一种麻竹茎端诱导愈伤组织并获得再生植株的方法

技术领域

本发明属于林木快繁领域，具体涉及一种麻竹茎端诱导愈伤组织并获得再生植株的方法。

背景技术

麻竹是禾本科竹亚科牡竹属麻竹亚属，在福建台湾广东广西贵州云南等部自然分布，是中国华南及东南沿海地区重要的笋材两用的大型丛生竹种之一，具有极高的经济价值和社会价值。麻竹组织培养相关的研究比较少，目前主要以花药及种胚为主要的外植体。1987年，Yeh等由麻竹的种胚为材料，成功诱导出麻竹的愈伤组织并获得再生植株，但是由于麻竹的开化周期很长，因此种子不易获得，导致该方法的取材方面的限制。1990年Tsay等利用麻竹的花药诱导出愈伤组织后获得再生植株，但通过该方法获得的单倍体植株在移栽后半年内即死亡，这说明该方法在生产上的可行性较小；同时，该体系对竹类的外植体获取有很大的局限性，比如麻竹的开花周期很长，且很少开花，因此不容易获得花药；由花药培养出的再生植株理论上来讲由二倍体变成单倍体，对植株的后期发育造成不可预知的影响。因此建立以麻竹营养组织为外植体的再生体系可以破解外植体难以获得的难题，为现代生物技术应用于麻竹育种开辟新的途径。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种麻竹茎端诱导愈伤组织并获得再生植株的方法。通过调节特定的植物培养基以及不同的植物激素配比，优化培养条件诱导麻竹茎端的愈伤组织，并经诱导分化后获得再生植株。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种麻竹茎端诱导愈伤组织并获得再生植株的方法，具体包括以下步骤：

（1）外植体的选择：取多年生的麻竹幼嫩枝条为外植体，经流水冲洗2-3小时，70wt%的乙醇表面消毒45秒，无菌水冲洗3-5次，后用0.1wt%的升汞震荡消毒，消毒的时间为8分钟，无菌水冲洗5-10次；后用无菌纸吸干表面水分，作为外植体备用；

（2）愈伤组织的诱导培养和增殖培养：将步骤（1）得到的无菌外植体切成0.5-1 cm的小段，放在愈伤组织的诱导培养基上，黑暗条件下培养30-40天后愈伤组织开始形成；诱导出的愈伤组织呈现多种状态，分离淡黄色且致密的胚性愈伤组织，接种到增殖培养基上，在黑暗状态下进行培养，每两周更换一次培养基，增殖培养时间为3-4周；

（3）胚状体的诱导和萌发：分拣步骤（2）增殖良好的愈伤组织接种到诱导生芽的培养基上，光照条件下培养30-50天，胚状体逐渐诱导生芽；诱导生芽的培养条件是：光照16 h，光照强度2000 lux；分化的效率在50 %；

（4）生根：将步骤（3）中诱导出的丛生芽从愈伤组织中分离，每3-5株为一个单位放置入生根培养基中；15天左右可以看到根的萌动，30-40天后根逐渐粗壮，生根的效率达到90%；

（5）壮苗、炼苗和移栽入土：步骤（4）中生根培养基中的组培苗在生根的同时进行芽的增殖，在组培苗生根3-4根后放入自来水中呈半开瓶状态炼苗2-3天，后将植株从培养基中取出，洗净培养基后，再放置1天；移栽入土后，温室培养1-2周，温室培养条件为：光照16 h，强度2000 lux，温度21-26℃；随后进行遮荫散光培养，每天喷水，湿度保持在40wt%-60wt%；成活率90%。

步骤（2）所述的愈伤组织的诱导培养基：MS+BAP 0.3 mg/L+2, 4-D 4 mg/L+IBA 0.2 mg/L+ 2-（N-吗啉代）乙磺酸0.5 g/L+蔗糖 50 mg/L+琼脂粉8 g/L，PH为5.0。

步骤（2）所述的增殖培养基：MS+蔗糖50 mg/L+PVP 0.5g/L+2,4-D 4 mg/L+琼脂粉8 g/L，PH为5.8。

步骤（3）所述的诱导生芽的培养基：NB培养基+蔗糖 30 g/L+ 6-BA 3 mg/L+1.5 mg/L KT+NAA 0.1 mg/L＋250 mg/L PVP+琼脂粉8 g/L，PH为5.8。

步骤（4）中所述的生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L+琼脂粉8g/L，PH为6.0。

本发明的有益效果在于：

（1）建立了由麻竹的营养组织为起始的愈伤诱导体系，并成功获得再生植株，为麻竹苗的快繁提供了一种技术手段；

（2）为将来的麻竹转基因体系建立提供平台。

附图说明

图1为由茎端起始诱导麻竹再生体系的整个过程：图1A为茎端诱导培养基上诱导出愈伤组织；图1B为愈伤组织继代培养；图1C为愈伤组织在诱导培养基上的初期形态；图1D为再生植株诱导形成；图1E为再生植株簇生生长；图1F为再生植株诱导生根；图1G为再生植株在土中培养成活。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。

实施例1

一种麻竹茎端诱导愈伤组织并获得再生植株的方法，具体包括以下步骤：

（1）外植体的选择：取多年生的麻竹幼嫩枝条为外植体，经流水冲洗3小时，70wt%的乙醇表面消毒45秒，无菌水冲洗4次，后用0.1wt%的升汞震荡消毒，消毒的时间为8分钟，无菌水冲洗8次；后用无菌纸吸干表面水分，作为外植体备用；

（2）愈伤组织的诱导培养和增殖培养：将步骤（1）得到的无菌外植体切成0.5 cm的小段，放在愈伤组织的诱导培养基上，黑暗条件下培养30天后愈伤组织开始形成；诱导出的愈伤组织呈现多种状态，分离淡黄色且致密的胚性愈伤组织，接种到增殖培养基上，在黑暗状态下进行培养，每两周更换一次培养基，增殖培养时间为3周；

（3）胚状体的诱导和萌发：分拣步骤（2）增殖良好的愈伤组织接种到诱导生芽的培养基上，光照条件下培养30天，胚状体逐渐诱导生芽；诱导生芽的培养条件是：光照16 h，光照强度2000 lux；分化的效率在50 %；

（4）生根：将步骤（3）中诱导出的丛生芽从愈伤组织中分离，每3株为一个单位放置入生根培养基中；生根的效率达到90%；

（5）壮苗、炼苗和移栽入土：步骤（4）中生根培养基中的组培苗在生根的同时进行芽的增殖，在组培苗生根3根后放入自来水中呈半开瓶状态炼苗2天，后将植株从培养基中取出，洗净培养基后，再放置1天；移栽入土后，温室培养1周，温室培养条件为：光照16 h，强度2000 lux，温度25℃；随后进行遮荫散光培养，每天喷水，湿度保持在40wt%；成活率90%。

步骤（2）所述的愈伤组织的诱导培养基：MS+BAP 0.3 mg/L+2, 4-D 4 mg/L+IBA 0.2 mg/L+ 2-（N-吗啉代）乙磺酸0.5 g/L+蔗糖 50 mg/L+琼脂粉8 g/L，PH为5.0。

步骤（2）所述的增殖培养基：MS+蔗糖50 mg/L+PVP 0.5g/L+2,4-D 4 mg/L+琼脂粉8 g/L，PH为5.8。

步骤（3）所述的诱导生芽的培养基：NB培养基+蔗糖 30 g/L+ 6-BA 3 mg/L+1.5 mg/L KT+NAA 0.1 mg/L＋250 mg/L PVP+琼脂粉8 g/L，PH为5.8。

步骤（4）中所述的生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L+琼脂粉8g/L，PH为6.0。

实施例2

一种麻竹茎端诱导愈伤组织并获得再生植株的方法，具体包括以下步骤：

（1）外植体的选择：取多年生的麻竹幼嫩枝条为外植体，经流水冲洗2小时，70wt%的乙醇表面消毒45秒，无菌水冲洗5次，后用0.1wt%的升汞震荡消毒，消毒的时间为8分钟，无菌水冲洗10次；后用无菌纸吸干表面水分，作为外植体备用；

（2）愈伤组织的诱导培养和增殖培养：将步骤（1）得到的无菌外植体切成1 cm的小段，放在愈伤组织的诱导培养基上，黑暗条件下培养40天后愈伤组织开始形成；诱导出的愈伤组织呈现多种状态，分离淡黄色且致密的胚性愈伤组织，接种到增殖培养基上，在黑暗状态下进行培养，每两周更换一次培养基，增殖培养时间为4周；

（3）胚状体的诱导和萌发：分拣步骤（2）增殖良好的愈伤组织接种到诱导生芽的培养基上，光照条件下培养50天，胚状体逐渐诱导生芽；诱导生芽的培养条件是：光照16 h，光照强度2000 lux；分化的效率在50 %；

（4）生根：将步骤（3）中诱导出的丛生芽从愈伤组织中分离，每5株为一个单位放置入生根培养基中；生根的效率达到90%；

（5）壮苗、炼苗和移栽入土：步骤（4）中生根培养基中的组培苗在生根的同时进行芽的增殖，在组培苗生根4根后放入自来水中呈半开瓶状态炼苗3天，后将植株从培养基中取出，洗净培养基后，再放置1天；移栽入土后，温室培养2周，温室培养条件为：光照16 h，强度2000 lux，温度26℃；随后进行遮荫散光培养，每天喷水，湿度保持在60wt%；成活率90%。

步骤（2）所述的愈伤组织的诱导培养基：MS+BAP 0.3 mg/L+2, 4-D 4 mg/L+IBA 0.2 mg/L+ 2-（N-吗啉代）乙磺酸0.5 g/L+蔗糖 50 mg/L+琼脂粉8 g/L，PH为5.0。

步骤（2）所述的增殖培养基：MS+蔗糖50 mg/L+PVP 0.5g/L+2,4-D 4 mg/L+琼脂粉8 g/L，PH为5.8。

步骤（3）所述的诱导生芽的培养基：NB培养基+蔗糖 30 g/L+ 6-BA 3 mg/L+1.5 mg/L KT+NAA 0.1 mg/L＋250 mg/L PVP+琼脂粉8 g/L，PH为5.8。

步骤（4）中所述的生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L+琼脂粉8g/L，PH为6.0。

实施例3

一种麻竹茎端诱导愈伤组织并获得再生植株的方法，具体包括以下步骤：

（1）外植体的选择：取多年生的麻竹幼嫩枝条为外植体，经流水冲洗3小时，70wt%的乙醇表面消毒45秒，无菌水冲洗3次，后用0.1wt%的升汞震荡消毒，消毒的时间为8分钟，无菌水冲洗8次；后用无菌纸吸干表面水分，作为外植体备用；

（2）愈伤组织的诱导培养和增殖培养：将步骤（1）得到的无菌外植体切成0.8 cm的小段，放在愈伤组织的诱导培养基上，黑暗条件下培养35天后愈伤组织开始形成；诱导出的愈伤组织呈现多种状态，分离淡黄色且致密的胚性愈伤组织，接种到增殖培养基上，在黑暗状态下进行培养，每两周更换一次培养基，增殖培养时间为3周；

（3）胚状体的诱导和萌发：分拣步骤（2）增殖良好的愈伤组织接种到诱导生芽的培养基上，光照条件下培养40天，胚状体逐渐诱导生芽；诱导生芽的培养条件是：光照16 h，光照强度2000 lux；分化的效率在50 %；

（4）生根：将步骤（3）中诱导出的丛生芽从愈伤组织中分离，每4株为一个单位放置入生根培养基中；生根的效率达到90%；

（5）壮苗、炼苗和移栽入土：步骤（4）中生根培养基中的组培苗在生根的同时进行芽的增殖，在组培苗生根3根后放入自来水中呈半开瓶状态炼苗2天，后将植株从培养基中取出，洗净培养基后，再放置1天；移栽入土后，温室培养2周，温室培养条件为：光照16 h，强度2000 lux，温度21℃；随后进行遮荫散光培养，每天喷水，湿度保持在50wt%；成活率90%。

步骤（2）所述的愈伤组织的诱导培养基：MS+BAP 0.3 mg/L+2, 4-D 4 mg/L+IBA 0.2 mg/L+ 2-（N-吗啉代）乙磺酸0.5 g/L+蔗糖 50 mg/L+琼脂粉8 g/L，PH为5.0。

步骤（2）所述的增殖培养基：MS+蔗糖50 mg/L+PVP 0.5g/L+2,4-D 4 mg/L+琼脂粉8 g/L，PH为5.8。

步骤（3）所述的诱导生芽的培养基：NB培养基+蔗糖 30 g/L+ 6-BA 3 mg/L+1.5 mg/L KT+NAA 0.1 mg/L＋250 mg/L PVP+琼脂粉8 g/L，PH为5.8。

步骤（4）中所述的生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L+琼脂粉8g/L，PH为6.0。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。