牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法

技术领域

本发明属于骨加工技术领域，特别涉及一种牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方 法。

背景技术

牦牛(Bosgrunniens)是世界上十分宝贵的稀有畜种，主要分布在青藏高原、天山山脉、 阿尔泰山脉、萨彦岭至贝加尔湖的东南部，是“世界屋脊”著名的景观牛种，藏语叫雅克， 国外通称为yak。牦牛对高寒草地生态环境条件具有很强的适应性，能在空气稀薄、牧草 生长期短、气候寒冷的恶劣环境条件下生活自如，繁衍后代。它能利用一般家畜不能利用 的草场，是一种极少与人类争食、争夺生存空间和自然资源的原始家畜品种。全世界现有 牦牛l500多万头，在牛家族中仅占1％。其中，中国现有牦牛1400多万头，约占世界牦 牛总数的95％以上。

牦牛骨为无农药残留污染的有机钙源，含钙量25％～30％，钙磷比例合理，易于人体 消化吸收和利用，还含有多种氨基酸、磷蛋白、软骨素和骨胶原等营养成份和人体所需的 铁、锌等元素，既可直接服用也可作为补充钙源的添加剂使用，通过实验结果表明，牦牛 骨粉不仅可显著增加骨密度，而且与相应剂量的碳酸钙相比，具有较高的钙表观吸收率， 这可能与骨粉的溶解度，骨粉颗粒大小，骨粉中一些微量元素的比例恰当等有关。

近30年来，由于生物化学、分子生物学和细胞生物技术的发展，人们对细胞外基质， 特别是对其主要成分胶原的兴趣日益浓厚，在结构上现已发现27种不同类型的胶原。其 中，I型胶原对维持骨结构完整及骨生物力学特性非常重要。I型胶原分子是一个长300nm、 直径1.5nm、相对分子量300KDa的细棒状分子，由两条链构成，在胶原分子的两端各有 一段非螺旋结构，分别称之为N端肽和C端肽。胶原分子的肽端在胶原分子之间的交联、 胶原纤维的组装及胶原分子的稳定性方面起着重要作用。Morimichi等经过实验发现，I 型胶原的代谢状况与骨骼代谢密切关联，胶原过度降解或合成减少均可引起骨的弹性和韧 性的降低，骨中的无机物失去依附，溶解增多而导致骨质疏松。

因为骨胶原是羟基磷酸钙分子的粘合剂，因此胶原合成缓慢，难以得到补充，旧胶原 不断地分解降解，导致了骨钙不能按照一定方式固定下来而进入了血液，进而排除了体外。 而从钙的吸收机理来讲，之前所讲的三代补钙剂对比，氨基酸符合钙剂吸收效率最高。胶 原多肽和Ca²⁺有一定的结合能力，且结合反应比较复杂，其中既有Ca²⁺和胶原多肽羧基 与氨基的配位结合，又有Ca²⁺和胶原多肽羧基的离子键结合，还有胶原多肽对Ca²⁺的吸 附作用。而在动物体内存在着独立的小肽运转系统，具有吸收快、能耗低、不易饱和的特 点，是摄入氨基酸的主要途径，当金属离子和一个小肽螯合以后就能抑制刷状缘上肽酶的 水解活性，防止肽水解。完整肽作为矿物质配体通过肽的转运机制进入细胞粘膜，一方面 提高了肽的利用效率，又给细胞提供了必须的矿物质元素。

在国外，关于多肽鳌合物的研究很早就开始了。最早的是美国Albion实验室将铁元 素、动植物蛋白合成蛋白铁复合物，此后关于多肽螯合物的研究逐渐增多。Won-KyoJung 等研究了胃蛋白酶酶解鱼骨架制备胶原多肽螯合钙。X-L.BAO等也研究了大豆多肽螯合 钙的机理。随着多肽螯合钙成功应用在小白鼠实验中，多肽螯合钙的优良特性被人们广泛 认同，其发展前景无可限量。KazuhiroAoki等人也通过实验证明了多肽螯合产物对于骨质 生长的促进作用能明显。

由此，加大加深对牦牛骨的深入研究和探讨不光能够将我国传统的藏医学理论发扬光 大，而且对骨资源的高值化加工，尤其是牦牛骨的深入利用有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法，包括如下步骤：

步骤一、从牦牛骨中提取出分子量2KDa～4KDa的胶原多肽和其他胶原多肽；

步骤二、将步骤一中得到的分子量2KDa～4KDa的胶原多肽与Ca²⁺进行螯合以得到牦 牛骨胶原多肽螯合钙，螯合中，温度为50～55℃，pH值为6.8～7.2，螯合时间为1.5～2小 时；和

步骤三、将步骤一中得到的其他胶原多肽浓缩得到骨多肽。

优选的是，所述的牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法中，在所述步骤二之后， 还包括：

步骤四、按照体积比1:8～9将螯合完毕后的溶液与无水乙醇混匀进行沉淀得到沉淀物， 沉淀时间为2～3h，沉淀温度为25～35℃；

步骤五、首先对步骤四中得到的沉淀物进行抽滤并同时过200目筛，之后再利用真空 冷冻干燥方法得到牦牛骨多肽螯合钙，真空冷冻干燥方法中的筛下物平铺厚度为2～3cm， 冻干温度为-55～-50℃，真空度为20～40Pa，持续时间18～24小时。

优选的是，所述的牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法中，所述步骤一中，从 牦牛骨中提取出分子量2KDa～4KDa的胶原多肽和其他胶原多肽的具体方法包括：

1)将牦牛骨放入索式抽提罐中进行热压索式抽提得到牦牛骨汤液；

2)首先利用截留分子量为4KDa的超滤膜过滤步骤1)中得到的牦牛骨汤液得到截留 液和一次滤出液，之后利用截留分子量为4KDa的超滤膜将所述一次滤出液过滤得到所述 分子量2KDa～4KDa的胶原多肽和二次滤出液，最后将所述截留液和所述二次滤出液混合 得到所述其他胶原多肽。

优选的是，所述的牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法中，所述步骤1)中， 所述热压索式抽提的抽提温度为130～135℃，抽提时间为60～100min。

优选的是，所述的牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法中，在所述步骤1)之 后和所述步骤2)之前还包括如下步骤：

脱脂过滤：将步骤1)中得到的汤液经100目以下的过滤筛过滤取，而后静置并除去 上层骨油。

优选的是，所述的牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法中，还包括如下步骤： 将所述上层骨油制成风味油脂。

优选的是，所述的牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法中，所述脱脂过滤步骤 中，所述过滤筛为200目。

优选的是，所述的牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法中，所述步骤二中，按 照多肽溶液中干物质质量与Ca²⁺的质量比4～6：1向所述分子量2KDa～4KDa的胶原多肽 中加入含有所述Ca²⁺的溶液。

优选的是，所述的牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法中，所述步骤三中，将 所述其他胶原多肽在-0.08～-0.07MPa真空度下进行所述浓缩得到所述骨多肽。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明采用索式热压抽提、分子截留、动态螯合、真空冻干等技术，在不添加任何无 机酸、碱以及酶的状况下，获得易被吸收的新型高效的生物补钙产品，而且在补钙的同时 也同时提供了易于吸收和协同促钙吸收的多肽，倍增了补钙效果。经过超滤截留后的多肽 溶液混合后浓缩成为另外一种营养丰富的多肽产品，实现了全利用。本发明工艺操作简便， 设备简单造价低，非常适合规模化生产。也为青藏高原地区牦牛骨资源的高值化加工提供 了强势的技术支持。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明 的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图；

图2为本发明不同胶原多肽片段螯合率曲线图；

图3为本发明胶原多肽与钙的质量比曲线图；

图4为本发明pH值对胶原多肽钙螯合率的影响曲线；

图5为本发明温度对胶原多肽钙螯合率的影响曲线；

图6为本发明时间对胶原多肽钙螯合率的影响曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能 够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法，包括如下步骤：

步骤一、从经过粉碎、清洗后的牦牛骨中提取出分子量2KDa～4KDa的胶原多肽和其 他胶原多肽；

步骤二、将步骤一中得到的分子量2KDa～4KDa的胶原多肽与Ca²⁺进行螯合以得到牦 牛骨胶原多肽螯合钙，螯合中，温度为50～55℃，pH值为6.8～7.2，螯合时间为1.5～2小 时；该分子量2KDa～4KDa胶原多肽的浓度为40～50g/L，Ca²⁺可采用CaCl₂溶液。

步骤三、将步骤一中得到的其他胶原多肽浓缩得到骨多肽。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，在所述步骤二之后，还包括：

步骤四、按照体积比1:8～9将螯合完毕后的溶液与无水乙醇混匀进行沉淀得到沉淀物， 沉淀时间为2～3h，沉淀温度为25～35℃；

步骤五、首先对步骤四中得到的沉淀物进行抽滤并同时过200目筛，之后再利用真空 冷冻干燥方法得到牦牛骨多肽螯合钙，真空冷冻干燥方法中的筛下物平铺厚度为2～3cm， 冻干温度为-55～-50℃，真空度为20～40Pa，持续时间18～24小时。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，从牦牛骨中提取出分子量 2KDa～4KDa的胶原多肽和其他胶原多肽的具体方法包括：

1)将牦牛骨放入索式抽提罐中进行热压索式抽提得到牦牛骨汤液；

2)首先利用截留分子量为4KDa的超滤膜过滤步骤1)中得到的牦牛骨汤液，以得到 截留液和一次滤出液，之后利用截留分子量为4KDa的超滤膜将所述一次滤出液过滤得到 所述分子量2KDa～4KDa的胶原多肽和二次滤出液，最后将所述截留液和所述二次滤出液 混合得到所述其他胶原多肽。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤1)中，所述热压索式抽提的抽 提温度为130～135℃，抽提时间为60～100min。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，在所述步骤1)之后和所述步骤2)之前 还包括如下步骤：

脱脂过滤：将步骤1)中得到的牦牛骨汤液经100目以下的过滤筛过滤，而后静置并 除去上层骨油。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，还包括如下步骤：将所述上层骨油制成风 味油脂。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述脱脂过滤步骤中，所述过滤筛的目数 为200目。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，按照多肽溶液中干物质质 量与Ca²⁺的质量比4～6：1向所述分子量2KDa～4KDa的胶原多肽中加入含有所述Ca²⁺的 溶液。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤三中，将所述其他胶原多肽在 -0.08～-0.07MPa真空度下进行所述浓缩得到所述骨多肽。

本发明提供的一种牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法，包括：热压索式抽提、 脱脂过滤、分子截留、金属离子螯合、无水乙醇沉淀后真空干燥，实现了高纯度牦牛骨胶 原多肽螯合钙产品的生产；加工中截留和滤出的其余分子量段的多肽通过浓缩后可作为其 他特定食品的优质基料；使用提取出的上层油脂可以作为调制风味油脂使用

一种牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法的实施及效果验证

一、一种热压抽提I型胶原蛋白的方法的实施

1、选取牦牛骨原料50公斤，首先粉碎至3～5cm左右，用清水将其杂质冲洗干净后， 投入索式抽提罐内，按1:1.5～2的料液比向提取罐中加水，设定抽提温度设定为130℃， 抽提时间100min，期间小规模泄压/补压；

2、抽提结束后将抽提液经200目过滤筛过滤后移入静置沉淀罐内降温，期间除去上 层浮油和下层底部残渣，上层浮油可以作为风味调制油脂使用；

3、提取所的多肽溶液首先进入到一次超滤暂存罐内，使用孔径为4KDa的超滤膜对 多肽溶液进行过滤操作，所得的截留液储存在一次截留液储存罐内待用，滤出液暂存在一 次滤出液罐内；

4、将一次滤出液罐内的多肽溶液进入到孔径为2KDa的超滤膜对多肽溶液进行过滤 操作，所得的截留液储存在二次截留液储存罐内待用，滤出液暂存在二次滤出液罐内；

5、对二次截留液进行计量和浓度测定，按照多肽溶液中干物质质量与Ca²⁺质量4:1 加入Ca²⁺溶液，控制螯合温度在50℃，pH值为6.8，这样的条件下进行1.5小时螯合；

6、计量螯合后的溶液的体积，按照1:8无水乙醇沉淀罐内进行2h静置沉淀，温度控 制在35℃；

7、将沉淀物通过下排口排入到配备200目的过滤网抽滤缸内，将抽滤所得固体平铺 至冻干盘内，保持厚度2cm，冻干温度-50℃之间，真空度为20Pa，维持时间24小时；

8、将冻干粉末使用内层用洁净塑料袋，每袋按1Kg/袋进行包装；袋口用一次性尼龙 扎带系紧，密闭入库，在干燥处保存；

9、将两次超滤所截留大于4KDa和小于2KDa的多肽溶液在-0.08～-0.07MPa真空度下 进行真空浓缩得到多肽浓缩液产品；

10、静置时取得的上层浮油经过精加工可以作为调制风味油脂使用。

二、一种热压抽提I型胶原蛋白的方法的实施

1、选取牦牛骨原料30公斤，首先粉碎至3～5cm左右，用清水将其杂质冲洗干净后， 投入索式抽提罐内，按1:1.5～2的料液比向提取罐中加水，设定抽提温度设定为135℃， 抽提时间60min，期间小规模泄压/补压；

2、抽提结束后将抽提液经200目过滤筛过滤后移入静置沉淀罐内降温，期间除去上 层浮油和下层底部残渣，上层浮油可以作为风味调制油脂使用；

3、提取所的多肽溶液首先进入到一次超滤暂存罐内，使用孔径为4KDa的超滤膜对 多肽溶液进行过滤操作，所得的截留液储存在一次截留液储存罐内待用，滤出液暂存在一 次滤出液罐内；

4、将一次滤出液罐内的多肽溶液进入到孔径为2KDa的超滤膜对多肽溶液进行过滤 操作，所得的截留液储存在二次截留液储存罐内待用，滤出液暂存在二次滤出液罐内；

5、对二次截留液进行计量和浓度测定，按照多肽溶液中干物质质量与Ca²⁺质量6:1 加入Ca²⁺溶液，控制螯合温度在55℃，pH值为7.2，这样的条件下进行2小时螯合；

6、计量螯合后的溶液的体积，按照1:9无水乙醇沉淀罐内进行3h静置沉淀，温度控 制在25℃；

7、将沉淀物通过下排口排入到配备200目的过滤网抽滤缸内，将抽滤所得固体平铺 至冻干盘内，保持厚度3cm，冻干温度-55℃之间，真空度为40Pa，维持时间18小时；

8、将冻干粉末使用内层用洁净塑料袋，每袋按1Kg/袋进行包装；袋口用一次性尼龙 扎带系紧，密闭入库，在干燥处保存；

9、将两次超滤所截留大于4KDa和小于2KDa的多肽溶液在-0.08～-0.07MPa真空度下 进行真空浓缩得到多肽浓缩液产品；

10、静置时取得的上层浮油经过精加工可以作为调制风味油脂使用。

三、检测试验验证：

1、原料优选的理由

表1不同地域牛不同部位与牦牛骨蛋白含量对比

由表1可以看出牦牛不同部位骨中蛋白含量均高于全国其他牛种，说明其具备很高的 开发价值，而且通过提取之后能够为后期的螯合提供更加丰富多肽。

2、抽提液分子量分布的变化

由表2可知随着抽提时间的增加，4000～5000分子量范围的大分子物质逐渐减少， <4000的物质相对含量增加，其中2000～4000分子量范围的物质相对面积增加了约700％， 说明大分子物质在热压抽提的作用下充分水解形成小分子物质，更容易被人体吸收。

表2分子量分布变化(％)

由上述验证结果可知，本发明选择2KDa～4KDa分子量大小含量最高，产品纯度较高， 易被人体充分吸收。

3、如图2所示，检测超滤的不同大小的胶原多肽片段与钙离子的螯合率。其中：

钙的螯合率(％)＝CV₁/CV₀×100％

V0：滴定反应体系中钙的总量消耗的EDTA溶液体积(ml)

V1：滴定螯合钙所消耗的EDTA溶液体积(ml)

游离态钙含量的测定按照GB6226-86EDTA络合滴定法标准执行。

螯合产物物得率(％)＝W₁/W₀×100％

W₀：反应物的总质量(g)

W₁：螯合产物总质量(g)

由图2验证结果可知，本发明选择的2KDa～4KDa分子量大小与钙螯合率和螯合物得 率较高。

4、检测胶原多肽中干物质质量与钙离子的质量比

将经过无水乙醇第一次沉淀的鳌合钙产物再用10mL蒸馏水溶解后，然后再用无水乙 醇沉淀测定钙离子含量的变化。

稳定度(％)＝(W₂/W₁)×100％

W₂:第二次沉淀后的鳌合态钙的含量(g)

W₁:第一次沉淀后鳌合态钙含量(g)

结果如图3所示，由图3验证结果可知，本发明选择胶原多肽中干物质质量与钙离子 的质量比在4～6时出现平稳，所以选择胶原多肽中干物质质量与钙离子的质量比4:1为最 佳。

5、检测pH值对螯合的影响

检测方法同图2。检测结果如图4所示。

由图4验证结果可知，本发明选择螯合时的pH值在6.8～7.2时出现峰值，所以选择 PH值为7时为最佳。

6、检测pH值对螯合的影响

检测方法同图2。检测结果如图5所示。

由图5上述验证结果可知，本发明选择螯合时的温度在50～55℃时出现峰值，所以选 择温度为55℃时为最佳。

7、检测pH值对螯合的影响

检测方法同图2。检测结果如图6所示。

由图6验证结果可知，本发明选择螯合的时间在1.5小时时出现高点，后期随时间的 变化螯合率并未发生较大变化，所以选择螯合时间为1.5小时时为最佳。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的钙和胶原多 肽螯合条件等的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

如上所述，根据本发明，通过以上步骤实现从牦牛骨中通过物理方法生产出纯度较高 特定分子量多肽螯合钙产品，而且截留后的多肽溶液浓缩后可以得到营养丰富的多肽产 品，静置时取得的上层浮油经过精加工可以作为调制风味油脂使用。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运 用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。