一种奶牛早期妊娠阶段血清中的差异蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及奶牛饲养领域，具体涉及一种奶牛早期妊娠阶段血清 中的差异蛋白及其用途。

背景技术

奶牛繁殖性能的好坏，不仅影响奶牛数量的增加和质量的提高， 还影响奶牛的生产性能和经济效益，因此，奶牛的妊娠率受到各国奶 牛业的广泛重视。

目前的统计结果显示，尽管奶牛的受精率达90％，但是平均产犊 率只有40％～55％，约70％～80％的胚胎/胎儿损失发生在妊娠前3 周，其中14～18天母体妊娠识别时期的早期胚胎丢失为主。

因此，尽早对人工授精后的奶牛进行妊娠诊断，及时分辨妊娠奶 牛和空怀奶牛，对妊娠奶牛进行有效监控，防止胚胎损失；对空怀奶 牛实施同期发情和再次人工授精，可提高牛群的妊娠率和繁殖效率。

目前，通常采用直肠检查和ELISA试剂盒诊断奶牛是否妊娠， 直肠触诊法是通过实践经验丰富的工作人员触摸奶牛直肠，劳动强度 较大、工作效率较低，难以在奶牛妊娠早期进行诊断，容易造成奶牛 的产犊间隔延长、繁殖率降低、产奶量减少，增加了饲养管理的成本， 降低了奶牛养殖的经济效益。采用直肠触诊法进行诊断时，最早可于 奶牛人工授精后35天进行诊断，而且容易触及子宫和胎膜，对早期 胚胎造成伤害，甚至导致母牛直肠组织破坏。

ELISA(酶联免疫吸附实验)试剂盒是通过判断奶牛血清中的 PAG(妊娠相关糖蛋白)含量，进而判断受精28天以上的奶牛是否 妊娠，不能准确判断奶牛受精后一个情期内(21天)是否妊娠，进 而难以排查受精后14～18天的奶牛是否为空怀奶牛。

专利号为201410294733.0的发明专利申请提供了一种基于 BRCA2蛋白、mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途，该方法根据 BRCA2蛋白在妊娠奶牛和空怀奶牛体内的差异，判断奶牛是否妊娠， 该方法只能在奶牛人工授精后18天进行早期妊娠诊断，而且由于该 蛋白在妊娠早期阶段的表达趋势并不一致，能否用于奶牛早期胚胎丢 失的预警也尚无界定。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种奶牛早 期妊娠阶段血清中的差异蛋白，所述差异蛋白为妊娠差异蛋白、空怀 差异蛋白和反向差异蛋白，妊娠差异蛋白包括ARHGAP42、EFEMP1、 GTF2F1、LOXL2、CPB2、LYST、RDH11、TRABD、TRIM67和 TRMT112，空怀差异蛋白包括IGL，反向差异蛋白包括HBB和HP； 所述差异蛋白用于判断奶牛是否妊娠。

一种使用权利要求1所述的奶牛早期妊娠阶段血清中的差异蛋 白判断奶牛妊娠的方法，检测受精时间大于等于14天的奶牛血清中 差异蛋白含量是否符合下列条件之一，若符合，则该奶牛为妊娠奶牛， 所述条件为：

(1)血清中ARHGAP42蛋白含量大于等于未受精奶牛血清中 ARHGAP42蛋白含量的2.80倍；

(2)血清中EFEMP1蛋白含量大于等于未受精奶牛血清中 EFEMP1蛋白含量的2.03倍；

(3)血清中GTF2F1蛋白含量大于等于未受精奶牛血清中 GTF2F1蛋白含量的2.83倍；

(4)血清中LOXL2蛋白含量大于等于未受精奶牛血清中 LOXL2蛋白含量的2.04倍；

(5)血清中CPB2蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中CPB2 的0.76倍；

(6)血清中LYST蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中LYST 的0.65倍；

(7)血清中RDH11蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中RDH11 的0.23倍；

(8)血清中TRABD蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中 RDH11的0.62倍；

(9)血清中TRIM67蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中 TRIM67的0.18倍；

(10)血清中TRMT112蛋白含量小于等于未受精奶牛血清中 TRMT112的0.60倍；

(11)血清中HBB蛋白含量x₁为未受精奶牛血清中HBB蛋白 含量y₁的0至0.73倍；

(12)血清中的HP蛋白含量X₂为未受精奶牛血清中HP蛋白含 量Y₂的0至0.67倍；

(13)同时符合条件(2)至(12)中两个或两个以上。

在上述技术方案的基础上，该方法之后还包括以下步骤：

判断妊娠奶牛血清中的ARHGAP42、EFEMP1、GTF2F1和/或 LOXL2蛋白在受精后14天至28天是否一直上调表达，若是，该奶 牛的胚胎稳定，若否，该妊娠奶牛存在胚胎丢失的风险；

或者判断妊娠奶牛血清中的CPB2、LYST、RDH11、TRABD、 TRIM67和/或TRMT112蛋白在受精后14天至28天是否一直下调表 达，若是，该奶牛的胚胎稳定，若否，该妊娠奶牛存在胚胎丢失的风 险。

在上述技术方案的基础上，判断奶牛为妊娠奶牛之后还包括以下 步骤：判定所述妊娠奶牛中x₁＞0.82y₁时，该奶牛存在流产风险。

在上述技术方案的基础上，判断奶牛为妊娠奶牛之后还包括以下 步骤：判定所述妊娠奶牛中X₂＞0.69Y₂时，该奶牛存在流产风险。

一种使用权利要求1所述的奶牛早期妊娠阶段血清中的差异蛋 白判断奶牛空怀的方法，该方法包括以下步骤：

判定受精时间大于等于14天的奶牛血清中IGL蛋白含量为未受 精奶牛血清中蛋白含量的1.43倍以上，奶牛受精失败，该奶牛为空 怀奶牛；或/和判定受精时间大于等于14天的奶牛血清中HBB蛋白 含量x₁为未受精奶牛血清中HBB蛋白含量y₁的2.01倍以上；或/和 判定受精时间大于等于14天的奶牛血清中的HP蛋白含量X₂为未受 精奶牛血清中HP蛋白含量Y2的3.53倍以上。

在上述技术方案的基础上，判定奶牛为空怀奶牛之后，还包括以 下步骤：对空怀奶牛实施同期发情和再次人工授精。

一种基于早期妊娠阶段差异蛋白的奶牛妊娠诊断试纸，所述试纸 用于检测妊娠差异蛋白和/或空怀差异蛋白，所述试纸上设置有 ARHGAP42、EFEMP1、GTF2F1、LOXL2、CPB2、LYST、RDH11、 TRABD、TRIM67、TRMT112或/和IGL对应的免疫吸附剂、标记物 和显色剂。

一种基于早期妊娠阶段差异蛋白的奶牛妊娠诊断试剂盒，所述试 剂盒用于检测妊娠差异蛋白和/或空怀差异蛋白，所述试剂盒包括妊 娠差异蛋白和/或空怀差异蛋白、妊娠差异蛋白抗体和/或空怀差异蛋 白抗体、妊娠差异蛋白抗体标记物和/或空怀差异蛋白抗体标记物。

一种基于早期妊娠阶段差异蛋白的奶牛早期妊娠保胎素，所述保 胎素包括ARHGAP42、EFEMP1、GTF2F1和/或LOXL2蛋白。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明中的判断奶牛是否妊娠的差异蛋白，包括妊娠差异 蛋白、空怀差异蛋白和反向差异蛋白，通过检测受精14天的奶牛血 清中上述蛋白，能够准确判断对应奶牛是否妊娠，而且诊断的时间提 前。

(2)本发明能够准确判断奶牛是否为空怀奶牛，便于工作人员 及时对空怀奶牛实施同期发情和再次人工授精，能够提高牛群的妊娠 率和繁殖效率。

(3)本发明能够通过检测奶牛体内妊娠差异蛋白或/和反向差异 蛋白的含量，判断妊娠奶牛是否存在胚胎丢失的风险，方法比较简单， 结果比较准确。

(4)本发明将妊娠奶牛血清中持续上调的蛋白作为保胎素原料， 为奶牛妊娠早期保胎素生物制品的研发提供了蛋白资源，能够有效促 进妊娠的维持，减低妊娠识别时期胚胎丢失的风险。

附图说明

图1为本发明实施例中NFE2L2蛋白的电泳图；

图2为本发明实施例中EFEMP1蛋白的电泳图；

图3为本发明实施例中CD44蛋白的电泳图；

图4为本发明实施例中KRT18蛋白的电泳图。

图中：PH表示妊娠牛，NPH表示空怀牛。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。

参见图1所示，本发明实施例提供一种奶牛早期妊娠阶段血清中 的差异蛋白及其用途，受精奶牛血清蛋白的分离和鉴别方法包括以下 步骤：

S1：制备蛋白样品

S101：对若干头奶牛进行人工授精，采集每头奶牛人工授精0 天、14天、18天、21天、28天后的血样，每次采集血样后，均将血 样在转速为5000r/min的条件下离心15min，吸取上清液，得到血清。

S102：采用直肠检测法判断人工授精60天的奶牛是否已经妊娠， 根据直肠检查的结果，任意选取9头妊娠奶牛人工受精14天、18天、 21天、28天后的血样分别等量混合，得到4个不同时间点的妊娠样 本：A1，A2，A3，A4；任意选取12头空怀奶牛，将12头空怀奶牛 人工受精14天、18天、21天、28天后的血样分别等量混合，得到4 个不同时间点的空怀样本：B1，B2，B3，B4；所有妊娠奶牛和空怀 奶牛受精后0天的样本混合成对照样品，即AB1。

S103：将所有妊娠样本、空怀样本和对照样本进行如下处理：去 除样本中的高丰度蛋白质后，取20μl样本并加入450μl的Binding  Buffer(结合缓冲)溶液稀释，得到对应的样本稀释液。

将850μl Binding Buffer溶液加入去血清高丰度蛋白柱后，将所有 的样本稀释液依次加入去血清高丰度蛋白柱，并收集对应的穿流液， 得到对应的样本穿流液。分别将所有的样本穿流液放入超滤离心管中 离心至100μl，得到对应的样本浓缩液，测定每个样本浓缩液的浓度。

S104：分别取20μg所有样本的样本浓缩液，向每份样本浓缩液 中加入4μg上样缓冲液，置于沸水中保温5min后，在离心力为14000g (g为离心力单位)的条件下离心20min，取上清液，用12.5％的 SDS-PAGE中电泳分离后，使用考马斯亮蓝进行染色，得到所有样本 的样本浓缩液的电泳图谱。

S2：酶解、肽段定量和肽段标记

分别取200μg所有样本的样本浓缩液，向每份样本浓缩液中加入 30μlSDT溶液，SDT溶液由4％SDS(十二烷基硫酸钠)、 100mMTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷)、100mM DTT(二硫苏糖醇) 混合后调节pH至7.6而制成，并混合均匀，置于沸水中保温5min后， 冷却至室温并加入200μl UAbuffer(尿素缓冲溶液)混合均匀，放入 超滤离心管中，在离心力为14000g的条件下离心30min，去除滤液 后，加入100μl浓度为50mM的IAA(Indol-yl-3-Acetic Acid，吲哚乙 酸)溶液，在转速为600rpm的条件下震荡1min，并于室温下避光放 置30min后，在离心力为14000g的条件下离心20min，加入100μl UA  buffer(sodium hypochlorite buffer，次氯酸钠缓冲溶液)，在离心力为 14000g的条件下离心20min后，再次加入100μl UA buffer，在离心 力为14000g的条件下离心20min后，加入40μl Trypsin buffer(胰酶 缓冲溶液，由2μg的胰酶溶解于40μl的分散液中制成)，在震荡速度 为600rpm的条件下振荡1min后，在温度为37℃的条件下静置16～ 18h，在离心力为14000g的条件下离心10min后，得到滤液，滤液为 OD280肽段溶液，定量分析所有OD280肽段溶液，并测定其浓度。

分别取100μg所有的OD280肽段溶液，分别加入由ABI公司生 产的型号为iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit的试剂盒(一种用于 对肽段进行同位素相对标记与绝对定量的试剂盒)进行标记，形成8 种相对分子质量为145的等量异位标签。

参见表1、表2所示，第一空白样本AB1对应的OD280肽段溶 液被试剂盒Kit中相对分子量为113的报告基团标记。

第一待测样本A1对应的OD280肽段溶液被试剂盒Kit中相对分 子量分别为114、118的报告基团标记；第二待测样本A2被相对分子 量分别为115、119的报告基团标记；第三待测样本A3被相对分子量 分别为116、118的报告基团标记；第四待测样本A4被相对分子量分 别为117、119的报告基团标记。

第一对比样本B1对应的OD280肽段溶液被试剂盒Kit中相对分 子量为114的报告基团标记；第二对比样本B2被相对分子量为115 的报告基团标记；第三对比样本B3被相对分子量为116的报告基团 标记；第四对比样本B4被相对分子量为117的报告基团标记。

表1 样品标记

表2 样品标记

S3：对所有标记后的OD280肽段进行阳离子交换(SCX)分级

将表1中的所有OD280肽段溶液混合加入SCX分级仪器AKTA  Purifier100，每组根据SCX色谱图收集穿流洗脱液若干份，作为标记 肽段溶液。将所有的标记肽段溶液冻干后加入型号为C18色谱柱中 脱盐，得到对应的脱盐多肽溶液。

S4：液-质分析

S401：高效液相色谱分析

将所有的脱盐多肽溶液分别加入高效液相色谱进行分离。高效液 相色谱分离过程中，选用浓度为0.1％的甲酸水溶液作为第一流动相， 选用浓度为0.1％的甲酸乙腈水溶液作为第二流动相。

向高效液相色谱的色谱柱中加入体积分数为95％的第一流动相 和体积分数为5％的第二流动相，冲洗至高效液相色谱的基线水平。

分次取5ug的脱盐多肽溶液加入高效液相色谱的进样器，脱盐多 肽溶液经过进样器和上样柱进入分析柱后，调整高效液相色谱的洗脱 液流速至250nl/min进行洗脱。

当洗脱时间为0～100min时，采用体积分数为0％～35％的第一 流动相和体积分数为65％～100％的第二流动相作为洗脱液；当洗脱 时间为100～108min时，采用体积分数为0％～65％的第一流动相和 体积分数为35％～100％的第二流动相作为洗脱液；当洗脱时间为 108～120min时，采用体积分数为100％的第二流动相作为洗脱液。

每份脱盐多肽溶液经过高效液相色谱分离后，均得到对应的分离 纯化多肽。

S402：质谱分析

将所有的分离纯化多肽依次导入型号为Q-Exactive的质谱仪进 行正离子、母离子分析，每份分离纯化蛋白的分析时间均为120min， 正离子、母离子扫描的范围均为300～1800m/z(m-离子的质量数， z-离子携带的电荷数)，一级质谱的分辨率为70000(半峰处峰宽)， 得到每个分离纯化蛋白的MS/MS数据。

以AGC模式进行扫描，离子源参数设置为：电喷雾电压，3e6， 扫描范围为1，动态排除时间为40s。

多肽和多肽碎片的质量电荷比按照以下方式进行采集：每次全扫 描后以动态排除方式获得10个强度最高的峰进行串联质谱MS/MS 扫描，得到二级质谱扫描数据。

二级质谱的分辨率为17500(半峰处峰宽)，二级质谱的电喷雾 电源为27eV。

S5：蛋白鉴定

将质谱分析得到的所有二级质谱扫描数据输入Proteome  Discoverer1.3(蛋白组学分析软件)，通过名称为Mascot的搜索引擎 搜索UniProt(一种蛋白质数据库名称)中的牛蛋白数据库，确定与 牛蛋白数据库中数据匹配的二级质谱扫描数据，并将该二级质谱扫描 数据队员的蛋白作为鉴定蛋白，控制蛋白鉴定的假阳性率在1％以内 (FDR≤1％)。

将所有鉴定蛋白对应的二级质谱扫描数据使用Isobaric Labeling  Multiple File Distiller and Identified Protein iTRAQ Statistic Builder(一 种分析软件)分析软件进行分析，将妊娠奶牛和空怀奶牛血清中鉴定 到的所有蛋白与对照组中对应的蛋白表达情况进行对比，得到同一鉴 定蛋白在妊娠奶牛、空怀奶牛中的差异表达情况，将人工授精后表达 量上升的蛋白作为上调蛋白；将人工授精后表达量降低的蛋白作为下 调蛋白。将上调或者下调1.2倍以上的鉴定蛋白作为差异表达蛋白。

对注释信息不完整的差异表达蛋白(肽段差异表达，但具体蛋白 名称不详)进一步根据牛蛋白质收录号(Accession，核苷酸序列的注 册号)在uniprot数据库(UniversalProteinResource，UniProt是全球 有关蛋白质方面信息最全面的资源库)中与人或鼠中的同源蛋白进行 比对后获得手工注释结果。

本发明中的所有蛋白均能够在uniprot数据库中查询得到，该数 据库是本领域技术人员公认且常用的蛋白质序列及信息数据库。

本试验通过iTRAQ技术在奶牛血清中共鉴定出蛋白439个，其 中有定量信息的蛋白质408个，差异蛋白(FC＝1.2)242个。

鉴定结果如下：

妊娠奶牛血清中特有，空怀奶牛不含有的差异蛋白共109个(以 下简称第一差异蛋白)。

其中，人工授精后14天，下调表达的第一差异蛋白共29个，分 别是ADCY3(adenylate cyclase 3，腺苷酸环化酶3)、AHNAK(AHNAK  nucleoprotein，核蛋白)、ARFGAP3(ADP-ribosylation factor GTPase  activating protein 3，ADP核糖基化因子GTP酶激活蛋白)、C1orf141 (chromosome 1open reading frame 141，一种线粒体蛋白)、CD2AP (CD2-associated protein，CD2相关蛋白质)、CFP(cyan fluorescent  protein，青色荧光蛋白)、CPB2(carboxypeptidase B2，胰羧肽酶B2 抗体)、CSNK1A1(casein kinase 1，alpha 1，小鼠抗人酪蛋白激酶1α 抗体)、E2F7(Anti-E2F7，转录调节因子E2F7抗体)、FN1(fibronecti， 纤维连接蛋白)、GPI(glucose-6-phosphate isomerase，葡萄糖-6-磷酸 异构酶)、H2BFM(H2B histone family，member M，H2B组蛋白家 族M蛋白抗体)、HLA-A(major histocompatibility complex，class I， A)、IL2RB(interleukin 2receptor，beta)、KIRREL(Kin ofIRRE-like  protein 1，一种由KIRREL基因所编码的人类蛋白质)、LYST (lysosomal trafficking regulator，溶酶体转运调节蛋白)、METTL22 (microtubule associated protein，微管结合蛋白)、NAMPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase，尼克酰胺磷酸核糖转移酶)、 NCF1(neutrophil cytosolic factor 1，重组人中性粒细胞胞浆因子1)、 PPP2R5E(protein phosphatase type 2A regulator activity，蛋白磷酸酶 2A调控因子中的一种)、PRDX2(RecombinantHuman Peroxiredoxin-2， 重组人过氧化物还原酶-2)、PYGB(Glycogen Phosphorylase Brain， 大脑糖原磷酸化酶)、RDH11(RDH11Human Recombinant Protein P01， RDH11人源全长重组蛋白P01)、SDAD1(SDA1domain containing 1)、 SH3PXD2B(SH3and PX domains 2B)、TRABD(TraB domain  containing)、TRIM67(tripartite motifcontaining 67)、TRMT112(tRNA  methyltransferase 11-2homolog)和TRP-TGG3-5(transfer RNA-Pro (TGG)3-5)。

人工授精后14天，上调表达的第一差异蛋白共23个：ADSSL1 (adenylosuccinate synthase like 1)、ARHGAP42(Rho GTPase  activating protein 42，Rho GTP酶激活蛋白42)、ATP2B4(ATPase， Ca++transporting，plasma membrane 4)、C11orf70(chromosome 11 open reading frame 70)、DEFB129(defensin，beta 129，防御素β-129)、 EFEMP1(epidermal growth factor-containing fibulin-likeextracellular  matrix proteins，一个与血管新生有关的细胞外基质蛋白)、ERMARD (ER membrane-associated RNA degradation)、FAM169A(family with  sequence similarity 169，member A)、FANCD2(Fanconi anemia， complementation group D2)、GTF2F1(General Transcription Factor IIF， Polypeptide 1，人通用转录因子ⅡF肽1)、H6PD(hexose-6-phosphate  dehydrogenase(glucose 1-dehydrogenase))、KRT1(keratin 1，type II， 角蛋白1)、KRT18(keratin 18，type I，角蛋白18)、KRT2(keratin 2， type II，角蛋白2)、LOXL2(lysyl oxidase-like 2，赖氨酰氧化酶相关 蛋白2)、MCM10(微小染色体维持蛋白10)、ME1(malic enzyme 1， NADP(+)-dependent，cytosolic，细胞质NADP(+)-依赖型苹果酸酶)、 MYH8(myosin-8，肌球蛋白8)、PIEZO2(piezo-type mechanosensitive  ion channel component 2，机械激活离子通道蛋白2)、QSER1 (Glutamine Serine Rich Protein 1，富丝氨酸谷氨酰胺的蛋白)、 RAB11FIP1(Rab11family-interacting protein 1)、SAMD9(Sterile alpha  motif domain-containing protein 9)和TMEM39A(MEM39A  transmembrane protein 39A)。

人工授精后18天，下调表达的第一差异蛋白共30个：ABCF3 (ATP-binding cassette，sub-family F3，三磷酸腺苷结合盒转运蛋白F 亚基3)、ADCY3(adenylate cyclase 3，腺苷酸环化酶3抗体)、AHNAK (AHNAK nucleoprotein，核蛋白2抗体)、ARFGAP3 (ADP-ribosylation factor GTPase activating protein 3，ADP核糖基化 因子GTP酶激活蛋白1抗体)、CFP(complement factor properdin， 补体因子裂解素)、CPB2(Carboxypeptidase B2，胰羧肽酶B2抗体)、 DCLRE1A(DNA cross-link repair 1A)、EIF2S1(Recombinant Human  Eukaryotic Translation Initiation Factor 2Subunit 1Alpha，重组人真核 翻译起始因子2亚基1α)、FN1(fibronectin 1，纤维连接蛋白)、FRMD1 (FERM domain containing 1)、GPI(glucose-6-phosphate isomerase， 葡萄糖-6-磷酸异构酶)、H2BFM(H2B histone family，member M， H2B组蛋白家族M蛋白)、IL2RB(interleukin 2receptor，beta，)、 LRBA(LPS-responsive vesicle trafficking，beach and anchor  containing，)、LYST(lysosomal trafficking regulator，溶酶体转运调节 蛋白)、METTL22(methyltransferase like 22，)、NAMPT(Nicotinamide  phosphoribosyltransferase，烟酰胺磷酸核糖转移酶)、NCF1(neutrophil  cytosolic factor 1，重组人中性粒细胞胞浆因子1)、RDH11(retinol  dehydrogenase 11，视黄醇脱氢酶11)、RNF168(ring finger protein 168， E3ubiquitin protein ligase，环指蛋白168)、RPS23(ribosomal protein  S23，核糖体蛋白S23)、SPARCL1(SPARC-like 1)、TMEM232 (transmembrane protein 232，溶酶体膜蛋白232)、TMEM39A (transmembrane protein 232，溶酶体膜蛋白39A)、TRABD(TraB  domain containing)、TRIM67(tripartite motifcontaining 67)、TRMT112 (tRNA methyltransferase 11-2homolog)、TRMU(tRNA 5-methylaminomethyl-2-thiouridylate methyltransferase)、TRP-TGG3-5 (transfer RNA-Pro(TGG)3-5)和ZNF324(zinc finger protein 324， 锌指蛋白324)。

人工授精后18天，上调表达的第一差异蛋白共35个：APOF (apolipoprotein F，载脂蛋白F)、ARHGAP42、ATP2B4(ATPase， Ca++transporting，plasma membrane 4)、BRCA2(breast cancer 2，early  onset，乳腺癌易感蛋白2)、C8G(complement component 8，gamma  polypeptide)、CILP2(cartilage intermediate layer protein 2，软骨中间 层蛋白2)、CPN2(carboxypeptidase N，polypeptide 2，羧肽酶2)、 DEFB129(defensin，beta 129，防御素β-129)、EFEMP1(epidermal  growth factor-containing fibulin-likeextracellular matrix proteins，一个与 血管新生有关的细胞外基质蛋白)、FANCD2(Fanconi anemia， complementation group D2)、GTF2F1(General Transcription Factor IIF， Polypeptide 1，人通用转录因子ⅡF肽1)、H6PD(hexose-6-phosphate  dehydrogenase(glucose 1-dehydrogenase)、HABP2(hyaluronan binding  protein 2，透明质酸结合蛋白2)、HIST1H2BM(histone cluster 1， H2bm)、HSPA2(heat shock 70kDa protein 2，休克蛋白70-2)、 IGLV1-40(immunoglobulin lambda variable 1-40)、KDM6A(lysine (K)-specific demethylase 6A，组蛋白去甲基化酶)、LOXL2、MASP1 (mannan-binding lectin serine peptidase 1(C4/C2activating component  ofRa-reactive factor)，丝氨酸肽酶1甘露聚糖结合凝集素)、MCM10、 MRE11A(MRE11meiotic recombination 11homolog A，减数分裂重 组11同源物A)、MYH8、NLE1(notchless homolog 1)、NWD2(NACHT  andWD repeat domain containing 2)、PIEZO2、QSER1、RAB11FIP1、 RPL13A(ribosomal protein L13a，核糖体蛋白L13A)、SENP7 (SUMO1/sentrin specific peptidase 7)、SH3PXD2B、SKIV2L2 (superkiller viralicidic activity 2-like 2，解旋酶)、SOD3(superoxide  dismutase 3，超氧化物歧化酶3)、SUGT1(suppressor ofG2allele of  SKP1)、UNC13C(unc-13homolog C)和VPREB1(pre-B lymphocyte 1，B淋巴细胞前体蛋白1)。

人工授精后21天，下调表达的第一差异蛋白共29个：ARFGAP3、 ATP13A3(ATPase type 13A3，三磷酸腺苷合酶)、C1orf141、CFP、 CPB2、DNAH12(dynein，axonemal，heavy chain 12，一种动力蛋白)、 GPI、H2BFM、LYST、MORF4L1(mortality factor 4like 1)、MRE11A、 MYH8、NBEAL1(neurobeachin-like 1)、NCF1、NIN(ninein，GSK3B 作用蛋白)、NWD2、PLA2G7(phospholipaseA2，group VII，蛋白磷 脂酶)、PRDX2、PROZ(protein Z，蛋白质Z)、PYGB、RDH11、 RNF168、RPL13A、SEMA3F(semaphorin 3F，信号素3)、TMEM232、 TMEM39A、TRABD、TRIM67和TRMT112。

人工授精后21天，上调表达的第一差异蛋白共27个：ABCA6 (ATP-binding cassette，member 6，ABC运输蛋白6)、ADSSL1、 ARHGAP42、C11orf70、CSNK1A1、DYNC1H1(dynein，cytoplasmic 1，heavy chain 1，动力蛋白胞浆1重链1)、E2F7、EFEMP1、GTF2F1、 H6PD、HABP2、HSPA2、IGLV1-40、KAT7、KDM6A、LGR4(leucine-rich  repeat containing G protein-coupled receptor 4)、LOXL2、ME1、OFD1 (oral-facial-digital syndrome 1)、OGT(O-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc)transferase，O-GlcNAc糖基转移酶)、PF4(platelet factor 4， 血小板因子4)、SDAD1、SKIV2L2、SUGT1、TRP-TGG3-5、VPREB1 和ZFAT(zinc finger andAT hook domain containing，一种锌指蛋白)。

人工授精后28天，下调表达的第一差异蛋白共29个：ABCA6、 ATP13A3、CD14(CD14molecule)、CPB2、DNAH9(dynein，axonemal， heavy chain 9，一种轴丝动力蛋白)、E2F7、F13B(coagulation factor  XIII，B polypeptide，凝血因子ⅩⅢB肽F13B重组蛋白)、F7 (coagulation factor VII，凝血因子7)、ICOSLG(inducible T-cell  co-stimulator ligand)、IL2RB、LRBA、LYST、MRE11A、NWD2、 PLA2G7、PPP2R5E、PROZ、PYGB、RDH11、RNF168、SDAD1、 TMEM232、TMEM39A、TRABD、TRIM67、TRMT112、TRP-TGG3-5、 UNC13C和USP21(ubiquitin specific peptidase 21，去泛素化酶)。

人工授精后28天，上调表达的差异蛋白共26个，分别是ADSSL1、 ARFGAP3、ARHGAP42、ATP2B4、BRCA2、C11orf70、CES4A (carboxylesterase 4A，羧酸酯酶4A)、DEFB129、EFEMP1、FAM169A、 FANCD2、GTF2F1、HABP2、KAT7、KDM6A、KRT18、LOXL2、 MAD1L1(MAD1mitotic arrest deficient-like 1，有丝分裂阻滞缺陷2 样蛋白1)、ME1、MYH8、OGT、PF4、PIEZO2、RPL13A、SYMPK (symplekin，偶对蛋白)和VPREB1。

由上述分析可知：奶牛受精并成功妊娠后14至28天中，其血清 中持续上调表达的第一差异蛋白(妊娠后蛋白上调的最高倍数h_max) 为：ARHGAP42(h_max为2.80)、EFEMP1(h_max为2.03)、GTF2F1(h_max为2.83)和LOXL2(h_max为2.04)；血清中持续下调表达的第一差异 蛋白为(妊娠后蛋白下调后与为受精奶牛相比的最高含量L_max)： CPB2(L_max为0.76)、LYST(L_max为0.65)、RDH11(L_max为0.23)、 TRABD(L_max为0.62)、TRIM67(L_max为0.18)和TRMT112(L_max为0.60)，所有持续上调表达的第一差异蛋白和持续下调表达的第一 差异蛋白简称为妊娠差异蛋白。

根据这一特征，技术人员可以通过判定受精时间大于等于14天 的奶牛血清中ARHGAP42、EFEMP1、GTF2F1、或LOXL2蛋白含 量是否分别为未受精奶牛血清中蛋白含量2.80倍，2.03倍，2.83倍 或2.04以上，若是，该奶牛为妊娠奶牛；CPB2、LYST、RDH11、 TRABD、TRIM67和/或TRMT112蛋白含量是否分别为未受精奶牛血 清中蛋白含量的0至0.76倍，0至0.65倍，0至0.23倍，0至0.62 倍，0至0.18倍或0至0.60倍，若是，该奶牛为妊娠奶牛。

技术人员在受精14天后判断奶牛已经妊娠后，可以选择 ARHGAP42、EFEMP1、GTF2F1或者LOXL2中的任意一种作为第 一标定蛋白，或者选择CPB2、LYST、RDH11、TRABD、TRIM67 和TRMT112中的任意一种作为第二标定蛋白，并在14天后持续测 定奶牛体内第一标定蛋白(或/和第二标定蛋白)的含量，若第一标 定蛋白的含量持续上调，说明妊娠奶牛体内的胚胎比较稳定；否则， 可能出现流产的情况，工作人员需要采取相应的措施进行保胎，保胎 措施可以为向妊娠奶牛体内注射第一标定蛋白；若第二标定蛋白的含 量持续下调说明妊娠奶牛体内的胚胎比较稳定，否则，可能出现流产 的情况，工作人员需要采取相应的措施进行保胎，保胎措施可以为向 妊娠奶牛体内注射第二标定蛋白的抑制剂。

空怀奶牛血清中特有、妊娠奶牛不含有的差异蛋白共49个，以 下简称第二差异蛋白。

人工授精后14天，下调表达的第二差异蛋白共6个，分别是 ATP12A(ATPase，H+/K+transporting，nongastric，alpha polypeptide， 一种动力蛋白)、ATP6AP1(ATPase，H+transporting，lysosomal  accessory protein 1，一种动力蛋白)、BMP3(bone morphogenetic protein 3，骨形态发生蛋白3)、CRP(C-reactionprotein，C反应蛋白)、NAA35 (N(alpha)-acetyltransferase 35，N-乙酰转移酶)和PRG4(proteoglycan 4，一种蛋白聚糖)；上调表达的第二差异蛋白共8个，分别是APOE (apolipoprotein E，载脂蛋白E)、C5(complement component 5)、 C6orf25(chromosome 6open reading frame 25，一种细胞角蛋白)、 C7(complement component 7)、FLII(flightless I actin binding protein)、 IGL(immunoglobulin lambda locus)、LAMP1(lysosomal-associated  membrane protein 1，溶酶体关联膜蛋白1)和TUBA4A(tubulin，alpha 4a，微管蛋白)。

人工授精后18天，下调表达的第二差异蛋白共9个：APOC3 (apolipoprotein C-III，血清载脂蛋白)、BMP3、BTD(biotinidase， 生物素酶)、CRP、EHHADH(enoyl-CoA，hydratase/3-hydroxyacyl CoA  dehydrogenase，三羟酰辅酶A脱氢酶)、PPARD(peroxisome  proliferator-activated receptor delta一种过氧化物酶)、PRG4、SAA4 (serum amyloidA4，淀粉样蛋白A4)和TTC13(tetratricopeptide repeat  domain 13)；上调表达的第二差异蛋白共16个，分别是APOE、B2M (beta-2-microglobulin，人β2微球蛋白)、C5、C6orf25、CHIA(chitinase， 几丁质酶)、GPX3(glutathione peroxidase 3，谷胱甘肽过氧化酶3)、 HBM(hemoglobin，血红蛋白)、IGL、IGLL1(immunoglobulin  lambda-like polypeptide 1，免疫球蛋白1)、KHNYN(KH and NYN  domain containing)、KRT6A(keratin 6A，type II，角蛋白6A，II型)、 LAMP1、NAA35、PLA2G4A(phospholipase A2，group IVA，磷脂酶 A2-IVA)、SFTPD(surfactant protein D，表面活性蛋白)和VASN (vasorin)。

人工授精后21天，下调表达的第二差异蛋白共7个：AMY2B (amylase，alpha 2B，α—淀粉酶2B)、CA2(carbonic anhydrase II， 碳酸酐酶II)、LDHB(lactate dehydrogenase B，乳酸脱氢酶B)、MASP2 (mannan-binding lectin serine peptidase 2，丝氨酸肽酶2甘露聚糖结 合凝集素)、NAA35、PRG4和TTC13；上调表达的第二差异蛋白共 5个，分别是C7、IGL、KRT6A、OR5B17(olfactory receptor，family 5，subfamily B，member 17，一种G蛋白偶联受体)和PCLO(piccolo  presynaptic cytomatrix protein，神经细胞突触蛋白)。

人工授精后28天，下调表达的第二差异蛋白共18个：ALB (albumin，白蛋白)、C5、C7、CA2、CFI(complement factor I)、 CP(ceruloplasmin ferroxidase，血浆铜蓝蛋白)、CRP、GSN(gelsolin， 凝溶胶蛋白)、HRG(histidine-rich glycoprotein，富组氨酸糖蛋白)、 IGFALS(insulin-like growth factor binding protein，acid labile subunit， 含有对酸不稳定亚基的类胰岛素生长因子结合蛋白)、LDHB、MASP2、 PCLO、PLA2G4A、PPARD、SAA4、TTC13和TUBA4A。

上调表达的第二差异蛋白共14个：BTD、C1QA(complement  component 1，q subcomponent，A chain，一种补体蛋白)、C6orf2 (TRAF3interacting protein 2)、CHIA、COL6A3(collagen，type VI， alpha 3，一种胶原蛋白)、EHHADH、FGL2(fibrinogen-like 2，凝血 酶原酶)、FLII、IGL、IGLL1、INTS6(integrator complex subunit 6)、 PROC(protein C，血浆蛋白C)、SERPINF2(serpin peptidase inhibitor， clade F member 2，一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)和SYNE1(spectrin  repeat containing，nuclear envelope 1)。

由上述分析可知：奶牛受精失败后的14至28天中，其血清中持 续上调表达的差异蛋白为IGL蛋白，简称为空怀差异蛋白。根据这一 特征，技术人员可以在对奶牛进行受精时间大于等于14天时，判定 血清中IGL蛋白含量是否为未受精奶牛血清中蛋白含量的1.43倍以 上，若是，该奶牛为空怀奶牛。

同时，技术人员为避免偶然出现该蛋白导致判断失误，可以对该 奶牛在受精后18天、21天和28天持续观察，若该奶牛血清中的IGL 蛋白一直存在，且呈现持续上调的趋势，可以说明该奶牛一定为空怀 奶牛。在上述判断的基础上，技术人员可以对空怀奶实施同期发情和 再次人工授精，可提高牛群的妊娠率和繁殖效率。

同时，本领域技术人员可以根据妊娠差异蛋白和空怀差异蛋白开 发相应的试纸条和试剂盒。

试纸条用于判断奶牛是否妊娠，试纸用于检测妊娠差异蛋白和/ 或空怀差异蛋白，试纸上设置有ARHGAP42、EFEMP1、GTF2F1、 LOXL2、CPB2、LYST、RDH11、TRABD、TRIM67、TRMT112或/ 和IGL对应的免疫吸附剂、标记物和显色剂，由于免疫吸附剂、标记 物和显色剂均为本领域的常用试剂，申请人不在此赘述。

试剂盒用于检测妊娠差异蛋白和/或空怀差异蛋白，试剂盒包括A 和/或B、A抗体和/或B抗体、A抗体标记物和/或B抗体标记物。

妊娠奶牛和空怀奶牛血清样本中共同存在且表达趋势相反的蛋 白(以下简称第三差异蛋白)共78个。

其中，人工授精后14天，妊娠奶牛与空怀奶牛血清中有50个表 达趋势不一致的第三差异蛋白：ACSF3(acyl-CoA synthetase family  member 3，一直酰基辅酶A合成酶)、ADAM28(ADAM  metallopeptidase domain 28，一种金属蛋白酶)、ANKUB1(ankyrin  repeat and ubiquitin domain containing 1)、APOA2(apolipoproteinA-II， 载脂蛋白A2)、ARHGAP21(Rho GTPase activating protein 21， Rho-GTP酶激活蛋白21)、ASAH1(N-acylsphingosine amidohydrolase 1，酸性神经酰胺酶)、BTK(Bruton agammaglobulinemia tyrosine kinase， 特异性布鲁顿氏酪氨酸激酶)、CBR1(carbonyl reductase 1，羰基还 原酶)、CD44(CD44molecule)、CD59(CD59molecule，complement  regulatory protein，补体调节蛋白)、CFD(complement factor D，补体 因子D)、CFH(complement factor H，补体因子F)、CTSC(cathepsin  C，组织蛋白酶C)、DNAH1(dynein，axonemal，heavy chain 1，一 种轴丝动力蛋白)、DVL3(dishevelled segment polarity protein 3)、 EPB41L3(erythrocyte membrane protein band 4.1-like 3)、ESPL1(extra  spindle pole bodies homolog 1，外纺锤体极样蛋白1)、FAM71F1(family  with sequence similarity 71，member F1)、FGD6(FYVE，RhoGEF and  PH domain containing 6)、FZD1(frizzled class receptor 1，卷曲蛋白1)、 GC(group-specific component，维生素D结合蛋白)、HARS2 (histidyl-tRNA synthetase 2，mitochondrial，一种组氨酰-tRNA合成 酶)、HBA(keratin 90pseudogene，一种角蛋白)、HBB(hemoglobin， beta，血红蛋白)、HEXA(hexosaminidase A，β氨基己糖苷酶A)、 HP(haptoglobin，结合珠蛋白)、IGHG2(immunoglobulin heavy constant  gamma 2，G2m marker)、IGK(Immunoglobulin kappa，一种免疫球 蛋白)、KCTD1(potassium channel tetramerization domain containing 1， 钾离子通道蛋白四聚体1)、KRT17(keratin 17，type I，I型角蛋白 17)、KRT27(keratin 17，type I，I型角蛋白27)、KRT76(keratin 76， type II，II型角蛋白76)、LPXN(leupaxin，连接蛋白)、LRP8(low  density lipoprotein receptor-related protein 8，apolipoprotein e receptor， 低密度脂蛋白受体相关蛋白8)、MAP1B(microtubule-associated  protein 1B，微管相关蛋白1B)、MAP2K5(mitogen-activated protein  kinase kinase 5，双特异性丝裂原活化蛋白激酶5)、NR3C1(nuclear  receptor subfamily 3，group C，member 1，糖皮质激素受体)、OSMR (oncostatin M receptor，抑瘤素M受体)、PAN3(poly(A)specific  ribonuclease subunit)、PEPD(peptidase D，肽酶D)、PKD1(protein  kinasesD1，蛋白激酶D1)、PRKCSH(protein kinase C substrate 80K-H)、 PTPRZ1(proteintyrosine phosphatase，receptor-type，Z polypeptide 1， 一种蛋白酪氨酸磷酸酶)、SAA1(serum amyloidA1，血清淀粉样蛋 白A1)、SERPINH1(serpin peptidase inhibitor，clade H，member 1， 一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)、TTC39B(tetratricopeptide repeat domain 39B)、TTN(titin，肌联蛋白)、VWA3A(vonWillebrand factorA domain  containing 3A，血管性血友病因子A域蛋白3A)、VWF(von Willebrand  factor，血管性血友病因子)和ZNF777(zinc finger protein 777，锌指 蛋白777)。

人工授精后14天妊娠奶牛与空怀奶牛血清中完全呈反向表达的 第三差异蛋白(简称第一反向蛋白)有4个，分别是ACSF3、CFH、 HBB和SAA1。

基于上述分析可知：人工授精后14天时，由于ACSF3、CFH、 HBB和SAA1在妊娠奶牛和空怀奶牛血清中的表达差异较大，可以 用于检测奶牛血清中ACSF3、CFH、HBB和/或SAA1的含量，判断 奶牛是否妊娠。

人工授精后18天，妊娠奶牛与空怀奶牛血清中有54个表达趋势 不一致的第三差异蛋白：ACSF3、ADAM28、ALDOB(aldolase B， fructose-bisphosphate)、AOC3(amine oxidase，copper containing 3， 含铜胺氧化酶3)、APOA2、ARHGAP21、ASAH1、BCL2L14(BCL2-like 14，凋亡蛋白14)、C4A(complement component 4A，补体蛋白4A)、 C4BPA(complement component 4binding protein，alpha，补体蛋白4 结合α蛋白)、CBR1、CD59、CTSC、DNAH1、DVL3、ESPL1、FAM71F1、 FASTKD1、FGD6、FSIP2(fibrous sheath interacting protein 2，纤维 性鞘结合蛋白2)、FZD1、GC、HBA、HBB、HEXA、HP、IGHG2、 IGHV4-59(immunoglobulin heavy variable 4-59，免疫球蛋白重链可 变区4-59)、IGK、KCTD1、KRT10(keratin 10，type I，I型角蛋白 10)、KRT27、KRT76、LGMN(legumain，一种新型半胱氨酸蛋白酶)、 LPXN、LRP8、LRRC16A(leucine rich repeat containing 16A)、MAP1B、 MAP2K5、MB(myoglobin，肌红蛋白)、NFE2L2(nuclear factor， erythroid 2-like 2，红细胞衍生核因子2样蛋白2)、PAN3、PEPD、 PTPRZ1、SAA1、SAMD7(sterile alpha motifdomain containing 7)、 SERPINH1、SLC25A16(solute carrier family 25，member 16，线粒 体二羧酸载体蛋白16)、SOD1(superoxide dismutase 3，超氧化物歧 化酶3)、TRIM35(tripartite motifcontaining 35)、TTN、ZFC3H1(zinc  finger，C3H1-type containing)、ZNF518B(zinc finger protein 518B， 锌指蛋白518B)和ZNF777。

其中，人工授精后18天妊娠奶牛与空怀奶牛血清中完全呈反向 表达的差异蛋白(以下简称第二反向蛋白)为HBA、HBB和NFE2L2。

基于上述分析可知：人工授精后18天，由于HBA、HBB和/或 NFE2L2在妊娠奶牛和空怀奶牛血清中的表达差异较大，可以用于检 测奶牛血清中HBA、HBB和/或NFE2L2的含量，判断奶牛是否妊娠。

人工授精后21天，妊娠奶牛与空怀奶牛血清中有40个表达趋势 不一致的第三差异蛋白：ACSF3、ADAM28、ANKUB1、ARHGAP21、 BCL2L14、BTK、C4BPA、CFH、CNOT1(CCR4-NOT transcription  complex，subunit 1)、COL5A1(collagen，type V，alpha 1，一种胶 原蛋白)、CUBN(cubilin)、DVL3、FAM71F1、FZD1、HBB、HEBP1 (heme binding protein 1，血红素结合蛋白1)、HP、IGK、KCTD1、 KRT17、LPXN、LRRC16A、MAP1B、MAP2K5、PAN3、PKD1、PRKCSH、 PTPRZ1、RNASE11(ribonuclease，RNaseA family，11，核糖核酸酶 A11)、SAMD7、SERPINA3(serpin peptidase inhibitor，clade Amember 3，α-1抗胰糜蛋白酶)、SOD1、TF(transferrin，转铁蛋白)、TRIM35、 TTC39B、TTN、VWA3A、ZFC3H1、ZNF518B和ZNF777。

其中，人工授精后21天妊娠奶牛与空怀奶牛血清中完全呈反向 表达的差异蛋白(以下简称第三反向蛋白)为ACSF3、BCL2L14、 HBB、HP、IGK、RNASE11、TTN和ZFC3H1。

基于上述分析可知：人工授精后21天，由于ACSF3、BCL2L14、 HBB、HP、IGK、RNASE11、TTN和/或ZFC3H1在妊娠奶牛和空怀 奶牛血清中的表达差异较大，可以用于检测奶牛血清中ACSF3、 BCL2L14、HBB、HP、IGK、RNASE11、TTN和/或ZFC3H1的含量， 判断奶牛是否妊娠。

人工授精后28天，妊娠奶牛与空怀奶牛血清中有59个表达趋势 不一致的差异蛋白：ACSF3、ADAM28、ALDOB、ANKUB1、 ARHGAP21、BCL2L14、BTK、C4A、C4BPA、CBR1、CD44、CD59、 CFD、CNOT1、COMP(cartilage oligomeric matrix protein，软骨寡聚 基质蛋白)、CTSC、CUBN、DNAH1、DVL3、EGFR(epidermal growth  factor receptor，表皮生长因子受体)、EPB41L3、ESPL1、FGD6、FSIP2、 FZD1、GC、HBA、HBB、HEBP1、HP、IGHG2、IGHV4-59、IGK、 KCTD1、KRT10、KRT27、KRT76、LPXN、LRP8、LRRC16A、MAP1B、 MB(myoglobin，肌红蛋白)、PAN3、PEPD、PKD1、PRKCSH、PTPRZ1、 SAA1、SAMD7、SERPINA3、SLC25A16、SOD1、TF、TRIM35、 TTC39B、TTN、ZFC3H1、ZNF518B和ZNF777。

其中，人工授精后28天妊娠奶牛与空怀奶牛血清中完全呈反向 表达的差异蛋白(以下简称第四反向蛋白)为CBR1、CD59、HBB、 HP、IGHG2、KRT27、PAN3、PTPRZ1和ZNF777。

基于上述分析可知：人工授精后28天，由于CBR1、CD59、HBB、 HP、IGHG2、KRT27、PAN3、PTPRZ1和/或ZNF777在妊娠奶牛和 空怀奶牛血清中的表达差异较大，可以用于检测奶牛血清中CBR1、 CD59、HBB、HP、IGHG2、KRT27、PAN3、PTPRZ1和/或ZNF777 的含量，判断奶牛是否妊娠。

进一步的，人工授精后14天、18天、21天和28天的妊娠奶牛 和空怀奶牛血清中均呈反向表达的第三差异蛋白为HBB和HP(以下 简称反向差异蛋白)，且在受精时间大于或者等于14天的条件下： HBB在妊娠奶牛血清中的含量小于等于正常奶牛的0.73倍，HBB在 空怀奶牛血清中的含量大于等于正常奶牛的2.01倍；HP在妊娠奶牛 血清中的含量小于等于正常奶牛的0.67倍，HP在空怀奶牛血清中的 含量大于等于正常奶牛的3.53倍。

说明HBB和HP能够准确判断受精后的奶牛是否为妊娠奶牛。 同时，当妊娠时间为14至28天时，若已经判断妊娠的奶牛血清中的 HBB大于正常奶牛的0.82倍，或者HP含量大于正常奶牛的0.69倍， 说明该妊娠奶牛存在流产的风险，需要采取保胎措施，能够及时发现 妊娠奶牛的异常，降低妊娠奶牛胚胎丢失的风险。

下面，通过Western-blot方法验证血清中差异蛋白的表达规律， 来验证差异蛋白作为判断奶牛为妊娠、空怀的准确性。

选择通过上述方法鉴定出来的四种差异蛋白NFE2L2、EFEMP1、 CD44和KRT18，采用Western blot方法技术对四种差异蛋白进行 Western-blot验证，该方法包括以下步骤：

测定血清样本AB1，A1，A2，A3，A4，B1，B2，B3，B4中总 蛋白的浓度并记录，取等量总蛋白的血清进行PAGE胶电泳分离目的 条带，用蒸馏水冲洗。预制大小与PAGE凝胶相同的PVDF膜(聚偏 氟乙烯膜)和若干滤纸，将PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和若干滤纸一 同放置于电转缓冲液中浸泡2h后取出。

将凝胶、纤维垫、黑色板、白色板、浸泡后的PVDF膜和若干滤 纸，按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板的顺 序依次放好，夹紧黑色板和白色板后，参见表3所示，按照黑色板的 一面对照黑色负极的顺序放入转膜仪内，先在转膜电流为200mA的 条件下转膜100min或200min，再将NFE2L2、EFEMP1、CD44对应 的黑色板在转膜电流为300mA的条件下转膜20至40min至转膜完成， 得到印记PVDF膜。

将印记PVDF膜放入含有5％脱脂奶粉的TBST缓冲溶液中，在 室温下震荡2h进行封闭。按照表3中的稀释倍数制备一抗孵育液， 将封闭后的印记PVDF膜放入一抗孵育液中，在温度为4℃的条件下 孵育12h，得到第一孵育PVDF膜，使用TBST缓冲溶液冲洗第一孵 育PVDF膜，冲洗次数为5～6次，每次冲洗的时间均为5min。

按照TBST缓冲溶液和二抗体积比为1:50000的条件制备二抗孵 育液，将冲洗后的第一孵育PVDF膜放入二抗孵育液中，在室温下震 荡2h得到第二孵育PVDF膜，重复冲洗5次。

在每张冲洗后的PVDF膜上滴加ECL(ElectroChemiLuminescence， 化学发光底物)化学发光底物，孵育至PVDF膜有明显的荧光后，用 滤纸吸去膜上的ECL化学发光底物，用保鲜膜包裹PVDF膜后，进 行X光胶片压片，依次放入显影液显影、定影液定影。利用BandScan 软件，分析胶片的灰度值，得到所有样本中四种差异蛋白的表达结果。

表3 Western-blot检测参数

表4 Western blot检测NRF2、EFEMP1和CD44蛋白的表达水平(与0天 相比)

参见图1和表4所示可知，人工授精后一个情期内，妊娠牛血清 中的NFE2L2蛋白上调表达，空怀牛血清中的NFE2L2蛋白下调表达。 其中，人工授精后14天，妊娠牛的NRF2蛋白上调表达1.81倍，空 怀牛的NFE2L2蛋白下调表达1.09倍，妊娠牛与空怀牛中NFE2L2 蛋白表达的差异最大。其次，表达差异较大的为人工授精后18天， 妊娠牛的的NFE2L2蛋白上调表达1.56倍，空怀牛下调表达1.28倍。

参见图2和表4所示，人工授精后14天，妊娠牛与空怀牛血清 中的EFEMP1蛋白均下调表达；18天、21天和28天，妊娠牛血清 中的EFEMP1蛋白上调表达的倍数均在1.2以上，分别为1.58、1.99 和1.93；空怀牛血清中的EFEMP1蛋白下调表达倍数也均在1.2以上， 分别为2.72、4.20和18.40。

参见图3和表4所示，人工授精后14天至28天，妊娠牛血清中 的CD44蛋白一致上调表达，空怀牛中的CD44蛋白一致下调表达， 下调表达的倍数均在1.2以上，妊娠牛与空怀牛之间CD44蛋白的表 达差异随着人工授精天数的延长而增大。

参见图4和表4所示，奶牛人工授精后，与受精前的奶牛相比， 妊娠牛血清中的KRT18蛋白的表达水平呈上升趋势，空怀牛血清中 KRT18蛋白的表达水平无明显变化，人工授精后28天妊娠牛与空怀 牛血清中KRT18蛋白的表达差异最大。

Western blot检测的总体结果表明差异蛋白在妊娠牛或空怀牛血 清中的表达规律与iTRAQ试验一致。一方面说明了iTRAQ试验筛选 得到的差异蛋白的准确性，另一方面也为这些差异蛋白的应用提供了 理论依据。

本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细 描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。