包含固醇修饰的脂质和纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分的脂质体组合物及其在肺结核诊断中的用途

技术领域

本发明涉及含有固醇修饰的脂质和纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分的脂质体组合 物，其在活动性肺结核的诊断中被用作用于检测抗原特异性生物标志物抗体的抗原呈 递的载体。

背景技术

迄今为止，还没有用于诊断肺外TB、小儿TB和HIV共感染TB的可靠的商业检 测方法。也没有用于诊断TB的可靠的基于血液的方法。目前，所有的商业方法都是 基于血清样品。精确检测低亲合性患者的抗-分枝菌酸(MA)抗体(作为活动性肺结 核的生物标志物)的能力会完全改变现状。这样的方法是存在的，并且被称为分枝菌 酸抗体实时抑制测试(MARTI-测试)(Verschoor et al.,2005,Thanyani et al.,2008, Lemmer et al.,2009)。MARTI-测试能够区分两种低亲合性抗体系统：无所不在的抗- 胆固醇抗体和TB患者特异性抗-MA抗体，其是交叉反应性的。这通过使用表面等离 子体共振(Lemmer et al.,2009)、或电阻抗生物传感器技术(Mathebula et al.,2009)来 实现。本发明本身涉及改善脂质抗原固定化技术以使得其在能够支持MARTI-测试的 任何技术平台上更适合用于实际诊断应用。

TB诊断学

肺结核(TB)是一种由通常感染肺的结核分枝杆菌造成的细菌性疾病。现今，世 界人口的大约三分之一被感染并且每年出现接近两百万例死亡。其是免疫低下个体(例 如HIV患者)的主要死因(Vassall et al.,2011)。肺结核是一种复杂的疾病，其能够诱 发体液和细胞免疫应答。目前，对于活动性肺TB诊断的黄金标准仍然是临床检查与 来自血清的分枝杆菌培养检查联用(Andersen et al.,2000)。这种方法会耗费至少六周 的时间(Van Deun et al.,2010)，在该期间内患者可能已经感染了朋友和家人、同事、 公共交通工具上的乘客和医务人员。对于耐酸细菌(AFB)的涂片显微镜检查更快且 成本更低，但其灵敏度较低，通常仅在晚期成年肺TB患者中显示达到阳性，此时， 该患者已经经受了不可逆的肺部损伤。

HIV共感染和TB诊断

GeneXpert和其他核酸扩增测试(NAATs)对于免疫低下患者(例如那些患有HIV 共感染的患者)的诊断不够灵敏。当患有HIV共感染时，细菌经常会从肺部逃逸，这 导致血清中含有不足以被涂片显微镜、分枝杆菌培养物或甚至是抗原特异性NAATs 检测的细菌数目(Wilson,2005)。

据WHO报告，2009年在南非有超过72％的TB患者为HIV共感染。南非是世界 上TB和AIDS患病率最高的国家(Floyd et al.,2011)，从而极大地降低了GeneXpert 分析的效果。另一种并发症是AIDS和TB之间的拮抗关系，其在至少90％的未经治 疗患者中发生并导致在数月内死亡(WHO 2011,Gandhi et al.,2006)。

肺外TB的诊断

肺外TB的发生是由于淋巴结、胸膜或脑膜组织、中枢神经系统、骨骼和/或关节、 泌尿生殖器官、腹腔、皮肤或其他散播性部位的感染(Steingart et al.,2011)。肺外TB 的诊断遭遇了许多挑战，其尚未由具体的诊断方法获得解决。这就迫使临床医师仅凭 经验对高风险患者开出长期治疗的处方(Rao,2007)，使得这些患者承担可由精确诊 断避免的治疗副作用。由此，很好地解释了对于功能性血清学肺外TB诊断的需求。

小儿TB的诊断

在儿童中的肺结核诊断比在成年患者中更复杂。这是由于在血清样品中通常获得 低细菌负载量。最近于2011年对于GeneXpert系统用于检测小儿TB的能力进行了研 究。结果表明，对于年龄为15岁及以下的涂片呈阴性的儿童，具有98.8％的特异性， 而灵敏度则低至27.8％(Nicol et al.,2011)。这暗示了尽管现代诊断学有所发展，但小 儿TB仍然难以诊断。

免疫分析

抗体免疫分析的基本原理是检测抗体与抗原的结合。免疫分析使用了这样的事实， 即在对外来生物如细菌和病毒的响应中，免疫系统会产生高度特异于几乎无限量的抗 原的抗体。产生这些抗体的目的在于标记将要被破坏的靶细胞。如果能够获得纯化的 抗原，就能够在免疫分析中检测特异于该抗原的抗体。

通常使用的用于免疫分析的形式为混合抗原和抗体，其中之一被标记或附着至表 面。如果抗体识别抗原，则会发生结合。实验证明，该事件以颜色变化、荧光、辐射 发射、凝聚或沉淀的方式被记录下来。由Engvall和Perlmann发明了被称为ELISA的 诊断性免疫分析的重大里程碑(Engvall&Perlmann,1971)。由于其对灵敏度和特异性 的显著改善，继而产生了疾病诊断学中朝着免疫分析方向的重大偏移(Zhou et al., 2011)。然而，迄今为止，WHO通过其对目前市售的测试进行的评价(Steingart et al., 2011)没有发现单独的可靠TB诊断测流免疫测定。作者报道了这些测试持续产生对 于灵敏度和特异性的不一致和不准确的估计。血清中的生物标志物抗体的范围包括感 染早期阶段的IgM至感染后期阶段的IgG。由于IgG和IgM的结合动力学和热力学差 异，产生了血清学诊断装置设计方面的挑战。

生物标志物血清抗体作为诊断指标

许多来自血清的生物标志物抗体已被用于诊断性免疫测定目的，例如，用于多发 性硬化症和克罗恩病的诊断(Dotan et al.,2006)、HIV诊断(Kaufman&Ross,2010)、 系统性红斑狼疮(Liu et al.,2005)、乙型肝炎(He et al.,2003b)、丙型肝炎(Okochi et  al.,1991)和TB(He et al.,2002)的诊断。

生物标志物的发现对于疾病诊断是很重要的(Lescuyer et al.,2007)。一种好的生 物标志物应该是对于疾病高度特异性的，容易检测的并且能够区分感染和未感染的患 者。检测生物标志物抗体而不是检测感染性生物的痕迹的优点在于，抗体可在血清中 自由获得，而微生物能够通过隐藏在细胞和组织中而逃避检测。

低亲合性抗体的激发

早期免疫应答会产生低亲合性IgM抗体，其由于其聚合结构而显示出高结合亲合 力(Liang et al.,2007)。这些初级抗体的检测在用于早期诊断的免疫分析中是很重要的。 ELISA是一种用于检测抗体的低成本且快速方法，其使用洗涤步骤除去未结合的抗体， 但也会除去结合的低亲合性抗体，从而使得偏向于高亲合性抗体的信号升高(Liang et  al.,2007)。这使得低亲合性抗体不可检测。造成检测低亲合性抗体的困难的因素包括 洗涤、缓冲液组分和培养时间(Mire-Sluis et al.,2004)。Lemmer et al.,2009报道了使 用倏逝场生物传感(evanescent field biosensing)成功检测了用于TB诊断的低亲合性 抗-分枝菌酸抗体。这种技术不需要通过洗涤来分离结合的和游离的抗体，并且在抗体 -抗原暴露后不需要信号扩增步骤。

分枝菌酸抗体实时抑制(MARTI)分析

分枝菌酸在磷脂酰胆碱脂质体中累积，该脂质体允许将分枝菌基序呈递到水性外 表面上以用于MARTI诊断程序。该程序的细节能够在Marti专利中找到(Verschoor et  al.,2005)。

MARTI分析的最大优势可能是能够检测低亲合性抗体。事实上，使用SPR的 MARTI在TB诊断学中最有可能是首次检测到低亲合性抗体的分析。使用基于生物传 感器的TB诊断技术已被证实在波导(Thanyani et al.,2008)和SPR(Lemmer et al.,2009) 倏逝场生物传感器中效果良好。

SPR在MARTI分析中的局限性

MARTI分析的局限性包括具有有限的稳定性的脂质体抗原载体，会造成大量的运 行失败。因此，传感器表面的MA抗原涂层的表面化学最优化对于作为诊断性测试的 MARTI分析的可行性而言是至关重要的。

脂质体

Bangham在1961年通过电子显微镜和负染色为证据正式描述了脂质体(Sattler, 2010)。Lemmer et al.(2009)描述了其在用于TB诊断的MARTI测试中作为脂质抗原 载体和呈递分子的应用。将胆固醇加入到脂质体中使得通过增加晶体堆积参数并降低 膜流动性而使膜稳定性增加。胆固醇还减小了与膜的曲率有关的亲水亲油平衡(HLB)。 减小的HLB会导致膜具有较小的曲面，即，较大的尺寸。

亲水亲油平衡(HLB)是从40至1的数量级，其表示体系的表面活性剂是否会允 许形成O/W或W/O乳液(参见图1)。晶体堆积参数(CPP)被定义为v/(l.a₀)，其中 (v＝表面活性剂烃链的偏摩尔体积＝0.027(无Me基团的#C+#Me基团)。l＝表面 活性剂烃链长度＝0.15+0.127#C(或完全延伸长度的70％至80％)且a₀＝最佳头基 面积(optimal head group area)。在CPP较小的情况下，脂质体将具有较小的尺寸，而 当CPP的值大约为1时，在水性环境中可能会形成最大的脂质体。对于同时含有胆固 醇和分枝菌酸的脂质体同样如此。

脂质体的表征是基于包括初始结构、尺寸、稳定性、ζ电位和多分散性指数的方 法以及其是否形成微乳液(如O/W或W/O)。随着对脂质体在体内递送药物的能力的 广泛研究，已经进行了许多研究以解决由pH、温度和离子强度的改变可能带来的脂质 体稳定性、聚集和融合的问题。因此，对于每一项特定应用都需要测量并确定脂质体 的物理稳定性，所述应用包括生物传感器诊断。物理稳定性可通过用光子关联光谱学 来进行研究—通过使用测量颗粒尺寸、多分散性和ζ电位的所谓Zetasizer装置进行测 量(Grohmann et al.,1998)。

颗粒的ζ电位被定义为其在特定基质中所获得的总电荷(Zetasizer Nano应用手册 MRK575-01)。通过电荷排斥防止融合，ζ电位与脂质体稳定性有关(Akashi et al.,1998)。 其发生所依据的理论被称为Deryaguin-Landau-Verwey-Overbeek(DLVO)理论，其中 由范德华相互作用所提供的静电力制造了分离。已经认识到ζ电位是胶体(脂质体) 稳定性的指标(Li&Tian,2002)。分散于水性体系中的大多数颗粒会通过表面基团离 子化或吸附带电物质获得表面电荷。然后，这些表面电荷改变周围离子的分布，导致 该颗粒周围的层不同于本体溶液。如果该颗粒在布朗运动下发生移动(Uhlenbeck& Ornstein,1930)，则该层会作为该颗粒的一部分移动。ζ电位是该层中其运动通过本体 溶液的点处的电位。这通常被称为滑动面。在该面处的电荷对于溶液中离子的浓度和 类型非常敏感(Malvern,2009)。这一技术是基于激光多普勒测速仪(Zetasizer Nano 应用手册MRK575-01)。

可通过动态光散射(DLS)来测量脂质体/颗粒尺寸。其测量由于颗粒的布朗运动 造成的散射光密度的时间依赖性波动。密度波动的分析能够确定扩散系数，该扩散系 数又可被转化为尺寸分布(Zetasizer Nano应用手册MRK575-01)。这种尺寸分布是不 同尺寸范围的量度，被称为多分散性。多分散性最好被显示为高斯分布。这是因为， 在脂质体系统中，脂质体的样品群并不是均一尺寸，但更好地由尺寸分布表示。

通常，MARTI分析使用磷脂酰胆碱(PC)来形成分枝菌酸抗原的脂质体载体的基 本结构。Thanyani et al.(2008)已经提供了这一原则用于TB诊断的证据，他还示出 了脂质体具有有限的稳定性，导致生物传感器结果中较高水平的方差。这种不稳定性 是由于脂质体尺寸随时间的变化。脂质体平均尺寸的增加使得其具有更大的静电能 (Winterhalter&Lasic,1993)。静电能的增加导致ζ电位增加，其是脂质体稳定性的已 知标记(Li&Tian,2002)。在文献中，添加胆固醇已被证明能够使膜稳定(Connor et al., 1984)。胆固醇中的固醇结构是由三个环己烷环和一个环戊烷形成的刚性面，其降低了 磷脂运动性和烃链的振动能。向脂质体体系中添加胆固醇应改善脂质体稳定性，但在 MARTI应用中这是不可行的，因为胆固醇在患者血清中的抗-MA抗体的检测中是反 应性组分。Benadie et al.(2008)证明了患者血清抗体与分枝菌酸和胆固醇的交叉反应 性。需要研究可替代的脂质以使脂质体在MARTI-测试中稳定。

本发明提供了一种稳定的脂质抗原载体和呈递颗粒(presentation particle)，在用于 肺外、儿童或HIV共感染的成人的TB诊断的MARTI测试中允许TB患者抗体对分枝 菌酸抗原进行更好的抗体识别。这是通过将特定固醇修饰的脂质结合到磷脂酰胆碱脂 质体中来实现的。

发明内容

本发明提供了包含固醇修饰的脂质和纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分或其类似物 或衍生物的脂质体组合物。尤其是，本发明提供了用于检测含有抗体的生物样品中的 脂质抗原特异性生物标志物抗体的脂质抗原呈递脂质体组合物，该组合物包括脂质体， 该脂质体包含固醇修饰的脂质和纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分或其类似物或衍生物。

该固醇修饰的脂质可以是固醇修饰的磷脂。更具体地，该固醇修饰的脂质可以是 固醇修饰的磷脂酰胆碱脂质。更加具体地，其可以是固醇修饰的甘油磷脂。

固醇可通过酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或醚键连接于固醇修饰的甘油磷脂的甘油部 分。固醇修饰的脂质可以具有一个或多个C₁₄至C₁₈酰基链。固醇可以是胆固醇。固醇 修饰的脂质尤其可以为1-棕榈酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

该组合物可以含有约20至55摩尔百分比的包含固醇修饰的脂质和纯化的分枝杆 菌脂质细胞壁组分的脂质体和约45至80摩尔百分比的包含磷脂酰胆碱的脂质体。优 选地，该组合物可以含有约35至45摩尔百分比的包含固醇修饰的脂质和纯化的分枝 杆菌脂质细胞壁组分的脂质体，以及约55至75摩尔百分比的包含磷脂酰胆碱的脂质 体。在本发明的实施方式中，可以例如含有约30摩尔百分比的包含固醇修饰的脂质和 纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分的脂质体以及约70摩尔百分比的含有的磷脂酰胆碱 脂质体。

在本发明的实施方式中，提供了一种用于检测含有抗体的生物样品中的脂质抗原 特异性生物标志物抗体的脂质抗原呈递组合物，该组合物包含固醇修饰的脂质、纯化 的分枝杆菌脂质细胞壁组分和磷脂酰胆碱。

该组合物可以包含20至50摩尔百分比的固醇修饰的脂质和纯化的分枝杆菌脂质 细胞壁组分，以及45至80摩尔百分比的磷脂酰胆碱。例如，其可以包含30摩尔百分 比的固醇修饰的脂质、10摩尔百分比的纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分和60摩尔百 分比的磷脂酰胆碱。

纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分可来源于选自致命性分枝杆菌和致病性分枝杆菌 的分枝杆菌。尤其是，纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分或其类似物或衍生物可来源于 结核分枝杆菌。纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分可为选自同质或异质化合物混合物的 形式。

脂质体组合物可以主要由磷脂酰胆碱构成。

固醇修饰的脂质组分可以共价键的方式与固醇部分相连，所述共价键包括酯、碳 酸酯、氨基甲酸酯和醚键。

固醇修饰的脂质组分可以是修饰的甘油磷脂酰胆碱，其具有长度为C₁₄至C₁₈的酰 基链。

在本发明的优选实施方式中，首先将分枝菌酸抗原与磷脂组合物混合，该磷脂组 合物包含约30mol％的固醇修饰的磷脂，以产生具有整合到脂质体磷脂表面层中的分 枝菌酸抗原的脂质体。通常，脂质体组合物的产生涉及磷脂-抗原混合物的超声处理。

根据本发明的另一个方面，提供了一种诊断方法，其中上文中所述的脂质体组合 物提供了分枝杆菌脂质细胞壁抗原呈递的稳定载体，以用于在活动性肺结核的诊断中 检测抗原特异性生物标志物抗体。

该诊断方法可以是修正的分枝菌酸抗体实时抑制(MARTI)测试，其原始描述于 Verschoor J.A.et al.，2005的专利中。

该诊断方法可以在生物传感器上进行，例如表面等离子体共振或电化学阻抗生物 传感器。

根据本发明的第二个方面，提供了一种制备用于检测含有抗体的生物样品中的脂 质抗原特异性生物标志物抗体的脂质抗原呈递脂质体组合物的方法，该方法包括以下 步骤：将固醇修饰的脂质和纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分或其类似物或衍生物混合， 以产生具有整合到脂质体表面层中的分枝菌酸抗原的脂质体。

脂质抗原呈递脂质体组合物可以为如前文中所描述的。

根据本发明的另一个方面，提供了检测抗原特异性生物标志物抗体以用于诊断活 动性肺结核的方法，该方法包括以下步骤：

提供包含脂质体的脂质抗原呈递脂质体组合物，如前文中所描述的，该脂质体 包含固醇修饰的脂质和纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分或其类似物或衍生物；

固定化该脂质体以产生包含纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分或其类似物或衍 生物的固定化的分枝菌酸抗原；

从疑似患有活动性肺结核的人或动物获得第一、第二和第三样品，其中每一个 样品可含有针对该抗原的抗体，通过稀释使第一样品的浓度低于第二和第三样品的浓 度；

使第一样品的一部分暴露于测试容器中的固定化的分枝菌酸抗原；

使第一样品的一部分暴露于对照容器中的固定化的分枝菌酸抗原；

使第二样品暴露于在第一步骤中提供的脂质抗原呈递脂质体组合物；

使第三样品暴露于不含有分枝菌酸抗原的脂质体；

在被暴露于在第一步骤中提供的含有分枝菌酸抗原的脂质体组合物之后，向测 试容器加入第二样品；

在被暴露于不含有分枝菌酸的脂质体之后，向对照容器加入第三样品；

实时检测测试容器和对照容器中抗体与分枝菌酸抗原的结合；以及

比较测试容器和对照容器的结合程度或范围，测试容器中的结合较弱是该样品 中存在针对分枝菌酸抗原的抗体的指征，其表示作为该样品来源的人或动物患有活动 性肺结核。

可在活化表面上进行固定化脂质体以产生包含纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分的 固定化的分枝菌酸抗原。该活化表面可以是亲水性的、未衍生化的生物传感器比色皿 表面。

该方法可以包括使用选自表面等离子体共振生物传感器和电阻抗生物传感器的生 物传感器。电阻抗生物传感器可以包括丝网印刷的电极。尤其是，可使用修正的分枝 菌酸抗体实时抑制(MARTI)程序来进行该方法。

将第一制剂暴露在其中的测试容器和对照容器中含有分枝菌酸抗原的脂质体组合 物可以是固定化的分枝菌酸抗原。固定的方法可以包括本领域技术人员已知的方法。 优选地，可将该含有分枝菌酸抗原的脂质体组合物固定在活化表面上。在本发明的优 选实施方式中，该活化表面可以是亲水性的、未衍生化的生物传感器表面。

人或动物来源的第一、第二和第三制备样品优选来源于原始样品，在稀释前将原 始样品至少分为第一、第二和第三制备物。

在测试容器和对照容器中将人或动物来源的第一制备物暴露于分枝菌酸抗原可以 包括使人或动物来源的该样品制备物暴露于通过事先用分枝菌酸抗原和适合的封闭试 剂涂覆的表面。通常，这样的封闭试剂为皂苷或酪蛋白(casein)。

检测抗体和/或其他物质与分枝菌酸抗原的结合可以在自动化设备中进行。

检测抗体和/或其他物质与分枝菌酸抗原的结合可以实时进行。

附图说明

现在通过举例的方式参照以下非限制性实施例和附图来说明本发明，其中：

图1示出了亲水亲油平衡(HLB)和与磷脂膜的曲率相关的晶体堆积参数(CPP) 之间的关系；随着HLB从左至右下降，CPP值增加；球形代表磷脂的亲水性头部， 而圆柱形代表磷脂的疏水性尾部；附图标记1示出了紧密堆积的磷脂，其在水性 环境中有可能形成小的脂质体，附图标记2示出了具有较大疏水性部分的中等尺 寸脂质体，其在水性环境中有可能形成大的脂质体，而附图标记3示出了亲脂性 部分在油包水乳液中的取向；图的左侧示出了形成小的脂质体的标准PC；在更靠 近图中部的部分示出了含有胆固醇部分的SML化合物，其中观察到脂质体的尺寸 增加；在图的最右侧，脂质体崩解并形成在水性环境中不可溶的脂质体。

图2示出了在MARTI-测试、PChemsPC(2.1)、OChemsPC(2.2)、PChcPC (2.3)和DChemsPC(2.4)中使用的四种固醇修饰的磷脂的结构。

图3示出了使用PChcPC SML的TB-阳性患者血清的MARTI图，通过在抑制 步骤中泳道1和泳道2之间梯度的重大差异证实了TB-阳性状态；SML化合物被 测定为在PC和PC-MA脂质体中具有PChcPC的33％(m/m)组合物；抑制步骤 中的不同初始梯度证实了TB-阳性状态；

图4示出了使用PChcPC SML的TB-阳性患者血清的MARTI图，通过在抑制 步骤中泳道1和泳道2之间梯度的几乎无差异证实了TB-阴性状态；SML化合物 被测定为在PC和PC-MA脂质体中具有PChcPC的33％(m/m)组合物；抑制步 骤中几乎完全相同的初始梯度证实了TB-阴性状态；

图5示出了脂质体及其区分TB-阳性和TB-阴性患者血清能力的比较，(a) NormPC，(b)PChemsPC，(c)OChemsPC，(d)PChcPC和(e)DChemsPC； 数值代表TB-阳性和TB-阴性血清之间的平均百分比差异，误差条代表标准差，n＝ 3；

图6示出了在MARTI SPR测试中脂质体及其区分TB-阳性和TB-阴性患者血 清能力的比较，(a)NormPC，(b)PChcPC；数值代表集中的TB-阳性和TB-阴 性血清之间的平均百分比差异；误差条代表平均值的标准差，n＝6，使用学生氏 t-检验确定统计学显著性为P>0.05，假设为不等方差，其中对于自由度为8而言， t_stat 2.68>t_crit 2.31；

图7示出了使用Zetasizer测量的相对于单个时间点光强度的正常PC脂质体 的尺寸分布图；

图8示出了在包含分枝菌酸之前和之后，SML-脂质体相对于NormPC-脂质体 的尺寸变化(a)NormPC、(b)PChemsPC、(c)OChemsPC、(d)PChcPC和 (d)DChemsPC；在一年后重复实验时结果可重现；以及

图9示出了两种最相关的SML的ζ电位(mV)以1、24和120小时的间隔 随时间的变化；图A(a)NormPC和(b)具有MA的NormPC；图B(c)PChemsPC (d)具有MA的PChemsPC和图C(e)PChcPC和(f)具有MA的PChcPC；标 准方差可忽略，对于每个值n＝90。

具体实施方式

实施例

试剂和缓冲液。

试剂来自Sigma或Merck，其纯度为至少99％。

20X PBS：

称重以下化合物，160g NaCl、4g KCl、4g KH₂PO₄、21g Na₂HPO₄，然后在 600ml的双蒸去离子(ddd)H₂O中溶解过夜。然后用ddd H₂O将溶液定容至1升。

1X PBS/AE：

为了制备缓冲液，将0.3802g Na₂EDTA、0.250g NaN₃和50ml 20X PBS与900 ml dddH₂O混合，并用1M醋酸调节至pH 7.44。然后用ddd H₂O将溶液定容至1 升，并通过0.2μm醋酸纤维素过滤器(Sartorius Stedim biotech,德国)进行过滤。

固醇修饰的磷脂(SML)

图2中所示的SML化合物由Avanti Polar Lipids Inc.,AL,USA的Dr.Walt Shaw 提供。

PChemsPC-1-棕榈酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱

OChemsPC,1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱

PChcPC-1-棕榈酰基-2-胆固醇基羰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱

DChemsPC-1,2-二胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱

盐溶液:

NaCl(0.9g)在100ml ddd H₂O中的溶液

ODT溶液(0.1M)：(用于涂覆金盘)

将十八硫醇(ODT,Sigma,0.14329g)溶解于50ml无水乙醇，在浴式超声处 理器(Branson model 42)中超声处理30分钟或直至溶解。将样品分成两份。将镀 金传感盘(Eco Chemie,荷兰)垂直放置于在两个含有ODT的50ml离心管的每 一个中过夜。

方法

使用固醇修饰的脂质(SML)制备脂质体：

用小纸板箱包装棕色玻璃瓶，覆箔并且然后高压蒸气灭菌。之后，将纸箱放 置于110℃烘箱中直至干燥(过夜)。然后将干燥的瓶箱储存于干燥器中过夜， 以冷却并保持干燥。PC(磷脂酰胆碱)(33mg/ml)和SML-PC(固醇修饰的PC, Avanti Polar Lipids,AL,USA)(16.5mg/ml)氯仿溶液：高压蒸气灭菌，干燥，棕 色玻璃瓶，使用分析天平称量0.012g PC。在相同的瓶中称重0.006g的每一种感 兴趣的SML类型。将分析级氯仿(360μl)加入到PC-SML混合物中，随后涡旋 混合并加热至85℃以使其完全溶解。将瓶放回4℃冷却10分钟以冷却氯仿。

贮备分枝菌酸溶液(1mg/ml)：

为了复配之前等分的分枝菌酸，将1mg样品溶解于180μl的分析级氯仿中， 之后在85℃下涡旋混合直至溶解。用移液管将冷却的PC-SML-溶剂溶液(180μl) 转移至含分枝菌酸的瓶中。然后将其涡旋混合并加热至85℃直至均匀混合。然后 通过加热蒸发溶剂，使用Reacti-(Thermo Scientific,Newington,USA)氮气 置换5-10分钟。将盐水(0.9％,2ml)加入到MA-SML-PC和SML-PC中。为了诱 导脂质体形成，将脂质体样品涡旋混合20秒，加热至85℃持续5分钟，然后再 涡旋混合20秒。这一过程重复四次。通过在溶液、丙酮、CHCl₃和ddd H₂O中超 声处理30秒来清洁尖端超声破碎仪(Tomy UD-201Ultrasonic disruptor,日本东京)。 操作中每三天替换所有溶液。以50％的工作循环以20％输出超声处理PC-SML和 PC-SML-MA脂质体5分钟。

用无水EtOH拭净冻干机(Virtis,SP Industries,Gardiner,NY,USA)的样品室 并使其干燥。将经超声处理的PC-SML和MA-SML-PC溶液单独等分为200μl样 品，用两层实验纸覆盖并用橡皮筋缠紧。在-70℃下冷冻等分试样30分钟。然后 在200毫托或更低的真空度下将样品冻干过夜。除去实验室纸和橡皮筋，将瓶加 帽并在-70℃下储存直至使用。

为了复配脂质体以用于日常应用，将2ml 1X PBS/AE缓冲液加入到两种冻干 样品中(PC/PC-SML和PC/PC-SML-MA)，涡旋混合并加热至85℃持续20分钟， 每5分钟进行涡旋混合。清洁超声破碎仪尖端(30秒氯仿，30秒丙酮，30秒ddd  H₂O)。以50％的工作循环以20％输出首先在PC/PC-SML瓶中进行超声处理持续 5分钟，之后是PC-MA瓶。如前在每次使用之后清洁超声破碎仪。

在使用前将脂质体静置至少30分钟。

使用Zetasizer来确定脂质体稳定性。

在复配和超声处理之后，将样品转移至位于比勒陀利亚的科学工业研究委员 会(Council for Scientific Industrial Research CSIR)的材料科学与制造分部 (Materials Science and Manufacturing Division)，在那里使用Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments,U.K.)来表征脂质体。

用无水乙醇清洗透明一次性试池和塞子三次，然后用18MΩddd H₂O清洗三 次，并且将每个试池甩干。然后用移液管将900μl样品转移至试池的开口之一， 并插入塞子。用纸巾擦拭试池并插入到Zetasizer中。首先用以下设置来测量样品 尺寸：手动，材料设置为磷脂，使用Mark-Houwink方程设定，分散剂＝ICN PBS 片,折射率(RI)＝1.330,粘度＝0.8882Pa.s,分散度介电常数＝79.0。测量被设 定为使样品平衡60秒。运行11次，每次进行三次测量并记录，每个样品总共得 到33个测量值。使用Smoluchowski方程(由装置进行)来进行ζ电位测量，使用 30次测量，每次测量平行进行三次，共得到90个值，然后取平均值来计算ζ电位。

基于SPR的MARTI

Lemmer et al.(2009)描述了关于基于SPR的MARTI的方法。除了在PC脂 质体和PC-MA脂质体中使用30％w/w固醇修饰的脂质代替30％PC之外，本文中 使用了相同的方法。对于四种化合物均是如此，以研究每种化合物的效果，其中 使用之前确定的TB-阴性血清ASPA004、JS09和TB-阳性血清ASPA019、BM12。 如无另外描述，生物传感器实验平行进行三次。在ESPRIT生物传感器上使用的程 序顺序为Thanyani et al.(2008)发表的修正版本。使用具有少量修正的相同程序 顺序以防止出现气泡并且更为简单自动化。

结果和讨论

在MARTI分析中将作为脂质体抗原载体的固醇修饰的脂质与磷脂酰胆碱进 行比较

用于TB诊断的MARTI测试处于开发阶段，其原理的证明已经实现。现在要 将其开发成适合用于鉴定的设计。一个挑战是用于MA抗原固定的携带抗原的脂 质体的相对不稳定性。Thanyani et al.(2008)最初描述了典型的MARTI方案。

对于MARTI中的SPR测量，在高度稀释血清暴露步骤中(在3100秒和3600 秒之间)红线和绿线之间应当几乎无差异，因为在该阶段中比色皿内容物是完全 相同的。由不稳定的脂质体造成的运行失败经常发生在该阶段和下一阶段，这可 能是由于与脂质体结合的抗体负担增加。高度稀释步骤对于MARTI而言是质量保 证步骤，其确保比色皿的两个试池中的抗体结合活性的测量值是可比较的。这一 规则符合图3和图4，其中显示了，在分别用差别化处理的TB-阳性患者血清和 TB-阴性患者血清后，相比于泳道2，在第二次血清暴露时泳道1中减小或相似梯 度的可重现结果的合理性。

图3和图4均是使用PChcPC SML作为抗原呈递脂质体获得的。图3证实了 TB-阳性患者血清样品ASPA019中存在抗-分枝菌酸抗体。由于在抑制步骤的初始 结合过程中相等的梯度，图6中证实了患者血清ASPA004的TB-阴性状态。像本 文中所使用的其他SML一样，PChcPC含有共价构建于磷脂的酰基链中的胆固醇 部分。结果暗示了该胆固醇部分不被人血清中无所不在地存在的MA交叉反应性 抗-胆固醇抗体所识别(Horváth & Bíró,2003)。这保持了由于TB-阳性患者血清 中特异性抗-MA抗体活性造成的TB-阳性和TB-阴性患者血清之间的信号差异。使 用相同的TB-阳性和TB-阴性血清，对每一种剩余SML混合物重复该实验。图5 中示出了全部四种SML的数据的总结。Y-轴被定义为TB-阳性和TB-阴性患者血 清中抗-MA抗体活性抑制的平均百分比差异。这代表相对于作为MA抗原载体的 正常PC，使用四种不同的SML通过MARTI-测试获得的用以区别TB-阳性和TB- 阴性患者血清的解决方案。在抑制步骤的最初结合部分期间在55秒的窗口内(约 3650秒至3705秒)计算两个泳道的梯度。从泳道2的梯度减去泳道1的梯度。对 于每次重复进行该计算并获得三个值的平均值。然后根据以下公式从TB-阳性和阴 性样品中每一个的平均值减去另一个，以获得TB+和TB-血清之间的平均百分比梯 度差异：

％G_1,2,＝100(泳道2的平均梯度–泳道1的平均梯度)/泳道1的平均梯度

％GradDif＝％G_TB+ve-％G_TB-ve

结果表明，使用NormPC脂质体的标准方法具有能够通过抗体结合抑制活性 以大约20％的差异区分TB-阳性和TB-阴性患者血清的能力。这不同于用 PChemsPC脂质体进行的相同程序，其中在TB-阳性和TB-阴性患者血清之间未获 得差异(P<0.05)。最有可能的原因是通过人血清公认普遍存在的抗-胆固醇抗体 识别PChemsPC的胆固醇部分(Horváth和Bíró,2003)。OChemsPC和DChemsPC 确实显示出了其比正常PC更弱地将阳性患者与阴性患者相区分的能力的趋势，但 在其作为用于MARTI-测试的脂质体稳定剂方面并不能处于鼓舞人心的水平。 PChcPC能够至少像NormPC那样区分TB-阳性和阴性患者血清，从而展示了最有 潜力的结果，但具有稳定脂质体的额外性能，如下文第3.3.2段将讨论的那样。

与PChcPC不同，PChemsPC-MA在其检测TB生物标志物抗-分枝菌酸抗体方面 未显示出特异性。这可能是由于其在脂质体中形成脂质筏样(raft-like)结构的倾向 (Brown&London,2000)，这类似于将胆固醇以高浓度加入到PC脂质体中时所发生 的那样(Benadie et al.,2008)。在稳定脂质体时，这些筏样结构可以称为普遍存在于所 有人中的抗-胆固醇抗体的抗原(Swartz et al.,1988,Biro et al.,2007)。尽管 PChemsPC-MA可使其MA和共价胆固醇部分作为针对抗-胆固醇抗体的交叉反应性抗 原，但PChcPC-MA显然并不具有该作用，而OChemsPC-MA和DChemsPC-MA具有 该作用的程度更低。相比于NormPC，当使用SML化合物时，MARTI期间失败运行 的次数减少，这表明使用SML获得了更高的脂质体稳定性。这并不能表明，相比于如 可能已经预见的图5中的NormPC测试运行，完全相同SML测试运行之间的标准差 减小。因此，SPR-MARTI中标准差的大小取决于例如设备和处理的元素，但不缺少 MA抗原的脂质体载体的稳定性。

进行另外的实验来证实使用化合物PChcPC的益处。图6显示了TB阳性患者 (ASPA 019和BM-12)和TB阴性患者(ASPA 004和JS-09)血清之间的％梯度 差。较大的样品数量允许二者之间以95％置信区间具有统计学显著差异。

受到固醇修饰的脂质影响的脂质体的尺寸特性

将新型SML脂质体区分TB-阳性和TB-阴性血清的能力与其物理性质进行比 较。任意相关性都可能提供在实际诊断应用中SML实现其MA和胆固醇的独特脂 质体抗原呈递的潜力的机理的启示。使用第3.2段所列出的方法测试了全部五种脂 质体组合物的尺寸和ζ电位。

由Zetasizer表示脂质体尺寸数据的标准方法是尺寸相对于光强度的半对数图 (参见图7)。测量事件期间每一脂质体样品的数据的展示涉及需要确定三个高斯 分布图的平均最大值(图7)。总共有10种不同的脂质体样品，即，NormPC、 PChemsPC、OChemsPC、PChcPC和DChemsPC，每一种具有或不具有分枝菌酸。 当用NormPC脂质体进行MARTI分析时进行早期观察显示了重复实验的可重现性 的随时间减小，其可在脂质体形成8小时后变得明显。认为这是由于脂质体稳定 性损失造成的。进行另外的实验来研究分枝菌酸对脂质体尺寸的影响。

图8描述了NormPC和PChcPC包括分枝菌酸对脂质体尺寸的影响。这种尺寸 减小可以是证明MARTI血清样品分析即使包括胆固醇部分之后也是准确的原因。

PChcPC-MA是唯一表现为小于其空白对照的SML脂质体(平均20nm)，类 似于在NormPC中所观察到的。相比于在NormPC中发现的，这与其在MARTI- 测试中作为TB区分抗原呈递MA的能力相关。在图5中，PChcPC是唯一能够与 NormPC一样好或优于NormPC提供TB差异信号的化合物。

因此，发现了SML(PChcPC)脂质体在MARTI中能够以将TB从患者血清 样品中区分的方式呈递MA抗原，并且同时使脂质体稳定。这为最初设置的假设 提供了支持。另一SML脂质体(PChemsPC)当负载有MA时无法像NormPC-MA 或PChcPC-MA那样功能性呈递MA或缩减尺寸。因此，与负载有MA时功能性 呈递MA的能力脂质体尺寸的缩减相关。这种物理动态脂质体特性是否代表MA 的功能性抗原呈递的机制仍有待确定，但根据两种其他的SML的结果并不矛盾， 在该结果中显示当负载有MA抗原时显示出功能性呈递MA以及尺寸缩减的能力 减小。

SML对HLB和尺寸的影响

如上文所述，胆固醇通过减小晶体堆积参数和膜流动性来稳定化脂质体。胆 固醇还使与膜的曲率有关的亲水亲油平衡(HLB)减小。减小的HLB会导致膜具 有较小的曲面，即较大的尺寸。发现此处测试的四种固醇修饰的磷脂酰胆碱以比 正常的单独磷脂酰胆碱高约30％的浓度被组装到较大的脂质体中(图8)。这可能 发生以适应在脂质体形成后SML的胆固醇基序。在加入MA之后，NormPC和 PChcPC脂质体比它们的空白对照要小，这暗示了脂质体表面的曲率增加带来了 MA和胆固醇基序的胆固醇抗原簇减少并且使得在TB患者血清中生物标志物抗 -MA抗体的识别具有更好的特异性。与直觉相反的是，当向脂质体中添加应该会 导致膜的曲率减小且尺寸增加的极度疏水性MA时，这预期使亲水亲油平衡(HLB) 减小。数据表明，当加入MA时，对于PChemsPC观察到了预期的图案，而对于 NormPC和PChcPC-脂质体尺寸减小则观察到相反的效果。显然，对于MA和不 同类型的固醇修饰的脂质之间的特有相互作用仍有待研究。现在，足以得出结论 认为用于TB诊断的MARTI测试中的脂质体稳定化的具体问题能够通过使用SML 而得到克服。SML在此处显示出作为感兴趣的和有力工具用以阐明用于作为抗原 的其最佳呈递的MA的抗原特性，以检测肺结核的生物标志物抗体。

SML对ζ电位的影响

脂质体稳定性的另一个指标能够通过ζ电位随时间的变化来观察。由于磷酸酯 基团上带负电荷，磷脂的测量值提供了负ζ电位值(Van der Mei et al.,1988)。该 值负的越多，ζ电位就越大，并且因此其稳定性就越大(Li&Tian,2002)。这通 过脂质体之间的电荷排斥发生(Akashi et al.,1998)，会造成它们之间的融合减少。 然后，脂质体保持在较小的尺寸范围，在本文中这与MA的更好的特异性抗原性 相关，以用于在TB患者中生物标志物抗体(图5和图7)。

研究了四种不同SML对于诱导脂质体使其在MARTI-测试中可作为更稳定且 功能性的MA抗原呈递分子，在最初脂质体形成一小时后以及之后的24小时和120 小时进行测量。三种重要的且感兴趣的脂质体组合为PChcPC、PChemsPC和 NormPC，其分别代表了成功的、有缺陷的和参比MA抗原呈递系统。

图9中的数据暗示了对于全部缺少MA的化合物ζ电位随时间的平均负数值 增加。在所有情况下，在形成1小时后，加入分枝菌酸使得ζ电位值升高(负值更 大)。这有可能是由于分枝菌酸基序将羟基和羧基呈递至脂质体表面而发生。随 着时间流逝，在所有未负载的脂质体类型中，ζ电位变得负值更大，但在PChemsPC 情况下在接近120小时时并不趋向于平坦。NormPC在24小时后显示出最大的ζ 电位差异并且在接近120小时时迅速相等。功能性MA抗原呈递的决定性因素似 乎是负载MA的脂质体类型在120小时内增加其ζ电位至更大的负使值时的速率。 此处，相比于NormPC-MA(-9.0mV)和PChemsPC(-8.0mV)，PChcPC-MA达 到了最高ζ电位(-11.5mV)。在PChemsPC-MA的情况下，关键的是从24小时 向较低负ζ电位的变化方向，这指示了其独特行为，可能与其不能作为功能性抗原 呈递MA有关。

就脂质体尺寸特性而言，在此阶段还不能说为什么PChcPC-MA是一种如此好 的用于功能性MA抗原呈递的化合物。然而，其物理上与MA负载后尺寸减小和 改善的ζ电位有关，这可提供对在MARTI中PChcPC作为有效脂质体稳定剂和 MA抗原呈递分子的领先理解。

结论

上文中所述的TB诊断学的挑战阻碍了全世界对TB的防控。WHO TB报告指 出，诊断学方面的创新对于减轻面临TB流行的管控的问题是最好的途径(Dacombe  et al.,2009)。在稳定化表面结合的脂质体的尝试中使用SML，延长了其货架期， 并且对于TB诊断提供了更好的抑制信号。根据文献确定患者TB状态的抗体相互 作用的生物学研究(Thanyani et al.,2008)是定义参数(defining parameter)。三 种物理性质对于脂质体稳定性有贡献，即，尺寸(Winterhalter&Lasic,1993)、ζ 电位(Li&Tian,2002)和胆固醇的添加(Connor et al.,1984,Brown&London,2000, Lodish et al.,2004,Huang&Szoka 2008)。申请人的数据证实了脂质体的这些物理 性质在区分的TB-阳性和TB-阴性患者血清时的重要性。发现PChcPC是最好的， 随后是NormPC，而PChemsPC也能区分TB阳性和TB阴性患者血清。申请人发 现，在患者TB状态的确定中，在加入MA之后脂质体尺寸减小与作为血清生物标 志物抗-MA抗体检测的抗原功能性呈递MA的能力有关。负ζ电位随时间的持续 数值增加，在SML中，加入MA之后脂质体尺寸的减小和由胆固醇基序提供的脂 质双层刚性被证明是重要的。在这些构思中更多的智力投入证实了该模型。这些 结果证明了将特定SML包括在脂质体中以改善MA抗原呈递的稳定性的能力，以 使得增加脂质体诊断性神武传感器系统用以检测在至少TB中(但也可以在其他疾 病中)作为疾病标志物的抗-脂质抗体的灵敏度、特异性和可重现性的潜力，其中 抗-脂质生物标志物抗原抗体能够被用作诊断参数。

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