在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病 毒2型核衣壳蛋白的方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)由Tischer于1974年在连续传代的PK15 细胞株(PK15 ATCC CCL31)中首次发现，当时被认为是一种无致病性的细胞污 染物，随后即被证实是一种无囊膜、直径为17nm的新病毒。这种圆环病毒广泛 存在于PK15细胞中且不引起猪的临床症状，因而被称为猪I型圆环病毒 (PCV1)。断奶后仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)于1991年首先发现于加拿大西部，到1994年已广泛流行于 该国，现已在美洲和欧洲的许多国家和地区流行，亚洲地区的印度、日本、韩 国、菲律宾、中国台湾省等也有此病的报道。PMWS主要感染7～15周龄猪， 患猪表现为渐进性消瘦，淋巴结肿大，皮肤苍白或有黄疸等症状；猪群发病率 为5～50％，死亡率接近100％，严重威胁世界各国的养猪业。现已证实该病是 由一种致病性猪圆环病毒引起的，并将该圆环病毒命名为猪II型圆环病毒 (PCV2)。我国朗洪武等于1999年在北京、河北等地某些猪场中也检测到猪 圆环病毒的存在，此后国内许多实验室也相继检测到该病毒。

两型猪圆环病毒在分类上属于圆环病毒科，被列入该科的既有动物病毒，也有 植物病毒。PCV1基因组全长1759bp，PCV2基因组全长1768bp(或1767bp)。 PCV1与PCV2型内的同源性都在90％以上，但两型间同源性小于80％。已有研 究表明，两型PCV的基因组均含有11个潜在的开放阅读框架(Open reading frame，ORF)。其中ORF1、2、3、6和7具有一定的同源性，而其余ORF无 任何同源性。ORF1、2为两个主要的ORF，对其功能研究较为清楚。ORF1编 码与病毒复制相关的Rep蛋白；ORF2编码的蛋白为病毒的主要结构蛋白-核衣 壳蛋白，具有较好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣 壳蛋白的方法。

在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法的步骤为：

1)猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆；

2)含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的 构建；

3)将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液 中加入MG132；

4)继续培养48小时后，通过抑制蛋白酶体的活性，稳定真核细胞中的猪 圆环病毒2型核衣壳蛋白，收集细胞，免疫印迹检测表达蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型 核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型SX04株全基因组序 列的克隆步骤为：收集SX0株感染仔猪的淋巴结组织，抽提病毒基因组DNA， 用长距离精确PCR扩增基因组DNA全长，克隆于pGEM-T easy，获得重组载 体pGEM-T-PCV，并行序列测定，测定的序列在GenBank登录号为AY604430.1。

所述的含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒 pCI-PCVCapHA的构建步骤为：根据猪圆环病毒2型SX04株基因组序列， GenBank登录号：AY604430.1，设计核衣壳蛋白基因上下游引物：pcvCapNhe： CGACGCT AGCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTAC，pcvCapMlu： CTACGCGTTTAAGCG TAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGGGTTAAGTGGCGGGTCTTTAA；并在蛋 白C端引入HA序列，作为蛋白标记，将获得的核衣壳蛋白基因，通过NheI和 MluI连接入pCI-Neo真核表达质粒pCI-PCVCapHA，并进行序列测定。

所述的将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培 养液中加入MG132步骤为：pCI-PCVCapHA质粒在脂质体Lipofectamine 2000 介导下，转染猪肾细胞PK5，在转染后24小时，在细胞培养上清液中，加入 MG132，浓度为5nM。

本发明相对于普通的真核表达方法，该方法可有效稳定真核细胞中的PCV2 核衣壳蛋白。转染后72小时的蛋白免疫印迹检测显示，本专利使用的方法，可 最高提高PCV2核衣壳蛋白的表达量在20倍左右。

附图说明

图1是本发明提供的猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆过程示意图。

图2是本发明提供的含有猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白基因的真核表达 质粒的构建示意图。

图3是本发明提供的将上述质粒(pCI-PCVCapHA)转染猪肾细胞PK15，转染 后24小时，在细胞培养液中加入MG132示意图。

图4是本发明提供的继续培养48小时后，收集细胞，免疫印迹检测表达蛋白示 意图。

图5是本发明提供的，相对于普通的真核表达方法，在细胞培养液中加入 MG132，可有效稳定真核细胞中的PCV2核衣壳蛋白，并提高蛋白产量在20倍 左右。

图6是本发明提供的pCI-PCVCapHA和pUBR7共转染PK15细胞的示意图。

图7是本发明提供的泛素蛋白的表达，可抑制PCV2核衣壳蛋白在PK15细胞的 表达产量。

具体实施方式

在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法的步骤为：

1)猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆；

2)含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的 构建；

3)将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液 中加入MG132；

4)继续培养48小时后，通过抑制蛋白酶体的活性，稳定真核细胞中的猪 圆环病毒2型核衣壳蛋白，收集细胞，免疫印迹检测表达蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型 核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型SX04株全基因组序 列的克隆步骤为：收集SX0株感染仔猪的淋巴结组织，抽提病毒基因组DNA， 用长距离精确PCR扩增基因组DNA全长，克隆于pGEM-T easy，获得重组载 体pGEM-T-PCV，并行序列测定，测定的序列在GenBank登录号为AY604430.1。

所述的含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒 pCI-PCVCapHA的构建步骤为：根据猪圆环病毒2型SX04株基因组序列， GenBank登录号：AY604430.1，设计核衣壳蛋白基因上下游引物：pcvCapNhe： CGACGCT AGCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTAC，pcvCapMlu： CTACGCGTTTAAGCG TAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGGGTTAAGTGGCGGGTCTTTAA；并在蛋 白C端引入HA序列，作为蛋白标记，将获得的核衣壳蛋白基因，通过NheI和 MluI连接入pCI-Neo真核表达质粒pCI-PCVCapHA，并进行序列测定。

所述的将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培 养液中加入MG132步骤为：pCI-PCVCapHA质粒在脂质体Lipofectamine 2000 介导下，转染猪肾细胞PK5，在转染后24小时，在细胞培养上清液中，加入 MG132，浓度为5nM。

实施例1：

本实施例描述了本发明提供的猪圆环病毒2型(PCV 2)SX04株全基因组 序列的克隆的整个实验过程如图1所示。

称取适量病料(腹股沟淋巴结、肺门淋巴结和颈部淋巴结等)，加入适当体 积的组织裂解缓冲液进行匀浆；将组织匀浆分装到1.5ml eppendorf管中，室 温，3000g离心10min；取上清加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，55℃裂解 3h；加入等体积的酚/氯仿，上下颠倒混匀，4℃，12000g离心10min；取上清 置一新的1.5ml eppendorf管中；取上清置一新的1.5ml eppendorf管中，加 入2倍体积冰冷无水乙醇(其中含1/10体积的3M NaAc)，上下颠倒混匀，-20 ℃，40min，沉淀DNA；4℃，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70％的乙醇洗 涤一次；4℃，12000g离心5min，弃上清，沉淀于室温干燥后，溶于30μl的TE 溶液中(PH8.0)。

根据已发表的PCV2序列(GenBank序列号AF027217)设计引物(见表1)。 以上引物由上海博亚生物技术有限公司合成，用前溶解于灭菌超纯水中至终浓 度15μmol/ml，-20℃保存备用。

表1猪圆环病毒基因组DNA扩增用引物序列

按照Roche公司Expand High Fidelity PCR System的操作指南进行PCR反应， 以抽提的病毒DNA为模板，PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性15sec， 58℃退火45sec，68℃延伸2min；循环30次，72℃延伸10min。反应完毕后取 1～21％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到约1800bp的DNA条带。

割胶回收PCR产物直接连接到pGEM-T easy载体(Promega公司)上。具 体按照说明书进行，在0.5ml离心管中，依次加入以下试剂：2×Buffer 5μl， pGEM-T easy 1μl，回收的PCR产物4μl，T4DNA liagase 1μl，室温连接1h， 转化大肠杆菌HD5α，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取单菌落，以LB培养 基过夜扩大培养，抽提质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定。为进一步证实序列的 正确性，选3个独立的阳性克隆进行测序。测序用引物步进法，在ABI3730测 序仪上进行。对测序正确的克隆分别命名为pGEM-T-PCV，GenBank登录号为 AY604430.1。

实施例2：

本实施例描述了本发明提供的含有猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白基 因的真核表达质粒的构建。如图2所示

跟据PCV2SX04株基因组序列，设计特异性引物(表2)，并在蛋白C端 引入HA标记，用于蛋白的检测。

表2猪圆环病毒核衣壳蛋白基因扩增用引物序列

按照Roche公司Expand High Fidelity PCR System的操作指南进行PCR反应， 以抽提的病毒DNA为模板，PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性15sec， 58℃退火45sec，68℃延伸2min；循环30次，72℃延伸10min。反应完毕后取 1～21％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到约720bp的PCV2核衣壳蛋白基因。

以Nhe I和Mlu I分别双酶切上述PCR产物和真核表达质粒pCI-neo (Promega公司)，并回收线性DNA片段，在DNA连接酶作用下，连接上述各 种DNA片断，最终获得真核表达质粒pCI-PCVCapHA。

实施例3：

本实施例描述了本发明提供的将pCI-PCVCapHA质粒转染猪肾细胞PK15， 转染后24小时，在细胞培养液中加入MG132。如图3所示。

按试剂盒说明书，以QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit抽提pCI-PCVCapHA 转染级超纯质粒。在脂质体Lipofectamine 2000介导下，以pCI-PCVCapHA转染 80％融合度的PK15细胞(1号和2号孔)，同时设仅转染脂质体的对照组(3 号孔)。用于转染及相关试验的PK15细胞在6孔板上培养。转染24小时后，更 换细胞培养液，并在1号孔培养液中加入MG132(蛋白酶体抑制剂， )，浓度为5nm；在2号孔培养液中加入DMSO，浓度为1ul/ml。3 号孔为阴性对照。继续培养48小时。

实施例4：

本实施例描述了本发明提供的继续培养48小时后，收集细胞，免疫印迹检 测表达蛋白的方法。

将实施例3中的细胞继续培养48小时后，吸弃细胞培养上清，并刮取细胞， 用PBS离心(2000rpm)清洗3遍。以200ul 1×的蛋白电泳上样缓冲液，重悬细 胞，并以7.5号针头/1ml注射器抽吸缓冲液8-10次。将样品置于95℃变性15 分钟后，以Bio-Red mini蛋白电泳系统，恒压150V电泳90分钟。进行 SDS-PAGE电泳。

待电泳结束后，通过Bio-Red mini系统，将SDS-PAGE上的蛋白电转移 至PVDF膜上，具体条件为恒压150V电泳50分钟。转移完毕将PVDF膜放在 5％脱脂奶粉中37℃封闭2h；以抗HA单克隆抗体和鼠抗Tubulin单克隆抗体为 混合一抗，用2％脱脂奶粉，37℃反应(慢慢摇)1.5h；反应完毕用TBST清洗 5次，每次37℃慢摇5min；以HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，用2％脱脂奶 粉，37℃慢摇45min；反应完毕用TBST清洗5次，每次37℃慢摇5min；以胶 片自显影的方式，将免疫印迹信号转移至胶片底片，并显影固定，用于长期保 存。

如图4显示，在转染了pCI-PCVCapHA的PK15细胞培养液中，加入MG132 (5nm)后，通过抑制蛋白酶体的活性，可有效提高PCV2核衣壳蛋白的稳定性 并提高蛋白的表达产量(泳道1)。

如图5所示，以细胞骨架蛋白Tubulin为内参，进行的免疫印迹信号强度分 析表明，本发明表述的蛋白表达方法，在有效稳定细胞中PCV2核衣壳蛋白的 基础上，可提高蛋白表达产量在20倍左右(泳道3、5的平均值，相对于泳道4 的蛋白条带信号)。

上述结果提示，PCV2核衣壳蛋白在细胞内极其不稳定，表达获得的蛋白通 过泛化途径快速降解。

实施例5：

本实施例描述了本发明提供的竞争性抑制泛素蛋白，可有效提高PCV 2核 衣壳蛋白在PK15细胞中的表达产量。

按试剂盒说明书，以QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit抽提pCI-PCVCapHA 和pUBR7(竞争性抑制泛素基因质粒dominant-negative ubiquitin.The Journal of Virology，2010，84(2)：1206-11)转染级超纯质粒。在脂质体Lipofectamine 2000介 导下，以pCI-PCVCapHA和pUBR7共转染，或者pCI-PCVCapHA和pUb-flag (泛素基因)共转染80％融合度的PK15细胞。用于转染及相关试验的PK15 细胞在6孔板上培养。转染48小时后，吸弃细胞培养上清，并刮取细胞，用PBS 离心(2000rpm)清洗3遍。以200ul 1×的蛋白电泳上样缓冲液，重悬细胞，并 以7.5号针头/1ml注射器抽吸缓冲液8-10次。将样品置于95℃变性15分钟后， 以Bio-Red mini蛋白电泳系统，恒压150V电泳90分钟。进行SDS-PAGE电 泳。如图6所示。

待电泳结束后，通过Bio-Red mini系统，将SDS-PAGE上的蛋白电转移 至PVDF膜上，具体条件为恒压150V电泳50分钟。转移完毕将PVDF膜放在 5％脱脂奶粉中37℃封闭2h；以抗HA单克隆抗体和鼠抗Tubulin单克隆抗体为 混合一抗，用2％脱脂奶粉，37℃反应(慢慢摇)1.5h；反应完毕用TBST清洗 5次，每次37℃慢摇5min；以HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，用2％脱脂奶 粉，37℃慢摇45min；反应完毕用TBST清洗5次，每次37℃慢摇5min；以胶 片自显影的方式，将免疫印迹信号转移至胶片底片，并显影固定，用于长期保 存。

如图7泳道5所示，在Pk15细胞中，共转染竞争性抑制泛素基因pUBR7 可显著提高PCV2核衣壳蛋白的表达量。而pCI-PCVCapHA和pUb-flag(泛素 基因)共转染，则不能改善PCV2核衣壳蛋白的稳定性(泳道4)。上述结果进 一步验证了通过抑制细胞泛化途径，可提高PCV2核衣壳蛋白的稳定性和表达 产量。

PCV2 SX04株基因组全长序列如下(GenBank登录号AY604430.1)。

0001 accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca

0061 agaagaatgg aagaagcgga ccccaacccc ataaaaggtg ggtgttcact ctgaataatc

0121 cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg atcttccaat atccctattt gattatttta

0181 ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt

0241 ttgtgaagaa gcagactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg

0301 agaaagcgaa aggaacagat cagcagaata aagaatactg cagtaaagaa ggcaacttac

0361 tgatggagtg tggagctcct agatctcagg gacaacggag tgacctgtct actgctgtga

0421 gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg

0481 tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg

0541 attggaagac taatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg

0601 ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg

0661 atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccctggg

0721 atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg

0781 tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact

0841 cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tttatcggag gattacttcc ttggtatttt

0901 ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc

0961 catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt

1021 ttttattatt cattaagggt taagtggggg gtctttaaga ttaaattctc tgaattgtac

1081 atacatggtt acacggatat tgtattcctg gtcgtatata ctgttttcga acgcagtgcc

1141 gaggcctacg tggtctacat ttccagcagt ttgtagtctc agccacagct gatttctttt

1201 gttgtttggt tggaagtaat caatagtgga atctaggaca ggtttggggg taaagtagcg

1261 ggagtggtag gagaagggct gggttatggt atggcgggag gagtagttta cataggggtc

1321 ataggtgagg gctgtggcct ttgttacaaa gttatcatct agaataacag cactggagcc

1381 cactcccctg tcaccctggg tgatcgggga gcagggccag aattcaacct taacctttct

1441 tattctgtag tattcaaagg gcacagagcg ggggtttgag ccccctcctg ggggaagaaa

1501 gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag ggcgttttga ctgtggttcg

1561 cttgatagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg aagatgccat ttttccttct

1621 ccagcggtaa cggtggcggg ggtggaggag ccaggggcgg cggcggagga tctggccaag

1681 atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctc cttggatacg tcatatctga

1741 aaacgaaaga agtgcgctgt aagtatt