7

<211>696

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>萤光素酶

<400>7

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<210>8

<211>1363

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>萤光素酶

<400>8

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<210>9

<211>726

<212>DNA

<213>烟草蚀刻病毒

<400>9

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<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>TEV识别位点

<400>10

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1               5

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>TEV蛋白酶的识别位点

<400>11

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<210>12

<211>7

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>TEV蛋白酶的识别位点

<400>12

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Val

1               5

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>裂解位点的DNA/V

<400>13

gagaacctgt acttccaggt c                                21

<210>14

<211>7

<212>PRT

<213>人造的

<220>

<223>识别位点

<400>14

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Arg

1               5

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>识别位点

<400>15

gagaacctgt acttccagcg c                                21