双膦酸盐类药物的离子色谱分离积分脉冲安培法检测分析的方法

技术领域

本发明涉及双膦酸盐类药物(包括阿仑膦酸、帕米膦酸、伊班膦酸和利塞膦 酸)的离子色谱分离分析方法，特别涉及等度分离积分脉冲安培检测分析的双膦 酸盐类药物的离子色谱分离积分脉冲安培检测分析方法。

背景技术

双膦酸盐是一类广泛用于治疗骨骼病症的化合物，包括恶性高钙血症，骨质 疏松和佩吉特氏病。该类化合物是具有P-C-P结构，两个磷酸基团之间连接一个 碳原子。双膦酸如阿仑膦酸钠、帕米膦酸、伊班膦和利塞膦酸钠均为极性化合物。 这使得其在非极性固定相如C18或C8柱上很难保留，由于缺乏生色基团，没有 紫外吸收和荧光不容易检出。因为其挥发性低，且有离子的性质，易导致峰展宽 和峰不对称，不适合用气相色谱(GC)分析。液相色谱(LC)检测大部分采用 柱前或柱后衍生反应。衍生化反应的缺点包括其步骤复杂，耗费时间，其衍生物 是可能不稳定。

发明内容

本发明正是针对现有技术、方法存在的不足，提供一种双膦酸盐类药物的离 子色谱分离积分脉冲安培检测分析方法，此方法既能保证分析效果，又能简化工 艺流程，不需衍生即可进行测定。

本发明的具体技术方案如下：

本发明一种双膦酸盐类药物的离子色谱分离积分脉冲安培检测分析方法，包 括以下步骤：

(1)实际样品处理：血浆用出离子水稀释后加入乙腈沉淀蛋白，混合旋涡1min， 在离心机上以1000转/分离心10min，吸取上清液在氮气流下30℃左右蒸 发近干，残留物用水稀释装载到固相萃取柱上，洗脱后样品通过0.45μm 滤膜过滤；

(2)基线测绘：将配制的洗脱液用泵输入色谱分离柱使其达到平衡，从色谱分 离柱输出的洗脱液流入电导流通池，由电化学检测器转化为电信号，从而形 成基线被测绘；

(3)进样和离子交换：被测试样在碱性洗脱液的推动下进入色谱分离柱产生离 子交换；

(4)洗脱：将洗脱液连续输入色谱分离柱中，不断将双膦酸盐在色谱分离柱上 展开，各离子产生差速迁移而相互分离，在不同的保留时间被洗脱；

(5)电化学检测分析：从色谱分离柱输出的双膦酸溶液通过电化学检测池经过 电化学检测器转化为电信号，从而形成谱图被记录。

本发明所述的双膦酸盐为阿仑膦酸，洗脱液为24mM NaOH溶液，采用等 度洗脱。

本发明所述的双膦酸盐为帕米膦酸，洗脱液为24mM NaOH溶液，采用等 度洗脱。

本发明所述的双膦酸盐为伊班膦酸，洗脱液为24mM NaOH溶液，采用等 度洗脱。

本发明所述的双膦酸盐为利塞膦酸，洗脱液为24mM NaOH溶液，采用等 度洗脱。

本发明所述的分离柱为Dionex AG18(50mm×2mm)和AS18(250mm× 2mm)阴离子交换柱，进样量为10μL。

本发明积分脉冲安培检测波形为：T1：0.00-0.04s，E1的范围为-0.4到 -0.15V；T1：0.05-0.21s，E2的范围为-0.25到-0.05V；T3：0.22-0.46s，E3的范围 为0.15到0.30V；T4：0.47-0.56s，E4＝-0.15V；T5：0.57-0.58s，E5＝-2.00V；T6： 0.59s，E6＝0.6V，积分区间：0.21-0.56s。

本发明具有以下有益效果：

1.对双膦酸盐药物能进行良好的分离分析，保留时间、峰高、峰面积的相对 标准偏差均小于2.0％，最低检测限可达到10^-6g/L，在0.02-0.80μg/mL浓度范围内， 峰高对浓度、峰面积对浓度呈良好的线性关系，相关系数在0.997以上；

2.分析时，将试样直接注入离子色谱分离柱分离，从色谱分离柱输出的双膦 酸盐溶液通过电化学检测池经过电化学检测器就能获得高灵敏度的谱图，使工艺 流程大为简化；

3.本方法可用于血液样品中的双膦酸盐药物含量的检测。

附图说明

图1是根据本发明提供的方法获得的阿仑膦酸、帕米膦酸、伊班膦酸和利塞 膦酸混合标准溶液色谱图；图中标记为，(1)是帕米膦酸，(2)是阿仑膦酸，(3)是伊 班膦酸，(4)利塞膦酸；

图2是根据本发明提供的方法获得的人体血浆加标实际样品中双膦酸盐类药 物含量检测的色谱图；图中标记为，(1)是帕米膦酸，(2)是阿仑膦酸，(3)是伊班膦 酸，(4)是利塞膦酸。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步具体说明：

工艺步骤依次包括实际样品处理、测绘、进样和离子交换、洗脱、积分脉冲 安培检测分析：

(1)实际样品处理：血浆用出离子水稀释后加入乙腈沉淀蛋白，混合旋涡1min， 在离心机上以1000转/分离心10min，吸取上清液在氮气流下30℃左右蒸 发近干，残留物用水稀释装载到固相萃取柱上，洗脱后样品通过0.45μm 滤膜过滤；

(2)基线测绘：将配制的洗脱液用泵输入色谱分离柱使其达到平衡，从色谱分 离柱输出的洗脱液流入电导流通池，由电化学检测器转化为电信号，从而形 成基线被测绘；

(3)进样和离子交换：被测试样在碱性洗脱液的推动下进入色谱分离柱产生离 子交换；

(4)洗脱：将洗脱液连续输入色谱分离柱中，不断将双膦酸盐在色谱分离柱上 展开，各离子产生差速迁移而相互分离，在不同的保留时间被洗脱；

(5)电化学检测分析：从色谱分离柱输出的双膦酸溶液通过电化学检测池经过 电化学检测器转化为电信号，从而形成谱图被记录。

分析上述双膦酸盐类药物溶液时，分离柱为Dionex AG18(50mm×2mm)和 AS18(250mm×2mm)阴离子交换柱，进样量为10μL，洗脱液为24mMNaOH溶 液，采用等度洗脱，优化后的积分脉冲安培检测波形为：T1：0.00-0.04s，E1＝-0.3V； T1：0.05-0.21s，E2＝-0.15V；T3：0.22-0.46s，E3＝0.22V；T4：0.47-0.56s，E4＝-0.15V； T5：0.57-0.58s，E5＝-2.00V；T6：0.59，E6＝0.6V，积分区间：0.21-0.56s。

下面结合附图详细说明本发明：

实施例：

本实施例是对人体血浆加标双膦酸盐类药物含量进行分析检测

使用仪器：DX-600离子色谱仪(戴安，美国)，GP50梯度泵，LC25色 谱柱温箱和ED50A电化学检测器；DionexAG18(50mm×2mm)和AS18 (250mm×2mm)阴离子交换柱，10μL定量环；流速：0.25mL/min；柱温： 30℃；进样量：10μL；

检测方式：积分脉冲安培检测，波形设置：T1：0.00-0.04s，E1＝-0.3V； T1：0.05-0.21s，E2＝-0.15V；T3：0.22-0.46s，E3＝0.22V；T4：0.47-0.56s， E4＝-0.15V；T5：0.57-0.58s，E5＝-2.00V；T6：0.59，E6＝0.6V，积分区间： 0.21-0.56s。

数据处理：Chrome 6.8的变色龙软件；

洗脱液：24mM NaOH溶液；

分析步骤：

(1)实际样品处理：血浆用出离子水稀释后加入乙腈沉淀蛋白，混合 旋涡1min，在离心机上以1000转/分离心10min，吸取上清液在氮气流下 30℃左右蒸发近干，残留物用水稀释装载到固相萃取柱上，洗脱后样品通 过0.45μm滤膜过滤；

(2)基线测绘：将混合配制的洗脱液用泵输入色谱分离柱使其达到平 衡，从色谱分离柱输出的洗脱液流入电导流通池，由电化学检测器转化为 电信号，从而形成基线被测绘；

(3)进样和离子交换：被测试样在碱性洗脱液的推动下进入色谱分离 柱产生离子交换；

(4)洗脱：将洗脱液连续输入色谱分离柱中，不断将双膦酸盐在色谱 分离柱上展开，各离子产生差速迁移而相互分离，在不同的保留时间被洗 脱；

(5)电化学检测分析：从色谱分离柱输出的双膦酸溶液通过电化学检 测池经过电化学检测器转化为电信号，从而形成谱图被记录，所测绘的谱 图1是根据本发明提供的方法获得的阿仑膦酸、帕米膦酸、伊班膦酸和利塞 膦酸混合标准溶液色谱图；图中标记为，(1)是帕米膦酸，(2)是阿仑膦酸， (3)是伊班膦酸，(4)利塞膦酸；图2是根据本发明提供的方法获得的人体血浆 加标实际样品中双膦酸盐类药物含量检测的色谱图；图中标记为，(1)是帕 米膦酸，(2)是阿仑膦酸，(3)是伊班膦酸，(4)是利塞膦酸。

分析结果：

三次重复进样后阿仑磷酸钠、帕米膦酸钠、伊班膦酸钠和利塞膦酸钠的加标 回收率为88.37％-97.32％，相对标准偏差为1.46％-2.13％。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精 神和权力要求保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保 护范围。