公开/公告号CN104726455A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-06-24
原文格式PDF
申请/专利权人 中国农业科学院兰州兽医研究所;
申请/专利号CN201510071461.2
申请日2015-02-11
分类号
代理机构北京中恒高博知识产权代理有限公司;
代理人吕玉博
地址 730000 甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
入库时间 2023-12-18 09:33:32
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-05-01
授权
授权
2015-07-22
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/113 申请日:20150211
实质审查的生效
2015-06-24
公开
公开
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种针对蛔虫三期幼虫特异表达的miRNA—asu-miR-36f的抑制剂及其应用。
背景技术
猪蛔虫(Ascaris suum) 是猪体内常见的寄生线虫之一，属于蛔科蛔属，寄生于猪小肠。猪蛔虫病流行广泛，极大地危害着养猪业的发展，尤其是在卫生条件差的猪场，感染率甚高。病猪主要表现为生长发育不良，严重者可造成生长发育停滞，甚至死亡。而长期过度使用抗蠕虫药物已造成了呈全球性分布的寄生虫抗药性问题以及动物产品及环境中的药物残留问题。因此，加快对猪蛔虫的研究、寻找有效防治猪蛔虫的新途径已经迫在眉睫。
MicroRNA(miRNA)是生命体内源性长度约为21-25个核苷酸的一类非编码小RNA, 广泛存在于真核生物中，通过与靶mRNA互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行调节。具有发育阶段的特异性、时序性或者组织特异性的表达特点，其功能主要为从转录后调控的水平调节个体生长及发育相关基因表达。研究业已表明，寄生线虫存在独特的miRNA 转录后调控机制，它们可以通过miRNA 实现对宿主和自身基因表达模式的精确调控，从而提高感染和自身增殖的几率并逃避免疫监视（Britton C, et al. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 2014; Winter, et al. BMC Genomics. 2012; Wang J, et al. Genome REA. 2011）。通过选择性地抑制或阻断某一特定发育期线虫的发育，从而减少或阻断寄生线虫的传播很可能是防治线虫感染的新思路、新途径。猪蛔虫物种特异性miRNA 有可能成为猪蛔虫免疫预防或化学防治的新的“关键”分子，为核酸疫苗制备提供基础。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的抗蠕虫药物造成的寄生虫抗药性问题，以及动物产品和环境中的药物残留问题，提供一种针对蛔虫三期幼虫特异表达的miRNA—asu-miR-36f的抑制剂。本发明另一目的在于提供针对上述蛔虫三期幼虫特异表达asu-miR-36f的抑制剂的应用。
本发明提供一种针对蛔虫三期幼虫特异表达miRNA—asu-miR-36f的抑制剂，所述抑制剂的核苷酸序列为：UGACAAGGAUUGCAGCCCGGUGA。
优选地，所述蛔虫为猪蛔虫或人蛔虫。
本发明的第二个目的是提供上述抑制剂在防治蛔虫、抑制蛔虫三期幼虫生长发育和感染性中的应用。
本发明的第三个目的是提供上述抑制剂在制备防治蛔虫感染的药物中的应用。
优选地，所述蛔虫为猪蛔虫或人蛔虫。
本发明的第四个目的是提供一种防治蛔虫感染的药物，所述药物包括以下核苷酸序列：UGACAAGGAUUGCAGCCCGGUGA。
优选地，所述蛔虫为猪蛔虫或人蛔虫。
本发明所提供的miRNA—asu-miR-36f抑制剂是一条核苷酸序列，是根据猪蛔虫三期幼虫特异表达的asu-miR-36f而发明，其序列长度为23nt。本申请人对猪蛔虫不同发育期miRNA 进行深度测序研究发现，asu-miR-36f只在三期幼虫表达，在其他发育期不表达，而猪蛔虫的三期幼虫才具有感染性，因此asu-miR-36f的表达可能与猪蛔虫的感染性有关。因此，采用miRNA—asu-miR-36f抑制剂（inhibitor）在猪蛔虫三期幼虫体内减少或者抑制asu-miR-3f的表达将可能影响猪蛔虫三期幼虫生理功能或与感染性相关的功能，进而将猪蛔虫三期幼虫致死或者降低其感染性。此外，鉴于猪蛔虫和人蛔虫的物种相似性（现在已有文献报道猪蛔虫和人蛔虫属同一物种【Leles D, Gardner SL, Reinhard K, I?iguez A, Araujo A (2012) Are Ascaris lumbricoides and Ascaris suum a single species？ Parasit Vectors 5: 42.Shao et al., (2014) Comparative analysis of microRNA profiles between adult Ascaris lumbricoides and Ascaris suum. BMC Vet Res 10: 99.】），本发明所提供的猪蛔虫三期幼虫特异表达的miRNA—asu-miR-36f抑制剂亦可应用于影响人蛔虫三期幼虫生长发育或与其感染性相关的功能。因此，本发明猪蛔虫三期幼虫特异表达的miRNA—asu-miR-36f抑制剂可用于抗蛔虫感染药物，特别是抗猪蛔虫或人蛔虫药物。
本申请人经实验证明，本发明具有如下有益效果：由于猪蛔虫三期幼虫特异性表达的asu-miR-36f只在猪蛔虫具有感染性的三期幼虫中表达，具有表达的时期特异性；而本发明猪蛔虫三期幼虫特异表达的miRNA—asu-miR-36f抑制剂能够选择性的抑制或阻断asu-miR-36f的表达，从而影响猪蛔虫三期幼虫的正常发育，进而将三期幼虫致死或者降低其感染性。将本发明的miRNA—asu-miR-36f抑制剂制备成为抗蛔虫药物时，既可以避免传统抗蠕虫药物造成的全球性分布的寄生虫抗药性问题，也不会导致动物产品或环境中药物的残留。
本发明的结果证实，miRNA—asu-miR-36f抑制剂通过与asu-miR-36f结合，显著降低了asu-miR-36f的丰度，并且显著影响了猪蛔虫三期幼虫的发育及降低了感染率。因此本发明可以为防治猪蛔虫提供新的方法，为防治猪蛔虫药物的开发提供新的思路。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为asu-miR-36f抑制剂对猪蛔虫三期幼虫宽度的影响(P<0.05)；
图2为asu-miR-36f抑制剂对猪蛔虫三期幼虫长度的影响(P<0.05)；
图3为asu-miR-36f抑制剂对猪蛔虫三期幼虫感染率的影响(P<0.05)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
1.猪蛔虫三期幼虫的制备
从自然感染的屠宰猪小肠中收集猪蛔虫成虫雌虫，解剖取下子宫叉端1/2左右，取出虫卵，将其放入研钵中，用灭菌的PBS液（Na2HPO4·12H2O 9.670g；KH2PO4 1.429g；NaCl 2.125g；H2O 500ml）在研钵内稍加研磨，加PBS液及1.5%福尔马林液各清洗、离心两次，弃上清，将沉淀放入培养皿中，28℃温箱培养28天。用7.5%的次氯酸和适当振荡脱壳，获得猪蛔虫三期幼虫。
2.培养基的配制
配制含有50%胎牛血清的DMEM培养基，并在其中加入青霉素（1000U/ml）、链霉素（1mg/ml）和两性霉素（10μg/ml），青霉素、链霉素和两性霉素的加入能够预防杂菌生长。
3.asu-miR-36f抑制剂及抑制剂对照的配制
asu-miR-36f抑制剂为一段核苷酸序列，是依据asu-miR-36f序列进行设计，可以特异的与asu-miR-36f序列结合从而影响其功能发挥，由上海生物工程有限公司按照常规核酸序列合成方法进行合成。具体核苷酸序列为：UGACAAGGAUUGCAGCCCGGUGA。合成后将其分装，每管抑制剂为1OD（Invitrogen）,在每管加入250μl的DEPC水配置成20μM溶液。同样方法配制抑制剂对照溶液。包括无关对照（inhibitor negative control）及空白对照。无关对照采用与本申请核苷酸序列无关的任意一段核苷酸序列，空白对照为等量的生理盐水。
4．浸泡三期幼虫
将配置好的培养基分装到细胞培养板的3个孔中，每孔400μl。每孔加入3000-5000个蛔虫三期幼虫，再分别加入浓度为40U/μl的RNA酶抑制剂（购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为D2310C）200μl，RNA酶抑制剂是为了防止手上汗液等蛋白污染培养基；最后分别加入已经配置好的asu-miR-36f抑制剂溶液400μl、无关对照400μl及空白对照400μl。在含5% CO2培养箱中37℃培养72h。培养期间，每天定时将培养液轻摇均匀。
5. 三期幼虫感染小鼠
八周龄的BALB/c小鼠分成三组，每组十五只。将步骤4制备得到的三组三期幼虫通过灌胃分别感染这三组小鼠，并对每组小鼠做好标记。
6.回收猪蛔虫幼虫
四天后，取上述实验小鼠的肝脏和肺脏，用贝尔曼法回收猪蛔虫幼虫，对各组回收的幼虫进行计数，并测量其长度和宽度，统计减虫率。具体结果参见图1-3。由图1-图3可知，本发明的抑制剂能够有效降低猪蛔虫三期幼虫的宽度、长度和数量。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
机译： 分离的多核苷酸，表达盒，宿主细胞，分离的多肽，已被改变以表达耐碱突变体多肽的非人类转基因动物，与耐碱突变体多肽特异性结合的抗体，突变检测试剂盒生物样品，以及用于评估生物样品中是否存在对烷基抑制剂的抗性突变以诊断对至少一种碱性抑制剂有抗药性或可能发展出抗药性的癌症的方法。小分子激酶，用于评估生物学样品中是否具有抑制碱性磷酸酶抑制剂的突变，以诊断对患者具有抗药性或可能对pf-02341066产生抗药性的癌症，从而特异性降低抗癌突变体的表达以治疗癌症与激活抗至少一种小分子烷基激酶抑制剂的异常环路能力有关，该抑制剂治疗对pf-02341066有抵抗力的异常癌症
机译： 修饰的多聚核苷酸绝缘带，宿主细胞，分离的转基因非人类动物多肽，经过修饰以表达对ALK具有抗性的多肽突变体，与对ALK具有抗性的多肽突变体特异性结合的抗体，试剂盒p用于检测生物样品中对ALK抑制剂具有抗性的突变，以及用于评估生物样品为对ALK抑制剂具有抗性的突变的方法，用于诊断对至少一种对ALK抑制剂具有抗性或可能发展出抗性的癌症激酶小分子ALK，以评估Anto对ALK抑制剂具有抗性的突变的生物样品。用于诊断对至少一种激酶小分子ALK抑制剂具有抗药性或可能产生抗性的癌症，以评估该生物样品作为对ALK抑制剂有抗性的突变，即对狄诺司他抗性或可能对PF产生抗药性的癌症-02341066
机译： 特异性抑制人类miRNA-185表达的慢病毒载体的构建及应用
