一株牛樟芝菌株及牛樟芝液态发酵方法

技术领域

本发明涉及生物工程，特别涉及一株牛樟芝菌株及牛樟芝液态发酵方法。

技术背景

高等药用真菌牛樟芝(Antrodiacamphorata),又名牛樟菇，属于担子菌纲、多年生担子菌，只生长在台湾地区的牛樟树腐朽树干的内壁。在民间，牛樟芝长久以来被用作解酒保肝的传统药方，用于治疗肝脏疾病、食物和药物所引起的中毒症状，以及腹泻、腹痛、高血压、皮肤发痒和肿瘤疾病等，又被称为灵芝之王、森林中的红宝石。近年来，许多学者研究显示牛樟芝具有抗肿瘤、保肝、抗炎症、抗氧化、抗疲劳等多种活性功能，尤其在抗肿瘤和缓解酒精性肝损伤方面。由于牛樟芝的功效卓越，市场上对其子实体的需求也越来越高，然而其野生子实体生长非常缓慢，并且唯一寄主牛樟树十分稀缺，使得野生牛樟芝子实体价格一路飙升，高达15000-20000美元/公斤，远高于灵芝、人参、冬虫夏草等传统药材，极具开发前景。

牛樟芝菌丝体中药理活性开发最深入的是安卓奎诺尔及其衍生物，属于泛醌类化合物，包括Antroquinonol、AntroquinonolB和4-acetyl-AntroquinonolB等，只在固态发酵菌丝体中可以合成，而在液态发酵菌体中不能合成。牛樟芝安卓奎诺尔类化合物具有良好的抗癌活性。Lee等人利用正己烷从牛樟芝固态发酵培养物中分离出Antroquinonol，结果表明Antroquinonol对MCF-7和MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、Hep3B和HepG2(人肝癌细胞)、DU-145和LNCaP(人前列腺癌细胞)等多种癌细胞具有良好的杀灭效果，同时具有抑制HBsAg和HBeAg合成的潜力，从而抑制HBV的复制。Kumar等人研究显示Antroquinonol对A549(腺癌细胞系)具有强烈的抑制作用，使用12h后其EC50＝25μM；同时，Antroquinonol可以通过改变PI3K/mTOR蛋白活性和mRNA的表达，显著的抑制三种NSCLS癌细胞的增殖。

目前，牛樟芝的人工培养方式主要有三种：牛樟树椴木栽培或是太空包法获得子实体、利用谷物固态发酵法获得菌丝体培养物以及深层液态发酵法获得菌丝体培养物。虽然菌丝体中很少含有子实体标志的麦角甾烷类三萜化合物，但是其自身含有的特征活性成分(如Antrodins、安卓奎诺尔等)赋予了菌丝体非常良好的保肝和抗癌等活性功能，同时还产生了一些新的活性，包括神经保护、调节免疫、降血脂等，这使得菌丝体培养物在牛樟芝资源开发中占有较为有利的地位。与固态发酵相比，深层液态发酵法是快速获得大量菌丝体产品最有效的途径，可以快速的形成较大生产规模。但是牛樟芝深层液态发酵的缺点也非常明显，其中最大的就是活性产物的种类及产量较低--与固态发酵相比，正常发酵状态下活性产物种类较为少，几乎不产安卓奎诺尔类化合物，这就使得牛樟芝液态发酵菌丝体产品的功效较弱，市场竞争力不强。

公开号为CN1456661A(发明名称：樟芝大规模液体深层发酵生产工艺)、CN101803528A(一种樟芝菌丝体的新颖培养方法)等专利文献公开了一系列的通过发酵法生产樟芝的细胞培养方法，但上述文献中所公开的细胞培养产物均为樟芝菌丝体或是多糖，并没有关于樟芝菌丝体特征活性产物安卓奎诺尔类化合物的生产方法报道。

由于富含生理活性物质的樟芝产品的需求与日俱增，急需一种有效的牛樟芝液态发酵方法，有针对性地提高牛樟芝菌体特征活性产物安卓奎诺尔类化合物的含量，以提高牛樟芝液态发酵菌丝体产品的功效，满足市场的不断更新发展。

发明内容

本发明的目的，就是针对现有技术中存在的问题，提供一株牛樟芝菌株及牛樟芝液态发酵方法，可以提高牛樟芝菌丝体中安卓奎诺尔类化合物的产量。

本发明中的牛樟芝菌株S-29，己于2014年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为樟芝，拉丁文分类命名为Antrodiacamphorata，保藏编号为CGMCCNo9590。上述牛樟芝菌株S-29的序列如SEQIDNO.1所示。

基于上述牛樟芝菌株的牛樟芝液态发酵方法，包括以下步骤：

A、以牛樟芝菌株S-29为原料，先在麦芽汁斜面培养基上培养为樟芝斜面菌种；

B、将樟芝斜面菌种接入液态种子培养基中培养为液态种子；

C、将液态种子接种于液态发酵培养基中进行培养，在培养过程中添加过氧化氢，利用过氧化氢氧化胁迫诱导菌丝体合成安卓奎诺尔类化合物。

步骤A的培养时间为10-12天，培养温度为28℃。

步骤B的培养时间为2天，培养温度为30℃。

步骤C的培养时间为5-20天，培养温度为28℃，过氧化氢在培养至少一天后添加，添加过氧化氢后再至少培养四天，过氧化氢添加量为5-100mmol/L。

步骤C中液态种子的接种量为5％-50％(v/v)。

所述液态发酵培养基包括碳源、氮源以及一种以上的无机盐；所述碳源为可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、糯米粉或其组合；所述氮源为NH₄Cl、胰蛋白胨、黄豆粉、玉米浆粉、麦芽抽提物、酵母抽提物或其组合；所述无机盐为磷酸盐、硫酸镁、柠檬酸盐、氯化钠或其组合；碳源的添加量为20-100g/L；氮源的添加量为2-15g/L；无机盐的添加量为0.1-1.0g/L；液态发酵培养基配制完成后于121℃灭菌10-40min，然后冷却至15-35℃待用。

本发明的方法能诱导牛樟芝液态发酵菌丝体产生安卓奎诺尔类化合物。在发酵过程中添加过氧化氢进行氧化胁迫，促进液态发酵菌体产生具有良好抗癌功效的活性产物，其中安卓奎诺尔含量为7-15mg/g菌体，安卓奎诺尔B含量为20-50mg/g菌体。本发明的发酵方法技术工艺简单、高效，有着重要的工业应用价值，同时对促进牛樟芝其他活性代谢产物的生产具有一定的启迪意义。

安卓奎诺尔、安卓奎诺尔B等化合物采用高效液相色谱法(HPLC)进行分析。取烘干粉碎的牛樟芝液态发酵菌粉末0.5g，加入60ml乙醇，50℃，振荡萃取1.5h，静置后取上清经过0.22μm滤膜微滤，进行HPLC分析。分析条件如下：色谱柱：SepaxAmethystC18(4.6mm×250mm)；流速：1mL/min；检测波长：254nm；流动相A：水/乙酸＝100/0.5，流动相B：乙腈；洗脱梯度如下：0-10min，流动相B35％-50％；10-35min，流动相B50％-60％；35-50min，流动相B60％-80％；50-60min，流动相B80％-100％。

具体实施方法

实施例1

斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基。

液态种子培养基(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨4，玉米浆粉2。

液态发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨2，玉米浆粉2，K₂HPO₄0.1，MgSO₄0.1。所用培养基均在115℃灭菌20min。

牛樟芝菌种先在麦芽汁斜面28℃培养12天，然后接入液态种子培养基中培养。液态种子30℃培养2天之后接入液态发酵培养基。

液态发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速100r/min，pH5.0，培养1天后加入过氧化氢5mmol/L，然后继续培养至5天。用此方法胁迫牛樟芝生产特征活性产物，安卓奎诺尔含量为2mg/g菌体，安卓奎诺尔B含量为5mg/g菌体。

实施例2：

斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基。

液态种子培养基(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨4，玉米浆粉2。

液态发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，胰蛋白胨5，玉米浆粉2，K₂HPO₄0.3，MgSO₄0.3。所用培养基均在115℃灭菌20min。

牛樟芝菌种先在麦芽汁斜面28℃培养12天，然后接入液态种子培养基中培养。液态种子30℃培养2天之后接入液态发酵培养基。

液态发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速100r/min，pH5.0，培养3天后加入过氧化氢20mmol/L，然后继续培养至10天。用此方法胁迫牛樟芝生产特征活性产物，安卓奎诺尔含量为10mg/g菌体，安卓奎诺尔B含量为37mg/g菌体。

实施例3：

斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基。

液态种子培养基(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨4，玉米浆粉2。

液态发酵培养基(g/L)：蔗糖40，黄豆粉5，玉米浆粉2，K₂HPO₄0.3，MgSO₄0.3。所用培养基均在115℃灭菌20min。

牛樟芝菌种先在麦芽汁斜面28℃培养12天，然后接入液态种子培养基中培养。液态种子30℃培养2天之后接入液态发酵培养基。

液态发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速100r/min，pH5.0，培养6天后加入过氧化氢35mmol/L，然后继续培养至15天。用此方法胁迫牛樟芝生产特征活性产物，安卓奎诺尔含量为13mg/g菌体，安卓奎诺尔B含量为44mg/g菌体。

实施例4：

斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基。

液态种子培养基(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨4，玉米浆粉2。

液态发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，胰蛋白胨15，玉米浆粉2，K₂HPO₄1.0，MgSO₄1.0。所用培养基均在115℃灭菌20min。

牛樟芝菌种先在麦芽汁斜面28℃培养12天，然后接入液态种子培养基中培养。液态种子30℃培养2天之后接入液态发酵培养基。

液态发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速100r/min，pH5.0，培养10天后加入过氧化氢100mmol/L，然后继续培养至20天。用此方法胁迫牛樟芝生产特征活性产物，安卓奎诺尔含量为7mg/g菌体，安卓奎诺尔B含量为23mg/g菌体。