能够鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法

技术领域

本发明属于分子标记鉴定领域，特别涉及一种能够鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法。

背景技术

青菜（Brassica chinensis L.）也叫小白菜、不结球白菜，属十字花科芸薹属，为一年生或二年生草本，是重要的蔬菜和油料作物。青菜原产中国，但是近年来东南亚及欧美等一些国家也逐步引种栽培，目前成为世界性的蔬菜。其中香青菜不仅是我国独有的青菜品种，而且是苏州地方传统特色珍稀蔬菜品种。至今已有100多年的栽培历史，主要种植在沿东太湖及太湖西南岸，涉及吴江的震泽、横扇、七都、桃源以及松陵、平望、盛泽等镇的部分地区。由于吴江香青菜香味浓郁，品质柔嫩，风味独特，其优势别的地方无法复制，2009年，经农业部评定，吴江香青菜成为江苏省省首批、苏州市第一个国家农产品地理标志登记保护的农产品。目前对吴江香青菜的鉴别主要依据其形态学特征，如植株半披张、叶片长椭圆形、叶缘程浅波纹皱褶、叶面邹成波状突起等。但由于大部分青菜品种苗期相似，直到成株才开始表现出品种的特性，所以对其品种的鉴定往往需要一定时间。因此，为了更加有效地区分外形相似的不同青菜品种，保护地理标志产品的种质资源，开发出稳定、准确地鉴别地理标志产品的技术体系迫在眉睫。

近年来，DNA分子标记技术逐步成熟和完善，在遗传图谱构建、品种鉴定、亲缘关系分析和基因定位等方面得到了广泛的应用。目前常用的DNA分子标记主要有基于DNA分子杂交的RFLP、小卫星DNA等和基于PCR反应的RAPD、SCAR、SSR、ISSR、SRAP等。其中序列特异性扩增区域（Seqμence characterized amplified regions, SCARs）标记通常是由RAPD、SRAP、ISSR标记转化而来，是将上述分子标记筛选出的特异标记片段进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异引物，用于对特征扩增区域的特异性扩增。SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，是一种显性标记，具有稳定性好、可重复性强等优点，目前已成为育种实践中能直接应用的首选标记。

虽然目前DNA分子标记技术在青菜中已取得了一定的研究成果，但主要集中在遗传多样性和遗传图谱构建方面，在品种鉴定方面的报道大多是通过SSR指纹图谱对青菜品种进行鉴别，但由于该方法操作繁琐、重复性差，并且不是可直接应用的专一性、特异性分子标记，因此不适合用于稳定、快速、准确的品种鉴别体系的开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法，通过提供鉴别吴江香青菜的一个DNA片段、一组特异性鉴别引物和一种鉴别方法，实现对吴江香青菜品种的特异性鉴定，为保护地理标志产品的种质资源提供有力的技术支持。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一个能够在吴江香青菜中扩增出特异性条带的ISSR引物，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示。

本发明所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的引物是通过22条ISSR引物对香吴江青菜和其它10种江淮地区主栽的青菜品种（包括上海青、小八叶、黑心乌、中其白、苏州青、五月慢、高梗白、矮脚黄、四月慢和黄心乌）进行PCR扩增，筛选出的能够在吴江香青菜中扩增出特异性条带的引物。

本发明涉及一个吴江香青菜特异性DNA片段，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明所述核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的基因是使用核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的引物在吴江香青菜中扩增出的一条特异性条带，该扩增条带只出现在吴江香青菜中，而在其它青菜品种中没有。将该特异性条带进行克隆和测序获得其核苷酸序列。

本发明涉及一组特异性鉴别吴江香青菜的SCAR引物，其中上游引物为SEQ ID NO.3，下游引物为SEQ ID NO.4，分布对应于SEQ ID NO.2片段的11-33nt及1168-1191nt位点。

本发明提供一种吴江香青菜的DNA分子鉴别方法，其特征在于利用特异性鉴别吴江香青菜的SCAR引物对待检青菜品种的10个个体DNA样品进行PCR反应，PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。在1181bp处出现扩增条带的样品为吴江香青菜，而相同部位没有出现条带的样品不是香青菜。

本发明所述的鉴别吴江香青菜的PCR反应体系为20 μl，其组分及终浓度为：DNA模板（20 ng/μl）1.0 μl，2×反应混合物（含20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，400 μM的dNTPs，溴酚蓝）10.0 μl，引物（10 mM）各0.8 μl，Taq DNA 聚合酶（2.5U/μl）0.4 μl，最后用双蒸水补齐至20 μl。PCR程序为：94℃，5min预变性；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8 min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，电压80V，电泳0.5h后用凝胶成像系统观察、拍照，用2000bp的DNA ladder作为分子量标记。

有益效果：本发明是首次对国家农产品地理标志登记保护的农产品——吴江香青菜进行分子标记的研究，本发明提供的鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR标记方法具有操作简单、灵敏度高、重复性好等优点，能够实现对吴江香青菜品种的特异性鉴定，对于保护地理标志产品的种质资源具有重要的意义。

附图说明

图1是香青菜和10个其它青菜品种的ISSR引物（SEQ ID NO.1）扩增图谱。

泳道1-11从左至右依次为：香青菜、上海青、小八叶、黑心乌、中其白、苏州青、五月慢、高梗白、矮脚黄、四月慢和黄心乌，泳道M为DNA Marker。

图2是香青菜和其它青菜品种各10个单株的ISSR-SCAR（SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4）检测图谱。

A为香青菜，B为上海青，C为小八叶；D为黑心乌；E为中其白；F为苏州青；G为五月慢；H为高梗白；I为矮脚黄；J为四月慢；K为黄心乌。泳道1-10为该品种的10个不同单株，泳道M为DNA Marker。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

1、待检样品DNA的提取

选取待检的植物生长状况良好的植株（表1），采集健康嫩叶100 mg，利用Easy Pure Plant Genomic DNA Kit试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），参照说明书，提取样品总DNA。用核酸蛋白检测仪（eppendorf，美国）检测DNA的浓度及纯度，调整DNA浓度为20ng/μl，并将DNA样品于-20℃保存备用。

表1 实验材料表

2、ISSR引物的筛选

PCR反应在BioMetra T1型PCR仪上进行，反应体系为20 μl，其组分及终浓度为：20 ng DNA模板（20 ng/μl） 1.0 μl，2×Reaction Mix（20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl2，400 μM的dNTPs，溴酚蓝）10.0 μl，引物（10 mM）各0.8 μl，Taq DNA 聚合酶 (2.5U/μl) 0.4 μl，最后用双蒸水补齐至20 μl。PCR程序为：94℃，7 min预变性；94℃变性1min，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物经3.0%琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭（EB）染色，电压80V，电泳1.5h。用凝胶成像系统观察、拍照，用2000bp的 DNA ladder作为分子量标记。

3、ISSR-SCAR克隆及测序

经过筛选22条ISSR引物，其中序列SEQ ID NO.1的引物能在香青菜中扩增出特异性条带。利用上海捷瑞生物工程有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）对该特异性条带进行回收、纯化。连接反应参照pMD19-T Vector（购自Takara公司）说明书，反应体系10 μl，包括以下组分：Vector 1μl，Solution I 5μl，DNA 4 μl，4℃过夜连接。次日，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自Takara公司）。具体步骤为：取5 μl连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，42℃热激90 s，冰浴5 min，加500 μl液体SOC溶液，于37℃，180 rpm的摇床中培养1小时，涂平板，放在培养箱中过夜培养。次日，挑取单菌落，用通用引物M13和RV-M进行菌落 PCR 检验，将含有正确条带的克隆交由南京锐真生物技术有限公司进行测序。

4、ISSR-SCAR标记的验证

根据本发明中吴江香青菜的特异性序列SEQ ID NO.2，设计出一组特异性引物（SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4）用于SCAR反应。具体为：以吴江香青菜和其它10个青菜品种为待检样品，每个品种随机选取10个个体，用合成的SCAR引物进行品种特异性单株验证，反应体系为20 μl，其组分及终浓度为： DNA模板（20 ng）1 μL，2×Reaction Mix（20 mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl₂，400 μM的dNTPs，溴酚蓝）10.0μl，引物（10 μmol/L）各为0.8 μl，Taq DNA聚合酶（2.5U/μl）0.4 μl，最后用双蒸水补齐至20 μl。扩增程序为：94℃，5 min预变性；94℃变性45 s，55℃退火45s ，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸8 min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，电压80 V，电泳0.5 h后用凝胶成像系统观察、拍照，用2000 bp的 DNA ladder作为分子量标记。