用于检测微量组织中BRAF基因突变的引物组合及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于微量组织中BRAF基因突变检测的引物组合及其在肿瘤用药选择和疾病诊断相关方面的应用。

背景技术

BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人类尤因肉瘤中发现并克隆确认的一种能转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列。BRAF基因与ARAF、CRAF基因同属RAF家族，命名为鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，位于人染色体7q34，长约190kb，编码783个氨基酸的蛋白，相对分子质量为84436，有CR1、CR2和CR3三个保守区。BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路重要的转导因子，其功能的编码区由2510对碱基组成，主要通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶来发挥作用，该酶将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡（Wanchoo>

BRAF突变主要有两种类型：1.11%位于exon11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468的点突变；2.89％的突变发生在exon15上的激活区，其中约92％位于第1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)（Gençler>BRAF突变与RAS突变，且在这1％中，BRAF突变几乎均为非V600E突变。以上两种类型的突变均能使BRAF激酶活性及NIH3T3细胞转化能力提高，但以后者更为重要。V600E突变能模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活。

2011年FDA批准维罗非尼用于治疗晚期（转移性）或不可切除的黑色素瘤，尤其是携有BRAFV600E基因变异肿瘤者。该药的安全性和疗效评估基于一项国际单中心研究。该研究纳入675例BRAFV600E变异的初治晚期黑色素瘤患者，入选者被随机分入维罗非尼组或达卡巴嗪组。结果显示，在维罗非尼组患者未达到中位生存期终点时（77%的患者生存），达卡巴嗪组患者中位生存期为8个月（64%的患者生存）。BRAF是位于KRAS下游级联信号通路上的一个重要蛋白，当BRAF基因发生突变后，其编码生成的蛋白产物无需接受上游信号蛋白的活化便始终处于激活状态，启动下游细胞信号转导途径，引起细胞增殖，从而使EGFR抑制剂西妥昔单克隆抗体和帕尼单克隆抗体等疗效减弱或无效。因此，肿瘤病人在用药之前进行BRAF基因的突变检测，将有利于这些患者选择最好的治疗方式。

目前针对BRAF突变的检测方法有很多，如直接测序法，该法对样本要求较高，检测范围有限。多态性分析法（RFLP），是将PCR与限制性酶切相结合的一种方法，此实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。Taqman水解探针法，使用扩增阻滞突变系统（ARMS）与荧光探针结合来检测突变，针对该方法设计的引物，使得突变型得到扩增，野生型无法扩增，从而增强了突变信号，便于检测。但是ARMS技术应用最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DNA的扩增，存在假阳性的风险，且只能针对特异性位点检测。此外，如高效液相色谱、毛细血管电泳等，需要特殊的仪器设备，且操作复杂，不利于在临床上进行大范围的推广。核酸序列扩增法（NASBA）、自序序列复制法（3SR）和链置换复制法（SDA）虽均为等温扩增法，但是它们对目的序列的扩增特异性不强。

尽管如此，BRAF突变的检测方法仍以肿瘤组织标本检测为金标准，但是临床上常常由于组织样本获取不足量，使其检测具有一定的局限性。因此临床上亟需一种高效准确全面地检测微量组织中BRAF基因突变的产品及方法，以便于为肿瘤个性化治疗服务。

为此，本发明利用恒温扩增与直接测序相结合的方法，建立了一套针对微量组织样本中BRAF基因所有突变类型检测的技术流程，该检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，有利于临床使用和推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高特异性和灵敏度的检测微量组织样本中BRAF基因突变的引物组合，以组织DNA为检测对象，结合恒温预扩增技术和普通PCR技术，通过直接测序法确定肿瘤样本中有无BRAF基因突变，可对BRAF基因的突变进行准确的检测。

本发明提供的引物组合能检测出BRAF基因发生在第11和15号外显子的所有突变。

本发明提供的用于检测BRAF基因突变的引物组合包括如SEQ>

本发明的另一目的是将上述引物组合应用在制备检测BRAF基因突变的检测试剂中。

本发明的另一目的是将上述引物组合应用于制备用于检测BRAF基因突变的检测试剂盒中，所述试剂盒组分还包含下列常规组分中的一种或几种：聚合酶、引物组合、PCR反应缓冲液、dNTP、BSA、去离子水。

本发明用于检测BRAF基因突变的引物组合的检测使用方法，具体步骤如下：

（1）引物稀释

将primer1-prime18分别稀释后混匀制得Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.05-0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为1-3μM；primer19-primer22引物（表1）稀释至5-10μM。

（2）预扩增

在扩增管中加入1μL的10×反应缓冲液、2.5μL的Primer Mix、100-1000pg微量DNA模板（本发明采用的DNA模板来源于结肠癌病人组织，并按照《分子克隆实验指南》中所述常规方法提取组织DNA）、用去离子水补足至8.8μL；混匀，98℃预变性5-10min，然后置于冰上10-20min；再加入0.5μL dNTP (10mM each)、0.2μL 100×BSA以及0.5μL phi29 DNA聚合酶，30-35℃扩增过夜，65℃加热10-20min使酶失活。

（3）使用PCR纯化试剂盒纯化上述预扩增产物。

（4）BRAF基因突变检测

针对BRAF基因的11、15号外显子突变，分别采用如SEQ>

配置PCR反应总体系为25μL：其中Pfu Mix混合液12.5μL、所述正向引物(5-10μM)的体积0.5-1μL、反向引物(5-10μM)的体积0.5-1μL、预扩增产物1-2μL、用水补足至25μL。PCR反应条件为：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；测序检测。

本发明的检测优势在于：①本发明采用多引物组合、利用恒温扩增及普通PCR相结合的方法，解决了组织样本中初始DNA含量低的，无法进行BRAF基因突变检测的局限性；②本发明中使用的试剂价格低廉，可大批量的处理样本；③本发明方法扩增效率高，如100pg的DNA经扩增后可得到1000ng/μL；可同时检测多位点的突变情况；④本发明方法DNA扩增后DNA忠实性好。总之，使用本发明方法可实现对微量组织样本中的BRAF基因的突变情况进行高效、准确的检测，其对于临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，以及监测肿瘤的预后具有很好的实际应用价值。

表1：引物1-22的核苷酸序列

。

附图说明

图1是本发明针对1000pg的DNA模板扩增结果；其中A图为预扩增结果（3次重复）；B图为BRAF基因11、15号外显子扩增结果；

图2是本发明针对500pg的DNA模板扩增结果；其中A图为预扩增结果（3次重复）；B图为BRAF基因11、15号外显子扩增结果；

图3是本发明针对100pg的DNA模板扩增结果。A图为预扩增结果（3次重复）；B图为BRAF基因11、15号外显子扩增结果；

图4是本发明针对1000pg的DNA模板中BRAF基因11、15号外显子测序结果图；

图5是本发明针对500pg的DNA模板中BRAF基因11、15号外显子测序结果图；

图6是本发明针对100pg的DNA模板中BRAF基因11、15号外显子测序结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特异表明，所用试剂均为分析纯，所有试剂均可从商业渠道获得，百分比均为质量百分比。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。除非另行定义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

实施例1：1000pg的DNA模板中BRAF基因突变检测

1、实验材料

phi29 DNA聚合酶，10×reaction buffer，dNTP (10nM) ，100×BSA，1000pg的 DNA模板，去离子水，primer1-prime18 (即Primer Mix)，2×Pfu Mix，primer19-primer22，PCR仪，超薄产物纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司DP203），1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。

2、实验步骤及结果

2.1 预扩增

（1）引物稀释

将primer1-prime18分别稀释后混匀形成Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为2μM。配置如下体系：

；

（2）将上述试剂混匀后，98℃预变性10min，然后迅速置于冰上20min；

（3）再加入如下体系：

；

将上述混合物混匀后，30-35℃扩增过夜，65℃加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测（图1A）。结果显示使用phi29DNA聚合酶对1000pg的DNA模板扩增效果良好。

2.2 PCR产物纯化

（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500μL的平衡液BL，12,000 rpm (～13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

（2）估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）；

（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中；

（4）向吸附柱CB1中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm (～13,400×g)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中；

（5）重复操作步骤（4）；

（6）12,000 rpm(～13,400×g)离心2 min，尽量除去漂洗液,将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；

（7）取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm(～13,400×g)离心2 min，收集DNA溶液。

2.3 BRAF基因突变检测

（1）配置如下PCR反应体系，分别扩增BRAF基因的第11号和15号外显子；

；

其中针对11号外显子突变的引物如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示；针对15号外显子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。

（2）反应条件：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；

（3）PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图1B），结果显示第二轮PCR对BRAF基因的第11和15号外显子均出现特异性扩增；然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序检测，测序结果如图4所示，BRAF基因第11号外显子发生错义突变c.1391G>T>

实施例2：500pg的DNA模板中BRAF基因突变检测

1、实验材料

phi29 DNA聚合酶，10×reaction buffer，dNTP (10nM) ，100×BSA，1000pg的 DNA模板，去离子水，primer1-prime18 (即Primer Mix)，2×Pfu Mix，primer19-primer22，PCR仪，超薄产物纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司DP203），1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。

2、实验步骤

2.1 预扩增

（1）引物稀释。将primer1-prime18分别稀释后混匀形成Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为2μM。配置如下体系：

；

（2）将上述试剂混匀后，98℃预变性10min，然后迅速置于冰上20min。

（3）再加入如下体系：

；

将上述混合物混匀后，30-35℃扩增过夜，65℃加热15min使酶失活。铺1%的胶检测（图2A）。结果显示使用phi29DNA聚合酶对500pg的DNA模板扩增效果良好。

2.2 PCR产物纯化

（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500 μL的平衡液BL，12,000 rpm (～13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（2）估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）。

（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000 rpm(～13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。

（4）向吸附柱CB1中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (～13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。

（5）重复操作步骤4。

（6）12,000 rpm(～13,400×g)离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

（7）取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12,000rpm(～13,400×g)离心2 min，收集DNA溶液。

2.3 BRAF基因突变检测

（1）配置如下PCR反应体系，分别扩增BRAF基因的第11和15号外显子，

；

其中针对11号外显子突变的引物如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示；针对15号外显子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。

（2）反应条件：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；

（3）PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图2B），结果显示第二轮PCR对BRAF基因的第11和15号外显子均出现特异性扩增；然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序检测；测序结果如图5所示，BRAF基因第11号外显子发生错义突变c.1391G>T>

实施例3：100pg的DNA模板中BRAF基因突变检测

1、实验材料

phi29 DNA聚合酶，10×reaction buffer，dNTP (10nM) ，100×BSA，1000pg的 DNA模板，去离子水，primer1-prime18 (即Primer Mix)，2×Pfu Mix，primer19-primer22，PCR仪，超薄产物纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司DP203），1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。

2、实验步骤

2.1 预扩增

（1）引物稀释。将primer1-prime18分别稀释后混匀形成Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为2μM。

配置如下体系：

；

（2）将上述试剂混匀后，98℃预变性10min，然后迅速置于冰上20min。

（3）再加入如下体系：

；

将上述混合物混匀后，30-35℃扩增过夜，65℃加热20min使酶失活。铺1%的胶检测（图3A）。结果显示使用phi29DNA聚合酶对100pg的DNA模板扩增效果良好。

2.2 PCR产物纯化

（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500 μL的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（2）估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）。

（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。

（4）向吸附柱CB1中加入600 μＬ漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。

（5）重复操作步骤4。

（6）12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

（7）取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μＬ洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12,000rpm(~13,400×g)离心2 min，收集DNA溶液。

2.3 BRAF基因突变检测

（1）配置如下PCR反应体系，分别扩增BRAF基因的第11和15号外显子，

；

其中针对11号外显子突变的引物如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示；针对15号外显子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。

（2）反应条件：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；

（3）PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图3B），结果显示第二轮PCR对BRAF基因的第11和15号外显子均出现特异性扩增；然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序检测；测序结果如图6所示，BRAF基因第11号外显子发生错义突变c.1391G>T>

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>用于检测微量组织中BRAF基因突变的引物组合及其应用

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

agaggaaaga tgaag15

<210>2

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gaaattagat ctctt15

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tgataggaaa atgag15

<210>4

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cttcatgaag acctc15

<210>5

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aaatctcgat ggagt15

<210>6

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cattttgtgg atggt15

<210>7

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ttggccctga gatgc15

<210>8

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

catagttccc agtat15

<210>9

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ttaggtaaga gatct15

<210>10

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tcctatcaga gcaag15

<210>11

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ctgaggtgta gtaag15

<210>12

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

tcactgtagc tagac15

<210>13

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tggatccaga caact15

<210>14

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gcatctcagg gccaa15

<210>15

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

atagttgaga ccttc15

<210>16

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gtgaatactg ggaac15

<210>17

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

gggcaggang10

<210>18

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

nnatgtgg 8

<210>19

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

agggttttcc cagtcacggc ataaggtaat gtacttaggg tga 43

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gtcacaatgt caccacatta catac 25

<210>21

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

agggttttcc cagtcacgct cttacctaaa ctcttcataa tgc 43

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

cagggccaaa aatttaatca gtg 23