一种用于癌痛治疗的寡肽联合或与吗啡组合的产品

技术领域

本发明涉及对抗癌痛的药物以及寡肽联合或与吗啡的组合在制备用 于癌痛的药物中的用途。具体而言，本发明涉及寡肽ASQFFGLM-NH₂在 提高受试者中δ阿片受体的转录和/或表达水平，并进而与吗啡的组合能 够用于治疗或减缓癌痛。

背景技术

速激肽是具有共同羧基末端序列（FXGLM-NH₂）的肽家族，其最为 人所熟知的成员包括：P物质(SP)、神经激肽A（NKA）和神经激肽B(NKB)， 它们是从两个不同的基因编码而来：Ppta编码SP、NKA；Pptb编码NKB。 在2000年和2002年，第三个前速激肽基因Pptc被鉴定，它编码HK-1。 HK-1最初是在小鼠造血细胞中被鉴定出来，它在祖B细胞发育到前B 细胞的过程中起着重要的作用。后来，它在大鼠和人中也被鉴定出来。

许多证据表明，人和小鼠HK-1与SP对神经激肽受体具有类似的激 活活性，都对神经激肽受体1（NK1受体）有着很高的亲和性和选择性。 然而，与r/mHK-1和SP不同的是，hHK-1和hHK-1(4-11)对于神经激肽 受体1的亲和性降低许多(分别是14倍和70倍)。一些研究者研究了人 和小鼠HK-1在免疫系统、心血管系统和痛觉系统的一些生物学活性。 在调控痛觉传递方面，本发明的发明人之前发现，r/mHK-1和hHK-1在 侧脑室注射后都能产生剂量和时间依赖的镇痛效果，并且神经激肽受体 1的拮抗剂和μ阿片受体拮抗剂能够分别显著阻断由r/mKH-1和 hHK-1引起的镇痛效果。也就是说r/mKH-1和hHK-1的镇痛效果分别依 赖于神经激肽受体1和μ阿片受体。

内源性的阿片肽和阿片受体参与了疼痛的调节过程。目前，临床上 大多使用μ阿片受体的激动剂来缓解疼痛，但是其耐受性和极易产生的 身体和精神的依赖性等副作用严重制约了其使用。相反，选择性的激活 δ阿片受体在产生强效止痛效果的同时，很少有副作用产生。因此，激 活δ阿片受体目前被认为是一种理想的止痛手段。

有文献报道，疼痛是肿瘤患者最常见却又最难控制的症状之一。据 世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年有1000万新发癌症患者，600万 人死于癌症，其中50%的患者有癌性疼痛症状，70%的晚期癌症患者以 疼痛为主要症状。在疼痛患者中，因各种原因使50%～80%的疼痛没有 得到有效控制。当前，中国每年新发癌症患者数约180万，每年死于癌 症的人数达到140万。研究表明，中国癌性疼痛病人发病率高达50%左 右，疼痛的原因以肿瘤直接引起的疼痛占第1位约占80%，同时治疗肿 瘤也可引起疼痛，发生率占10%左右。其他10%为与肿瘤相关或无关原 因。

对于可能治愈的癌症患者，确切有效的止痛可以明显改善病人的一 般情况，使其顺利地完成临床放疗、化疗等抗肿瘤治疗计划，达到治愈 的目的。对于难以治愈的患者，有效的止痛可以使其获得较为舒适的带 瘤生存，提高其生存质量，并可能延长其生存期。

发明内容

为了治疗或缓解癌痛，本发明的发明人经过长期不懈地努力发现寡肽 ASQFFGLM-NH₂能够上调δ阿片受体的表达。

因此，本发明一方面提供了一种上调受试者体内δ阿片受体表达水 平的方法，其包括向所述受试者（例如哺乳动物，例如人）使用有效剂 量的寡肽ASQFFGLM-NH₂。

本发明的另一方面提供了寡肽ASQFFGLM-NH₂在制备用于上调受试者 （例如哺乳动物，例如人）体内δ阿片受体表达水平的制剂（例如药物） 中的用途。

本发明还提供了寡肽ASQFFGLM-NH₂联合或与吗啡的组合在制备用于 在受试者（例如哺乳动物，例如人）中治疗或缓解癌痛的制剂（例如药 物）中的用途。

本发明进一步地还提供了寡肽ASQFFGLM-NH₂在制备用于增强吗啡对 抗癌痛效果的制剂（例如药物）中的用途。

本说明书以及权利要求书中有可能涉及一些缩写，这些缩写所代表 的内容是本领域技术人员所周知的。但是，为了便于理解本发明的内容， 将相关的缩写所代表的内容引述如下：

r/mHK-1：大鼠/小鼠hemokinin-1；FAM：羧基荧光素；PPT：前速 激肽原；MOR：μ-阿片受体；POMC：阿黑皮素原；KOR：κ-阿片受体； PDYN：强啡肽原；DOR：δ-阿片受体；PENK：脑啡肽原；GAPDH：甘油 醛-3-磷酸脱氢酶；HK-1（4-11）：ASQFFGLM-NH₂。

附图说明

图1:小鼠侧脑室注射寡肽ASQFFGLM-NH₂后，NK1受体和不同前速 激肽原在mRNA水平的表达变化情况。a，b和c分别是用ABI7300系 统软件获得的具有代表性的NK1受体，PPT-A和PPT-C的扩增曲线。 A，B和C直方图显示的分别是来自至少独立三次重复的NK1受体、PPT-A 和PPT-C的相对mRNA表达水平，内参基因为管家基因GAPDH。所有反 应每次一式三份，至少进行三次独立重复。每个值被注射生理盐水的对 照组所标准化，对照组的值设为1，结果以平均值±SEM呈现。与对照 组相比，实验组没有显著性差异。

图2:小鼠侧脑室注射寡肽ASQFFGLM-NH₂后内源性阿片受体和内源 性阿片肽在mRNA水平的表达变化情况。a，b，c，d，e和f分别 是用ABI7300系统软件获得的具有代表性的MOR(μ-阿片受体)，POMC (阿黑皮素原)，KOR(κ-阿片受体)，PDYN(强啡肽原)，DOR(δ- 阿片受体)和PENK(脑啡肽原)的扩增曲线。A，B，C，D，E和F 直方图显示的分别是来自至少独立三次重复的MOR，POMC，KOR，PDYN， DOR和PENK的相对mRNA表达水平，内参基因为管家基因GAPDH。所有 反应每次一式三份，至少进行三次独立重复。条对应于平均值的标准差。 ***p≤0.001：与各自对照组相比有极显著性差异。

图3：半定量Western Blotting实验测定小鼠侧脑室注射寡肽 ASQFFGLM-NH₂后NK1受体，MOR，POMC和DOR蛋白表达和对照组蛋 白表达情况。这些图片是来自于至少三次独立重复的代表性图片。柱形 图分别表示的是NK1受体(A)，MOR(B)，POMC(C)and DOR(D)的 相对蛋白表达水平情况，内参基因为β-actin。*p≤0.05;**p≤0.01： 与各自对照组相比有显著性差异。

图4：侧脑室注射人HK-1(4-11)联合皮下注射吗啡后，在48.5℃ 的温浴甩尾实验中能剂量和时间依赖的产生协同镇痛效果。*p≤0.05， **p≤0.01和***p≤0.001,表明人HK-1(4-11)联合吗啡注射组与单独 吗啡注射组相比有统计学上显著性差异。

具体实施方式

本发明的发明人以ICR小鼠（由浙江省杭州市杭州师范大学动物中 心提供）为研究对象，研究了寡肽ASQFFGLM-NH₂对各种阿片肽受体及其 配体的表达水平的影响。我们实验结果显示NK1受体和前速激肽原的表 达水平不受侧脑室注射寡肽ASQFFGLM-NH₂的影响。相对应我们目前的工 作，与生理盐水对照组相比，侧脑室注射寡肽ASQFFGLM-NH₂之后，MOR （μ阿片受体）[和KOR(κ阿片受体)，以及它们各自的内源性配体 POMC和PDYN的表达水平几乎没有改变。有趣的是，在我们目前的研究 中，DOR(δ阿片受体)的转录和蛋白水平发生极其显著的上调，然而 PENK（DOR的内源性配体）的表达水平没有发生显著变化。

因此，本发明一方面提供了一种提高受试者中δ阿片受体的转录 和表达水平的方法，其包括向所述受试者施用有效量的寡肽 ASQFFGLM-NH₂。本发明也提供了寡肽ASQFFGLM-NH₂在制备用于提高受试 者中δ阿片受体的转录和表达水平的制剂（例如药物）中的用途。本发 明的再一方面提供了一种药学产品（例如药物或药剂）或药物组合物， 其包括作为活性成分的提高受试者中δ阿片受体的转录和表达水平的 寡肽ASQFFGLM-NH₂；以及包括该涉及药学产品的说明书。

本发明一方面提供了一种提高受试者中吗啡的治疗或缓解癌痛的 效果的方法，其包括向所述受试者施用有效量的寡肽ASQFFGLM-NH₂，该 施用是在吗啡的施用之前或之后进行，或者与吗啡同时施用。本发明也 提供了寡肽ASQFFGLM-NH₂在制备用于提高在受试者中吗啡治疗或缓解 癌痛的效果的制剂（例如药物）中的用途。本发明的再一方面提供了一 种药学产品（例如药物或药剂）或药物组合物，其包括作为活性成分 的提高受试者中吗啡的治疗或缓解癌痛效果的寡肽ASQFFGLM-NH₂；以及 包括该涉及药学产品的说明书。

对于本发明所述的受试者，其优选为哺乳动物，更优选为人。

对于本发明的提高受试者中寡肽ASQFFGLM-NH₂的活性，本领域技术 人员可以对其作出任何修饰，前体是所述修饰不负面影响其活性。例 如，可以对该寡肽进行PEG化，以提高其在体内的半衰期；可以与已 知的穿透肽连接，以促进本发明寡肽的透皮吸收等。总之，本领域技 术人员可对本发明的寡肽进行各种修饰以提高递送效率并保持其活 性。这类修饰的寡肽也是在本发明的范围之内的。

本发明的作为活性成分的寡肽ASQFFGLM-NH₂可以连同药学上可接 受的载体一起使用。除活性成分外，本发明的方法、用途和产品还可 以包含合适的药学上可接受的载体，包括促进活性化合物加工成制剂 的赋形剂和助剂。

例如适于注射或输注的制剂包括水性和非水性无菌注射液和水性 和非水性无菌混悬剂，所述无菌注射液可任选地包含抗氧化剂、缓冲剂、 抑菌剂和能使制剂与目的接收者的血液等压的溶质，所述无菌混悬剂可 包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例 如密封的安瓿，并且可以保存在冻结干燥的（冻干）条件，在立即使用 前仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。

本发明的活性成分任选地可与固体赋形剂相组合，且任选地磨碎所 得到的混合物，并且需要时，在加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物， 以获得所需剂型。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、 甘露醇或山梨糖醇；纤维素或淀粉制剂、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。需 要时，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其 盐例如海藻酸钠。

本发明的活性成分的有效量可为提高受试者中δ阿片受体的转录 和/或表达水平的的任何量，其可以是相当于约0.1-15mg寡肽 ASQFFGLM-NH₂，优选0.01-20mg寡肽ASQFFGLM-NH₂的剂量单位。更 优选地，剂量单位包括约1-4mg的寡肽ASQFFGLM-NH₂。最优选地，剂 量单位包括约2-3mg的寡肽ASQFFGLM-NH₂。有效量的测定在本领域技 术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。

根据本发明，本发明的药学产品（药物、药剂）或药物组合物可以 以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药学产品（药物、 药剂）或药物组合物可以以多次剂量给药，例如从约2至约15次剂量， 更优选从约4-10次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的实施方案， 在给药过程中，以每三周给药约一次的频率将本发明的药学产品（药物、 药剂）或药物组合物给药至受试者，例如注射、输注或口服。在特别优 选的实施方案，给药为通过注射。

应当理解本发明的药学产品（药物、药剂）或药物组合物可以按用 于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。

本发明的药学产品（药物、药剂）或药物组合物的剂量单位是基于 常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每周一 次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次， 例如每三天一次。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于” 同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件 或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明 的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤 组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示 例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多 种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本发明的药学产品中所包含的涉及该药学产品的说明书可以含有 如下内容：适应症（例如疼痛，优选癌痛）、施用剂量（例如上述所 示例性说明的）以及可能产生的副作用等等。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此 种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价 物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此， 应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领 域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变 化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些 实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

实施例1

材料和方法

动物

雄性和雌性的ICR小鼠（20±1.0g）由杭州师范大学动物中心（中 国杭州）随机提供。所有动物实验程序由浙江理工大学动物饲养和使用 委员会批准，并且符合1986年11月24号欧共体委员会指令 (86/609/EEC)。所有的动物饲养在12小时光/暗周期的23℃-25℃环境 中，并且在实验开展前提供标准的食物和水。所有实验过程中尽可能 减少小鼠所受到的伤害和痛苦。

多肽

Fluo-寡肽ASQFFGLM-NH₂和寡肽ASQFFGLM-NH₂多肽由中肽公司（中 国杭州）使用固相多肽合成法合成，并且使用高效液相（HPLC）纯化， 其纯度达到98%。FAM是羧基荧光基团，利用标准耦合技术将5-羧基荧 光素耦合到寡肽ASQFFGLM-NH2肽的氨基酸基团上。寡肽ASQFFGLM-NH₂溶解在生理盐水中，工作液浓度是1.5mM。荧光素标记的（FAM）寡肽 ASQFFGLM-NH₂溶解在50%DMSO（二甲基亚砜）中，储存液的浓度是15mM。 在实验之前用生理盐水将其稀释到1.5mM的工作浓度。

侧脑室注射和组织制备

侧脑室注射按照Haley和McCormick描述的在清醒小鼠中的操作 方法进行操作。每只小鼠注射的寡肽ASQFFGLM-NH₂或fluo-寡肽 ASQFFGLM-NH₂的最终剂量是6nmol，注射体积是4μl。

我们前期的研究结果显示侧脑室注射寡肽ASQFFGLM-NH₂后，在20 min内具有明显的镇痛效果，因此本实验的时间点选择为5、10和20min 三个时间点。在注射FAM-寡肽ASQFFGLM-NH2或者寡肽ASQFFGLM-NH₂（每只小鼠6nmol）后，在相应的时间点，断颈处死小鼠，注射位点 的准确性由显微测量所验证。在对照组中，向小鼠侧脑室注射4μl生 理盐水。然后，将注射寡肽ASQFFGLM-NH₂或者生理盐水的小鼠脑迅速取 出，保存在-80℃冰箱中以供进一步实验。迅速将注射FAM-寡肽 ASQFFGLM-NH₂的小鼠脑取出，固定在含有4%多聚甲醛（Sigma）的0.1M 的pH7.4的磷酸盐缓冲液中24h，在冰冻切片(JUNG Tissue freezing  medium，LEICA，Germany)之前用30%蔗糖溶液脱水。

冠状切片和显微镜观察

每只小鼠脑冷冻在-20℃，切片厚度为10μm。然后脑组织切片被 保存在玻片上。切片保存在4℃，12h内完成显微观察和拍照。样品用 相差和荧光显微镜观察（NIKON TE2000-U）。根据成年小鼠脑结构图集 鉴定解剖结构。

反转录和实时定量PCR

根据商品使用说明书，使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad， CA)从每个冰冻的脑组织中提取总RNA。简而言之，用研钵将脑组织磨 碎，然后根据每100mg加入1ml TRIzol的剂量加入TRIzol。在所有 实验中，用逆转录试剂盒（Gibco BRL）将5μg总RNA逆转录成cDNA， 最终体积为50μl。

引物序列如下，这与我们之前发表的工作中的引物序列相同[7]：

NK1受体(F):5’-TGGACTCTGATCTCTTCCCCAACA-3’

NK1受体(R):5’-GGACCCAGATGACAAAGATGACCACTT-3’

PPT-C(F):5’-CGGGCCATCAGTGTGCACTA-3’

PPT-C(R):5’-GGAATCCCCGTCCCCAGCAT-3’

PPT-A(F):5’-GAAATCGATGCCAACGATGATC-3’

PPT-A(R):5’-AGGCTTGGGTCTTCGGGCGATTCT-3’

MOR(F):5’-ATCCTCTCTTCTGCCATTGGT-3’

MOR(R):5’-TGAAGGCGAAGATGAAGACA-3’

POMC(F):5’-AGATTCAAGAGGGAGCTGGA-3’

POMC(R):5’-CTTCTCGGAGGTCATGAAGC-3’

KOR(F):5’-CCGATACACGAAGATGAAGAC-3’

KOR(R):5’-GTGCCTCCAAGGACTATCGC-3’

PDYN(F):5’-CGGAACTCCTCTTGGGGTAT-3’

PDYN(R):5’-TTTGGCAACGGAAAAGAATC-3’

DOR(F):5’-AAGTACTTGGCGCTCTGGAA-3’

DOR(R):5’-GCTCGTCATGTTTGGCATC-3’

PENK(F):5’-AACAGGATGAGAGCCACTTGC-3’

PENK(R):5’-CTTCATCGGAGGGCAGAGACT-3’

GAPDH(F):5’-AGGAGCGAGACCCCACTAACAT-3’

GAPDH(R):5’-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’

用ABI7300实时PCR检测系统设备进行相对定量实时PCR检测上述 基因在mRNA水平的表达变化情况，将GAPDH作为内参基因。阴性对照 用蒸馏水取代cDNA。在每次实时定量PCR后，做一次溶解曲线分析。 每个靶标基因的标准表达水平用2-^△△Ct方法计算（Livak KJ， Schmittgen TD(2001)Analysis of Relative Gene Expression Data  Using Real-Time Quantitative PCR and the2-^ΔΔCT Method.Methods 25:402-408.），公式为△△Ct=(Ct,Target－Ct,GAPDH)Time x(Ct,Target－Ct,GAPDH)Time0。Time x表示任意时间点（5，10和 20min），time0代表靶基因标准化到对照GAPDH（生理盐水组）。每 次实验为一式三份，实验至少进行三次独立的重复。所有结果表示成平 均值±标准差（SEM）。

蛋白质印迹

使用考马斯亮蓝蛋白定量法(Pierce Chemical Co.)测定总蛋白浓 度，使用牛血清白蛋白(BSA，Sigma)作为标准蛋白。

蛋白进行SDS变性聚丙烯酰胺胶电泳，之后电转到硝酸纤维素膜上。 接着，将硝酸纤维素膜放置在含有5%脱脂牛奶TBST中室温孵育1h， 然后一抗孵育过夜(β-actin(1/10000，Bioworld)，POMC(1:10000， ABGENT)，MOR(1/10000，Epitomics)，NK1受体(1/500， Proteintech)和DOR(1/500，Bioworld))。在这之后，二抗室温孵育 2h（β-actin、DOR、MOR和TACR1的二抗是HRP-羊抗兔IgG(1/5000， Bioworld)，POMC二抗是HRP-兔抗羊IgG(1/5000，Bioworld)）。最 后在化学发光成像仪(Sage Creation)上显色。蛋白分子量大小与预染 蛋白marker(Fermentas)进行对比。

为了分析western bloing数据，对照的灰度被定义为100%，其数 值由Quantity One软件(Bio-world)测定。样品的灰度根据对照灰度被 以百分比的形式输出。所有的数据来源于至少独立的三次重复实验。

数据分析

所有的数据来源于至少独立的三次重复实验。数据以平均值±SEM 形式表示。所有的数据用SPSS软件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA) 分析。P值＜0.05被认为具有显著性差异。

结果

1、给小鼠侧室注射寡肽ASQFFGLM-NH₂后，其在脑中的分布位点

在荧光显微镜下，fluo-寡肽ASQFFGLM-NH2肽在蓝光激发下显示绿 光。给侧脑室注射药物10min后，fluo-寡肽ASQFFGLM-NH₂主要分布在 脑室以及几个与脑室相邻的结构。然而，fluo-寡肽ASQFFGLM-NH₂和 fluo-r/mHK-1主要的不同分布位点是，在fluo-寡肽ASQFFGLM-NH₂处理 组中，没有在导水管灰质(PAG)和E/OV发现绿色荧光。

2、编码NK1受体和不同的前速激肽原在mRNA水平的表达特征

我们采用实时定量RT-PCR的方法比较研究了NK1受体和前速激肽原 在mRNA水平的表达变化（图1）。其中管家基因GAPDH用来做内参。在 实时定量PCR实验中，2-^ΔΔCt方法被用于分析基因表达的相对变化。与 对照组相比（生理盐水，标准化为1），侧脑室注射寡肽ASQFFGLM-NH₂后5min、10min和20min的NK1受体的mRNA值分别是0.91±0.05， 0.93±0.04and0.87±0.06（图1a，A）。5min、10min和20min 的PPT-A mRNA值分别是0.99±0.06、0.93±0.17和0.96±0.09(图 1a，B)。5min、10min和20min的PPT-C mRNA值分别是0.96±0.08、 1.10±0.11和0.96±0.03（图1a，C）。数据分析表明对照和所有寡 肽ASQFFGLM-NH₂处理组的寡肽ASQFFGLM-NH₂无显著性差异，这表明在 小鼠中，NK1受体和前速激肽原的mRNA表达水平不受侧脑室注射寡肽 ASQFFGLM-NH₂的影响。

3、编码内源性阿片受体和阿片肽的mRNA的表达特征

利用实时定量RT-PCR技术，我们发现，与对照相比，寡肽 ASQFFGLM-NH₂处理组的DOR在mRNA水平上发生显著增强。侧脑室注射 寡肽ASQFFGLM-NH₂后5、10和20min时间点的值分别是601.7±137.0、 386.1±83.1和254.3±68.7（图2e，E）。然而，DOR的内源性配体PENK 在mRNA水平没有发生显著变化，在侧脑室注射药物后，5、10和20min 时间点的值分别是1.08±0.11，0.94±0.10和0.97±0.08（图2d， B）。MOR（图2a，A）、POMC(MOR的一个内源性配体，图2b，B)，KOR （图2c，C）和PDYN(KOR的一个内源性配体，图2d，D)在药物处理后 在mRNA的表达水平均未发生显著变化。

4、小鼠侧脑室注射寡肽ASQFFGLM-NH₂后导致DOR受体蛋白的表达 显著增高

最后，我们检测了由侧脑室注射寡肽ASQFFGLM-NH₂引起的DOR转录 本的上调是否与DOR蛋白的表达增加相关。在图3D中可以看到，与对 照组相比，经寡肽ASQFFGLM-NH₂处理后，DOR蛋白的表达发生了显著上 调。在5、10和20min时间点，DOR蛋白的表达量分别是1.78±0.28， 3.26±0.50和5.29±0.86（图3D）。此外，我们也检测了NK1受体、 MOR和POMC的转录表达与它们各自的蛋白表达的相关性，由图3A-C的 结果可见这几种蛋白在对照组与hHK-1的之间没有发生显著变化。

实施例2

材料和方法

动物

雄性和雌性的ICR小鼠（20±1.0g）由杭州师范大学动物中心（中 国杭州）随机提供。所有动物实验程序由浙江理工大学动物饲养和使用 委员会批准，并且符合1986年11月24号欧共体委员会指令 (86/609/EEC)。所有的动物饲养在12小时光/暗周期的23℃-25℃环境 中，并且在实验开展前提供标准的食物和水。所有实验过程中尽可能 减少小鼠所受到的伤害和痛苦。

多肽

寡肽ASQFFGLM-NH₂多肽由中肽公司（中国杭州）使用固相多肽合成 法合成，并且使用高效液相（HPLC）纯化，其纯度达到98%。寡肽 ASQFFGLM-NH₂溶解在生理盐水中，工作液浓度是1.5mM。

侧脑室注射和甩尾实验

侧脑室注射按照Haley和McCormick描述的在清醒小鼠中的操作 方法进行操作。每只小鼠注射的寡肽ASQFFGLM-NH₂最终剂量是6nmol， 注射体积是4μl。在侧脑室注射人HK-1(4-11)后，马上皮下注射 2mg/kg的吗啡，然后用温浴甩尾实验检测联合注射这两种药物对小鼠 急性疼痛的影响。在温浴甩尾实验中，每只小鼠只用一次。将小鼠尾部 1/3浸入48.5℃的恒温水浴中，从浸入开始到小鼠自发将尾部甩出水浴 的时间间隔定义为甩尾潜伏期。每只小鼠在实验前先检测甩尾潜伏期， 并筛选甩尾潜伏期在2.5-4.5s的小鼠进行实验研究，过于迟钝和过于 敏感的小鼠都弃去不用。为了避免小鼠尾部被烫伤，小鼠甩尾潜伏期的 最大值为15s。每只小鼠每次测甩尾潜伏期的时间间隔为10s，最后四 次的甩尾潜伏期的平均值作为用药处理前的甩尾潜伏期，且这四次甩尾 潜伏期的变异不能超过10%。联合注射人HK-1(4-11)和吗啡后，检测药 物注射后10，20，30，40，50和60分钟各自的甩尾潜伏期。

镇痛作用用下列公式进行计算：

甩尾潜伏期的变化百分率=[（用药后的甩尾潜伏期-用药前的基础 甩尾潜伏期）/用药前的基础甩尾潜伏期]*100%

数据分析

所有的数据来源于至少独立的三次重复实验。数据以平均值±SEM 形式表示。所有的数据用SPSS软件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA) 分析。P值＜0.05被认为具有显著性差异。

结果

侧脑室注射人HK-1(4-11)联合皮下注射吗啡后的协同镇痛效果

从图4可以看出，侧脑室注射人HK-1(4-11)能显著增强皮下注射 的吗啡的镇痛效果，在注射后一小时的时间内，每个10分钟检测到的 镇痛增强的幅度大约是原来吗啡镇痛效果的两倍。由此可见，侧脑室注 射人HK-1(4-11)联合皮下注射吗啡具有强效的协同镇痛效果。

本领域普通技术人员应当理解，可以在本发明的实践中采用除具体 例示那些外的方法和原材料等而无需过度实验。任何此类方法和原材料 等的所有的本领域已知的功能等价物都预期包括在本发明中。本领域技 术人员还应当理解，可对本说明书及权利要求书中描述的本发明进行各 种变动和修饰，且本发明包括所有此类变动和修饰。本发明还包括本说 明书中单独或同时提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以 及所述步骤或特征中的任何2个或更多个的任何和所有组合。