去甲肾上腺素完全抗原的制备方法及偶联摩尔比测定方法

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体的是说一种去甲肾上腺素（以下简 称NE）完全抗原的制备方法以及测定去甲肾上腺素完全抗原中NE与载 体的偶联摩尔比的方法。

技术背景

去甲肾上腺素（Norepinephrine，也称Noradrenaline，缩写NE或NA） ，旧称“正肾上腺素”，学名1-(3,4-二羟苯基)-2-氨基乙醇，是肾上 腺素去掉 N-甲基后形成的物质，在化学结构上也属于儿茶酚胺。它 既是一种神经递质，主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末 梢合成和分泌，是后者释放的主要递质;也是一种激素，由肾上腺髓质 合成和分泌，但含量较少。

多巴、多巴胺、肾上腺素与去甲肾上腺素等统称为儿茶酚胺类物质， 它们都是由酪氨酸衍生而来的系列物。儿茶酚胺作为神经递质和激素 ，与人们的健康与疾病有密切关系，它们不仅直接参与行为活动以及 参与血压、心率、呼吸和睡眠等植物神经功能的调控，而且还与一些 功能性疾病如神经分裂症、忧郁症以及器质性病变的出现有关。血浆 及尿中儿茶酚胺的浓度水平可用于诊断高血压、嗜铬细胞瘤及成神经 细胞瘤等病症,因而准确测定人体生物样品中儿茶酚胺类物质代谢浓度 的变化,在疾病的诊断和治疗中具有重要的意义。目前,人体液和组织 中儿茶酚胺类物质的不同分析方法,包括高效液相色谱法、毛细管电泳 法、质谱法、电化学法、化学发光法、荧光光度法等。

NE的免疫学检测方法不仅方法简便，成本低廉，不需要高精密的仪器 ，而且检测的灵敏度都不亚于高效液相色谱法；但建立高效免疫学检 测方法的关键是需要高品质的抗体，高品质抗体的前提是制备免疫原 型较强的完全抗原，而众所周知，NE是小分子结构，激发不 了动物机体产生抗体，因此，研究人员需要提供一种简单可靠的方法 ，以获得一种能够高效激发动物机体产生抗体的完全抗原。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种制备方法简单、生 产周期短，生产成本低的用于NE的免疫学检测方法的免疫原型强的完 全抗原。

技术方案包括下述步骤，

（1）将NE与载体分别溶于NaAc溶液中，分别制备NE溶液及载体溶液， 然后将两者混合后加入甲醛溶液并调节pH值在6.0－6.5（优选6）之间 ，4℃持续搅拌下进行偶联反应20－28小时（优选24小时），得到反应 混合液。

（2）反应混合液通过超滤、透析或者脱盐柱法除去反应混合液中未偶 联上的小分子物质,缓冲液采用pH为7.2的0.01M磷酸盐缓冲液（PBS） ，得到偶联物。

（3）按照步骤（1）和步骤（2）的方法，反应体系缺失NE，维持其他 各反应条件不变的条件下，制得载体mannich对照。

（4）采用紫外分光光度计对载体、载体mannich对照、NE标准品及偶 联物在200-500nm之间进行扫描，在同坐标上进行图形比对，在偶联物 与载体mannich对照蛋白浓度相同的情况下，如果偶联物比载体manni ch对照多出特征吸收峰，则判定偶联成功，即得到NE完全抗原。

所述步骤（1）中，所述载体为含有游离氨基的生物大分子，具体为牛 血清白蛋白或卵清白蛋白或血蓝蛋白。

所述步骤（1）中，将NE与载体分别溶于1.2mol/L NaAc溶液中,分别 制备34mmoL/L NE溶液和3.4mmoL/L载体溶液，按照NE与载体摩尔比1 0-20：1（优选10：1）的比例，将NE溶液缓慢加入到载体溶液中，缓 慢滴加，边滴加边搅拌，混匀后制成混合溶液，然后在搅 拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，滴加完以 后，用1.2mol/L NaAc溶液调节pH值在6.0-6.5之间，4℃持续搅拌， 反应20－28小时，得到反应混合液。

所述将NE溶液缓慢加入到载体溶液中，滴加速度为1-2毫升/分，边滴 加边搅拌，搅拌速度为100-150转/分。

所述在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液， 搅拌速度为100-150转/分，滴加速度为1-2毫升/分。

通过摩尔消光系数法计算NE完全抗原中NE与蛋白载体的偶联摩尔比， 首先，采用紫外分光光度扫描得到NE完全抗原在200-500nm之间两个特 征吸收峰为λ1和λ2，其中λ1为载体的特征吸收峰，λ2为NE完全抗 原特有的吸收峰，公式如下：

[A _{NE完全抗原λ1}/ ?_NEλ2]/[( A_{NE完全抗原λ1}- A_{NE完全抗原λ2}×?_NEλ1/ ?_NEλ2)/ ?_载体λ1]

其中，

A_{NE完全抗原λ2}：NE完全抗原在λ2的吸光度；

A_{NE完全抗原λ1}：NE完全抗原在λ1的吸光度；

?_NEλ2：NE在λ2处的摩尔消光系数；

?_NEλ1：NE在λ1处的摩尔消光系数；

?_载体λ2：载体在λ2处的摩尔消光系数；

?_载体λ1：载体在λ1处的摩尔消光系数。

mannich法的原理是含有α-活泼氢的醛、酮与甲醛及胺(伯胺、仲胺或 氨)反应，结果一个α-活泼氢被胺甲基取代，此反应又称为胺甲基化 反应，所得产物称为Mannich碱(见图1)。发明人依据mannich法的原理 和NE的结构特征，运用mannich法将NE与载体偶联，制备完全抗原（图 2）。基于上述原理，进一步的，为了达到高效偶联，发明人对NE与载 体的偶联工艺进行了设计，NE与载体摩尔比控制在10-20:1为好，过高 则干扰偶联反应的动态平衡,后期去除也比较困 难，过低则影响偶联效果和偶联的摩尔比；并且NE溶液和载体溶液的 混合过程以缓慢滴加并配合搅拌的方式为好，这样可以避免反应物聚 集沉淀问题的发生，同理，在NE溶液和载体溶液混合后，再在搅拌下 缓慢滴加甲醛溶液，是为了防止三者同时混合而出现的局部反应不均 匀的 ，造成反应产物聚集沉淀的   问题。所述偶联反应应该在 低温下进行，优选为4℃，且应该保持搅拌速度在100-150转/分。

通过控制上述偶联反应的工艺条件，并且再经过超滤、透析或者脱盐 柱法除去反应混合液中未偶联上的小分子物质（如未偶联上的NE、甲 醛、NaAc等小分子物质），从而达到纯化偶联物的目的，可以得到高 纯度、高品质完全抗原，从而达到高效激发动物机体产生抗体的目的 。所述超滤、透析或者脱盐柱法均为现有技术，具体方法可参见所使 用具体产品的操作手册。

紫外分光光度计能够快速准确的判定偶联是否成功，但出于希望制备 高品质的完全抗原考虑，希望NE与载体的偶联比尽可能的高，此时就 需要一种能够测定偶联物中NE与载体的偶联比的方法，发明人特别采 用摩尔消光系数法计算NE与蛋白载体的偶联摩尔比，通过预先获得λ 1和λ2，再带入公式计算，即可得到偶联摩尔比。

有益效果：

（1）本发明方法制备完全抗原步骤简单、方法易于操作，解决了小分 子结构的NE难以制备完全抗原，无法激发动物机体产生抗体的问题。

（2）由本发明方法制备得到的完全抗原品质高（偶联物的偶联尔摩尔 比可达 4:1以上），免疫动物后从而激发动物产生高品质的抗体。

（3）可以明确鉴定完全抗原合成是否成功，并精确计算小分子与载体 的偶联比，便于制备高品质抗体过程中的质量控制。

附图说明

图1.Mannich反应原理示意图；

图2.载体与去甲肾上腺素(NE)偶联示意图；

图3.分光光度计连续波长扫描载体牛血清白蛋白(以下简称BSA)、BSA  mannich对照、NE和NE完全抗原1（BSA－NE）在200-500nm之间吸收 峰图；

图4.分光光度计连续波长扫描载体卵清蛋白(以下简称OVA)、OVA ma nnich对照、NE和NE完全抗原2（OVA－NE）在200-500nm之间吸收峰图 。

具体实施方式

实施例1：

1  NE与载体BSA偶联

将NE与载体BSA分别溶于1.2mol/L NaAc溶液中,分别制备34mmoL/L去 NE溶液和3.4mmol/L载体溶液，按照NE与载体摩尔比10-20：1的比例， 将NE溶液缓慢加入到载体溶液中，缓慢滴加，边滴加边搅拌（滴加速 度1-2毫升/分,100-150转/分），混匀后制成混合溶液，然后在搅拌下 缓慢滴加（滴加速度1-2毫升/分,100-150转/分）与混合溶液等体积的 体积浓度为3%甲醛溶液，滴加完以后，用1.2mol/L NaAc溶液调节pH 值在6.0-6.5之间，4℃持续搅拌，反应20－28小时，得到反应混合液 。

2  反应混合液的超滤纯化过程

将反应混合液置于Amicon Ultra-4超滤管，以7500g离心力离心10mi n，离心完毕后补加0.01M PBS（pH7.2）至原体积对截留物进行 稀释洗涤，重复以上步骤 7次，最后对所得溶液稀释分装，经冷冻干 燥，即得到偶联物1。

3  BSA mannich对照的制备

按照步骤1和2的方法，反应体系缺失NE，维持其他各反应条件不变的 条件下，制备载体mannich对照，即BSA  mannich对照。

4 偶联物1通过分光光度计扫描鉴定

将偶联物1、NE、BSA mannich对照和载体 BSA调整到相同的浓度（ 1mg/mL），通过200-500nm波长扫描，并在同一坐标绘制曲线图（如图 3）

NE在343nm处有最高吸收峰，载体BSA最高吸收峰在278nm。偶联后的偶 联物1在250nm-450nm范围内有两个紫外特征峰，即λ1=279nm，λ2=4 02nm。其中λ1=279nm为蛋白质的紫外特征吸收峰，即BSA的特征吸收 峰；在偶联物1上没有NE的343nm吸收峰，由于反应过程中NE偶联上蛋 白质后导致其结构的变化使其最大吸收峰偏移至402nm。由以上分析可 知，合成后的溶液体系并不是载体BSA和NE的简单叠加。通过BSA ma nnich对照和BSA峰形的比较，表明在缺失NE的情况下，BSA mannich 对照与BSA吸收峰没有差别，而偶联物1与BSA的峰形差异较大，从而确 证了NE完全抗原1（BSA-NE）制备成功。

NE完全抗原1中 NE与BSA偶联比的计算

参见图3，结果显示， NE完全抗原1在可见光区有明显两个吸收峰（ 279nm和402nm）出现，其中279nm为载体BSA的特征吸收峰，与NE的最 大吸收峰（343nm）相比，NE完全抗原1特有的一个最大吸收峰为402n m。根据可见分光光度法，按以下公式，可以计算出 NE完全抗原1中NE与BSA蛋白的偶联比。

公式：

[A_{NE完全抗原1 402nm}/ ?_NE 402nm]/[( A _{NE完全抗原1 279nm}- A _{NE完全抗原1 402nm}×?_NE 279nm/ ?_NE 402nm)/ ?_BSA 279nm]

A _{NE完全抗原1 402nm}： NE完全抗原1在402nm的吸光度；

A_{NE完全抗原1 279nm}： NE完全抗原1在279nm的吸光度；

?_NE 402nm：NE在402nm处的摩尔消光系数；

?_NE 279nm：NE在279nm处的摩尔消光系数；

?_BSA 402nm：载体BSA在402nm处的摩尔消光系数；

?_BSA 279nm：载体BSA在279nm处的摩尔消光系数。

经过计算， NE完全抗原1中NE与载体BSA的偶联比为4.35:1。

实施例2

与实施例1不同的是，所述载体采用卵清蛋白（以下简称OVA）；所述 步骤（2）中采用对反应混合液进行透析纯化，其方法为：将反应混合 液装入截留为14,000Da的透析袋，封闭袋口，放入0.01M PBS（pH7. 2）溶液中在磁力搅拌器上4℃搅拌，100转/分，每隔3小时，更换0.0 1M PBS（pH7.2）溶液一次，更换5次以后取出透析袋中溶液得到偶联 物2。其余同实施例1。

经分光光度计扫描鉴定同样确证了NE完全抗原2（OVA-NE）制备成功。

NE完全抗原2中NE与OVA偶联比的计算

参见图4，结果显示， NE完全抗原2在可见光区有明显的两个吸收峰 (279nm和402nm)出现，其中279nm为载体的特征吸收峰， NE的最大吸 收峰（343nm）偶联后有偏移现象，偏移至最大吸收峰个 （402nm）。根据可见分光光度法，按以下公式，可以计算出NE完全抗 原2中NE与OVA蛋白的偶联比。

公式：

[A_{NE完全抗原2 402nm}/ ?_NE 402nm]/[( A_{NE完全抗原2  279nm}- A _{NE完全抗原2  402nm}×?_NE 279nm/ ?_NE 402nm)/ ?_OVA 279nm]

A_{NE完全抗原2 402nm}： NE完全抗原2在402nm的吸光度；

A_{NE完全抗原2 279nm}： NE完全抗原2在279nm的吸光度；

?_NE 402nm：NE在402nm处的摩尔消光系数；

?_NE 279nm：NE在279nm处的摩尔消光系数；

?_OVA 402nm：载体OVA在402nm处的摩尔消光系数；

?_OVA 279nm：载体OVA在279nm处的摩尔消光系数。

经过计算， NE完全抗原2中NE与载体_OVA的偶联比为4.85:1。