一种黑曲霉发酵玉米黄粉制备可溶性玉米肽的方法

（一）        技术领域

    本发明属于食品生物化工技术领域，特别涉及一种黑曲霉发酵玉米黄粉制备可溶性玉米肽的方法。

（二）        背景技术

玉米蛋白粉是玉米加工淀粉过程中的主要副产物，虽然玉米蛋白粉中的蛋白质含量高达60%以上，但是由于其具有特殊的气味和色泽，口感粗糙，水溶性差以及严重缺乏赖氨酸、色氨酸等人体必须氨基酸致使其一般只能用作廉价的饲料，利用效率很低。虽然如此，玉米蛋白含有植物蛋白中少见的高比例亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸等疏水性氨基酸以及高含量的支链氨基酸和中性氨基酸，正是这种不平衡的氨基酸组成使得玉米蛋白成为生理活性肽的来源。

玉米活性肽是以玉米蛋白粉为原料，经水解得到的分子量很小，但活性很高的肽段分子组成的混合物，相对于氨基酸或蛋白质而言，玉米活性肽更易于人体吸收，并且在大范围pH下完全溶于水，无浑浊现象和沉淀物产生，去除了不良风味和过敏成分等。此外，玉米活性肽的热稳定性很好，组分不改变，功能不丧失，且无毒副作用，是一种安全可靠的天然食品蛋白。实验研究表明，玉米蛋白经酶解后制得的玉米活性肽具有抗高血压、促进酒精代谢、防治肝性脑病、抗氧化，抗疲劳等生理功能，因此，玉米活性肽是一种安全稳定且性能良好的生理活性肽。

玉米活性肽良好的溶解性使其改善了玉米蛋白质的许多不良性质，并表现出高浓度、低黏度、稳定性高等许多优良特性，利用此性质可以将其应用到如高蛋白流体食品等普通营养食品中；同时可以利用其抗高血压、促进酒精代谢、抗氧化、抗疲劳等生理功能，开发成运动饮料、醒酒饮料等功能饮料及其他功能性食品。随着科技的发展，人们生活水平的提高及保健意识的增强，玉米活性肽的药食同源性将更加显示出其广阔的应用前景。

黑曲霉，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，其产物对人体安全无害，是重要的发酵工业菌种。

目前，一般多采用酶法生产玉米肽，用于玉米蛋白水解的酶，仅限于少数几种微生物蛋白酶、动物蛋白酶和植物蛋白酶。植物蛋白酶如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等效率低，受外界环境因素影响大，成本高，不适合工业化生产；动物蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶等虽酶解效果好，但是价格太高，副反应多，同样也不适合工业化生产；微生物蛋白酶酶解效果较好，副反应少，但是价格相对较高，酶解产物在很大程度都存在着苦味问题，还需进行脱苦工艺。而微生物发酵法生产玉米多肽不需要蛋白酶的提取过程，而是直接利用微生物在生长过程中产生的各种酶类，此酶系非单一蛋白酶而是多种蛋白酶混合的复合酶系，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶等一系列蛋白酶。同时通过微生物作用对某些苦味肽基团进行修饰和重组，使小肽之间、小肽与氨基酸之间发生移接、重排，制得的玉米蛋白肽基本无苦味和异味，且具有溶解性好、口感好、溶解粘度小、受热不凝固、安全性强等优点，这样不需要添加脱苦设备，简化生产工艺，可有效的降低生产成本，且在营养价值上也具有较大的潜能。

（三）        发明内容

    本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种工艺简单、副产物少、产品水溶性高的黑曲霉发酵玉米黄粉制备可溶性玉米肽的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种黑曲霉发酵玉米黄粉制备可溶性玉米肽的方法，以黑曲霉发酵玉米黄粉为原料，主要包括如下步骤：

（1）往玉米黄粉中添加碱性盐浸泡、离心洗涤、烘干去除脂肪，然后将玉米黄粉配置成悬浮液，添加耐高温α-淀粉酶酶解，离心洗涤后烘干；

（2）将经过前处理的玉米黄粉与麸皮、蔗糖、K₂HPO₄和蒸馏水混合制成固态发酵培养基，在固态发酵培养基内接入活化的黑曲霉，于24~42℃下发酵培养2~5天；

（3）将发酵完全的培养基加入蒸馏水浸提后，进行离心处理得到上清液即为发酵液粗品，发酵液粗品采用中空纤维柱过滤截流，得到的滤液用活性炭进行脱色，然后浓缩、分离、得到玉米肽溶液，最后经蒸发浓缩、冷冻干燥得到固体玉米肽粉末。

本发明的创新之处在于使用黑曲霉进行固态发酵制备可溶性玉米肽，采用固态发酵在培养过程中无需震荡培养，培养条件相较于液态发酵简单，可以大大提高产物的反应效率、降低成本，玉米活性肽的转化率达到约22.151%，本发明制备的玉米肽的分子量主要集中在1517～6228。

固态发酵是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔的固态基质中含有水和水不溶性物质并存。与其他培养方式相比，固态发酵具有如下优点：（1）培养基简单，且来源广泛；（2）投资少，能耗低，技术较简单；（3）产物的产率较高；（4）基质含水量低，可大大减少生物反应器的体积，不需要废水处理，环境污染较少，后处理加工方便；（5）发酵过程一般不需要严格的无菌操作，更利于工业化生产。

本发明的更优方案为：

步骤（1）中，往每克玉米黄粉中添加16ml浓度为40g/L的Na₂CO₃，于40℃下浸泡10min后离心洗涤5次，将其置于50℃烘箱内烘干；将玉米黄粉与水按1:5的固液比配制成悬浮液，添加5%耐高温α-淀粉酶，置于60℃、150rpmin摇床中酶解，然后经离心洗涤10次，再置于50℃烘箱内烘干。

对原料进行预处理的目的在于，去除原料中的脂肪和淀粉，以减少玉米肽产品中脂含量和糖含量，使得玉米肽产品能更好地好呈现粉末状。

步骤（2）中，所述活化黑曲霉所采用的种子培养基的组成为0.2gNaNO₃、0.1gK₂HPO₄、0.05gKCl、0.05gMgSO₄、0.001gFeSO₄、3.0g蔗糖、100mL蒸馏水，自然pH值，于121℃、0.25MPa条件下灭菌20min。凉至室温后，加入3~4环黑曲霉AS3.350斜面菌种，在30℃、220rpm条件下活化36h。

所述固态发酵培养基的组成为1.00g蔗糖、0.04g K₂HPO₄、10~19g经前处理的玉米黄粉、1~10g麸皮、30~65%蒸馏水，起始pH为3.0~7.0；活化黑曲霉在固态发酵培养基中，于33℃下发酵培养84h。

所述固态发酵培养基的优选组成为1.00g蔗糖、0.04g K₂HPO₄、17g经前处理的玉米黄粉、3g麸皮、50%蒸馏水，起始pH为5.5。

发酵条件的优化： 

（1）含水量的优化：比较各培养基中含水量质量分数范围为30%～70%时，其他条件相同的情况下，含水量为50%时，所得玉米肽的转化率最高。

（2）配料比的优化：比较各培养基中玉米黄粉与麸皮的质量比范围为10:10~19:1时，其他条件相同的情况下，玉米黄粉与麸皮的质量比为17:3时，所得玉米肽的转化率最高。

（3）起始pH值的优化：比较各培养基中起始pH值范围为3.0~7.0时，其他条件相同的情况下，起始pH值为5.5时，所得玉米肽的转化率最高。

（4）发酵温度的优化：比较各培养基置于不同培养温度，范围为24~42℃，其他条件相同的情况下，培养温度为33℃时，所得玉米肽的转化率最高。

（5）发酵时间的优化：比较各培养基发酵时间不同，范围为48~120h，其他条件相同的情况下，发酵培养84h时，所得玉米肽的转化率最高。

在单因素实验的基础上，选取对玉米肽转化率影响较大的4个因素，设计4因素3水平的正交实验，因素和水平如下表所示，优化出黑曲霉固态发酵玉米黄粉制备可溶性玉米肽的最佳工艺条件：发酵温度为33℃，发酵时间84h，含水量50%（水占培养基的质量比），配料比（玉米黄粉与麸皮的质量比）17:3，以此理论最佳组合在最佳pH值5.5条件下进一步实验，得到肽转化率为22.151%。

步骤（3）中，所述发酵液粗品采用截流分子质量10⁴u的中空纤维柱过滤截流，脱色后的滤液浓缩至蛋白质浓度为20ng/ml，后经柱层析分离，得到玉米肽溶液，经50℃、80r/min旋转蒸发浓缩，后经冷冻干燥得到固体玉米肽粉末。

本方法具有工艺简单、成本低廉、副产物少，同时所得玉米肽水溶性高、安全性好等优点。在试验中，比较了枯草芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉三种菌种发酵制备玉米可溶性玉米肽，发现采用黑曲霉发酵相较于其他两种菌种所得玉米肽的转化率最高；而且，黑曲霉是重要的发酵工业菌种，其产物对人体安全无害。得到的玉米活性肽可作为添加剂应用到保健食品、医药等领域。

（四）        具体实施方式

实施例1：

（1）原料前处理  称取2份50g玉米黄粉分装在2个1000mL烧杯中，分别加入800mL 16mL/g Na₂CO₃溶液中40℃下浸泡10min，离心洗涤，滤渣置于50℃烘箱内烘干。此后，按照玉米黄粉与水的固液比为1:5的比例配制悬浮液，添加5%耐高温ɑ-淀粉酶，置于60℃、150r/min摇床中酶解，直至加入碘液不变蓝为酶解完全。后经离心洗涤10次，再将玉米黄粉置于50℃烘箱内烘干。

（2）发酵培养  精确称取蔗糖1g，K₂HPO₄ 0.04g，玉米黄粉（脱淀粉后）与麸皮的质量比为16:4（共20g），水的添加量为培养基总质量的53%（质量比），于250mL三角瓶中，121℃下灭菌30min。冷却后接入经活化的黑曲霉，置于31℃霉菌培养箱内培养84h。发酵完全后，加水浸提，离心得到玉米活性肽溶液粗品。测定其肽转化率为18.695%。

（3）玉米肽的分离纯化

发酵液粗品采用截留分子质量10⁴u的中空纤维柱过滤截留，得分子量在10⁴u以下的滤液。利用活性炭将滤液进行脱色处理，再将脱色后的滤液进行浓缩至20mg/mL（蛋白质浓度），后经 Sephadex G-25柱层析分离，分离条件：上样浓度10mg/mL，上样量1 mL，流速0.5 mL/min，得到玉米肽活性成分。将得到的玉米肽溶液经50℃、80r/min旋转蒸发浓缩，后经冷冻干燥得到固体玉米肽粉末。

实施例2：

（1）原料前处理  称取2份50g玉米黄粉分装在2个1000mL烧杯中，分别加入800mL 16mL/g Na₂CO₃溶液中40℃下浸泡10min，离心洗涤，滤渣置于50℃烘箱内烘干。此后，按照玉米黄粉与水的固液比为1:5的比例配制悬浮液，添加5%耐高温ɑ-淀粉酶，置于60℃、150r/min摇床中酶解，直至加入碘液不变蓝为酶解完全。后经离心洗涤10次，再将玉米黄粉置于50℃烘箱内烘干。

（2）发酵培养  精确称取蔗糖1g，K₂HPO₄ 0.04g，玉米黄粉（脱淀粉后）与麸皮的质量比为18:2（共20g），水的添加量为培养基总质量的53%（质量比），于250mL三角瓶中，121℃下灭菌30min。冷却后接入经活化的黑曲霉，置于33℃霉菌培养箱内培养90h。发酵完全后，加水浸提，离心得到玉米活性肽溶液粗品。测定其肽转化率为22.151%。

（3）玉米肽的分离纯化

发酵液粗品采用截留分子质量10⁴u的中空纤维柱过滤截留，得分子量在10⁴u以下的滤液。利用活性炭将滤液进行脱色处理，再将脱色后的滤液进行浓缩至20mg/mL（蛋白质浓度），后经 Sephadex G-25柱层析分离，分离条件：上样浓度10mg/mL，上样量1 mL，流速0.5 mL/min，得到玉米肽活性成分。将得到的玉米肽溶液经50℃、80r/min旋转蒸发浓缩，后经冷冻干燥得到固体玉米肽粉末。

实施例3：

（1）原料前处理  称取2份50g玉米黄粉分装在2个1000mL烧杯中，分别加入800mL 16mL/g Na₂CO₃溶液中40℃下浸泡10min，离心洗涤，滤渣置于50℃烘箱内烘干。此后，按照玉米黄粉与水的固液比为1:5的比例配制悬浮液，添加5%耐高温ɑ-淀粉酶，置于60℃、150r/min摇床中酶解，直至加入碘液不变蓝为酶解完全。后经离心洗涤10次，再将玉米黄粉置于50℃烘箱内烘干。

（2）发酵培养  精确称取蔗糖1g，K₂HPO₄ 0.04g，玉米黄粉（脱淀粉后）与麸皮的质量比为18:2（共20g），水的添加量为培养基总质量的47%（质量比），于250mL三角瓶中，121℃下灭菌30min。冷却后接入经活化的黑曲霉，置于31℃霉菌培养箱内培养78h。发酵完全后，加水浸提，离心得到玉米活性肽溶液粗品。测定其肽转化率为19.339%。

（3）玉米肽的分离纯化

发酵液粗品采用截留分子质量10⁴u的中空纤维柱过滤截留，得分子量在10⁴u以下的滤液。利用活性炭将滤液进行脱色处理，再将脱色后的滤液进行浓缩至20mg/mL（蛋白质浓度），后经 Sephadex G-25柱层析分离，分离条件：上样浓度10mg/mL，上样量1 mL，流速0.5 mL/min，得到玉米肽活性成分。将得到的玉米肽溶液经50℃、80r/min旋转蒸发浓缩，后经冷冻干燥得到固体玉米肽粉末。

实施例4：

（1）原料前处理  称取2份50g玉米黄粉分装在2个1000mL烧杯中，分别加入800mL 16mL/g Na₂CO₃溶液中40℃下浸泡10min，离心洗涤，滤渣置于50℃烘箱内烘干。此后，按照玉米黄粉与水的固液比为1:5的比例配制悬浮液，添加5%耐高温ɑ-淀粉酶，置于60℃、150r/min摇床中酶解，直至加入碘液不变蓝为酶解完全。后经离心洗涤10次，再将玉米黄粉置于50℃烘箱内烘干。

（2）发酵培养  精确称取蔗糖1g，K₂HPO₄ 0.04g，玉米黄粉（脱淀粉后）与麸皮的质量比为16:4（共20g），水的添加量为培养基总质量的47%（质量比），于250mL三角瓶中，121℃下灭菌30min。冷却后接入经活化的黑曲霉，置于35℃霉菌培养箱内培养90h。发酵完全后，加水浸提，离心得到玉米活性肽溶液粗品。测定其肽转化率为18.892%。

（3）玉米肽的分离纯化

发酵液粗品采用截留分子质量10⁴u的中空纤维柱过滤截留，得分子量在10⁴u以下的滤液。利用活性炭将滤液进行脱色处理，再将脱色后的滤液进行浓缩至20mg/mL（蛋白质浓度），后经 Sephadex G-25柱层析分离，分离条件：上样浓度10mg/mL，上样量1 mL，流速0.5 mL/min，得到玉米肽活性成分。将得到的玉米肽溶液经50℃、80r/min旋转蒸发浓缩，后经冷冻干燥得到固体玉米肽粉末。

实施例5：

（1）原料前处理  称取2份50g玉米黄粉分装在2个1000mL烧杯中，分别加入800mL 16mL/g Na₂CO₃溶液中40℃下浸泡10min，离心洗涤，滤渣置于50℃烘箱内烘干。此后，按照玉米黄粉与水的固液比为1:5的比例配制悬浮液，添加5%耐高温ɑ-淀粉酶，置于60℃、150r/min摇床中酶解，直至加入碘液不变蓝为酶解完全。后经离心洗涤10次，再将玉米黄粉置于50℃烘箱内烘干。

（2）发酵培养  精确称取蔗糖1g，K₂HPO₄ 0.04g，玉米黄粉（脱淀粉后）与麸皮的质量比为17:3（共20g），水的添加量为培养基总质量的50%（质量比），于250mL三角瓶中，121℃下灭菌30min。冷却后接入经活化的黑曲霉，置于31℃霉菌培养箱内培养90h。发酵完全后，加水浸提，离心得到玉米活性肽溶液粗品。测定其肽转化率为19.837%。

（3）玉米肽的分离纯化

发酵液粗品采用截留分子质量10⁴u的中空纤维柱过滤截留，得分子量在10⁴u以下的滤液。利用活性炭将滤液进行脱色处理，再将脱色后的滤液进行浓缩至20mg/mL（蛋白质浓度），后经 Sephadex G-25柱层析分离，分离条件：上样浓度10mg/mL，上样量1 mL，流速0.5 mL/min，得到玉米肽活性成分。将得到的玉米肽溶液经50℃、80r/min旋转蒸发浓缩，后经冷冻干燥得到固体玉米肽粉末。

实施例6：

（1）原料前处理  称取2份50g玉米黄粉分装在2个1000mL烧杯中，分别加入800mL 16mL/g Na₂CO₃溶液中40℃下浸泡10min，离心洗涤，滤渣置于50℃烘箱内烘干。此后，按照玉米黄粉与水的固液比为1:5的比例配制悬浮液，添加5%耐高温ɑ-淀粉酶，置于60℃、150r/min摇床中酶解，直至加入碘液不变蓝为酶解完全。后经离心洗涤10次，再将玉米黄粉置于50℃烘箱内烘干。

（2）发酵培养  精确称取蔗糖1g，K₂HPO₄ 0.04g，玉米黄粉（脱淀粉后）与麸皮的质量比为18:2（共20g），水的添加量为培养基总质量的50%（质量比），于250mL三角瓶中，121℃下灭菌30min。冷却后接入经活化的黑曲霉，置于33℃霉菌培养箱内培养78h。发酵完全后，加水浸提，离心得到玉米活性肽溶液粗品。测定其肽转化率为20.513%。

（3）玉米肽的分离纯化

发酵液粗品采用截留分子质量10⁴u的中空纤维柱过滤截留，得分子量在10⁴u以下的滤液。利用活性炭将滤液进行脱色处理，再将脱色后的滤液进行浓缩至20mg/mL（蛋白质浓度），后经 Sephadex G-25柱层析分离，分离条件：上样浓度10mg/mL，上样量1 mL，流速0.5 mL/min，得到玉米肽活性成分。将得到的玉米肽溶液经50℃、80r/min旋转蒸发浓缩，后经冷冻干燥得到固体玉米肽粉末。

实施例7：

（1）原料前处理  称取2份50g玉米黄粉分装在2个1000mL烧杯中，分别加入800mL 16mL/g Na₂CO₃溶液中40℃下浸泡10min，离心洗涤，滤渣置于50℃烘箱内烘干。此后，按照玉米黄粉与水的固液比为1:5的比例配制悬浮液，添加5%耐高温ɑ-淀粉酶，置于60℃、150r/min摇床中酶解，直至加入碘液不变蓝为酶解完全。后经离心洗涤10次，再将玉米黄粉置于50℃烘箱内烘干。

（2）发酵培养  精确称取蔗糖1g，K₂HPO₄ 0.04g，玉米黄粉（脱淀粉后）与麸皮的质量比为17:3（共20g），水的添加量为培养基总质量的53%（质量比），于250mL三角瓶中，121℃下灭菌30min。冷却后接入经活化的黑曲霉，置于35℃霉菌培养箱内培养78h。发酵完全后，加水浸提，离心得到玉米活性肽溶液粗品。测定其肽转化率为19.145%。

（3）玉米肽的分离纯化

发酵液粗品采用截留分子质量10⁴u的中空纤维柱过滤截留，得分子量在10⁴u以下的滤液。利用活性炭将滤液进行脱色处理，再将脱色后的滤液进行浓缩至20mg/mL（蛋白质浓度），后经 Sephadex G-25柱层析分离，分离条件：上样浓度10mg/mL，上样量1 mL，流速0.5 mL/min，得到玉米肽活性成分。将得到的玉米肽溶液经50℃、80r/min旋转蒸发浓缩，后经冷冻干燥得到固体玉米肽粉末。