生理性细胞自噬模型的建立方法以及黄嘌呤氧化酶在建立细胞自噬模型中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及生理性的细胞自噬模型的建立。

背景技术

自噬(Autophagy)是一种通过溶酶体途径降解包括细胞器在内的胞质成分的分解代谢途径，在进化上高度保守且普遍存于真核细胞中。

根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的差异，细胞自噬可分为：1)大自噬，通过起始(导致分割膜或吞噬泡的前自噬体结构的形成)、囊泡延伸、自噬体成熟以及自噬体-溶酶体融合、自噬体内容物被溶酶体酸性水解酶降解，最终自噬体内容物被释放以进行代谢再循环；2)小自噬，是指在溶酶体或酵母液泡表面通过突出、内陷或分隔隔离细胞器的膜来直接摄取待降解成分；3)分子伴侣介导的自噬，由胞质中的分子伴侣识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列并与之结合，分子伴侣-底物复合物与溶酶体膜上的受体LAMP2(lysosomeassociated membrane protein type 2)结合后，底物去折叠，溶酶体腔中的另一种分子伴侣介导底物在溶酶体膜的转位，然后底物在水解酶的作用下被分解再利用。随着自噬研究的深入，根据对降解底物的选择性不同，自噬又被分为线粒体自噬(mitophagy)、过氧化物酶体自噬(pexophagy)、内质网自噬(reticulophagy)、细胞核的碎片状自噬(piecemealautophagy of the nucleus)、核糖体自噬(ribophagy)、脂肪自噬(lipophagy)、蛋白体聚集自噬(aggrephagy)、异体吞噬(xenophagy)等。

已有的自噬模型往往自噬发生快、通量小，因而对其捕捉和检测造成困难，且常常与凋亡或坏死相伴发生，为自噬这一生理现象的研究造成干扰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生理性细胞自噬模型的建立方法以及黄嘌呤氧化酶在建立细胞自噬模型中的应用，所建立的细胞自噬模型具有自噬发生显著、易于检测、持续时间久，并且不伴有细胞凋亡或坏死的优点。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种生理性细胞自噬模型的建立方法，该自噬模型的建立方法包括以下步骤：用黄嘌呤氧化酶对培养中的动物细胞进行处理。

所述自噬模型的建立方法具体包括以下步骤：将动物细胞接种至培养器皿中并培养至动物细胞贴壁生长，然后向培养器皿中加入终浓度为1～40mU/mL的黄嘌呤氧化酶，并继续培养至少0.5小时。

所述动物细胞接种量为1×10⁴～3×10⁵个。

所述动物细胞贴壁生长至覆盖培养器皿底面积的50～60％后加入黄嘌呤氧化酶。

所述动物选自哺乳动物。

所述动物细胞选自上皮细胞或间质细胞。

黄嘌呤氧化酶在建立细胞自噬模型中的应用。

所述黄嘌呤氧化酶为自噬诱导剂。

所述细胞自噬模型包括线粒体自噬。

本发明的有益效果体现在：

本发明以黄嘌呤氧化酶为自噬诱导剂建立细胞自噬模型，可在较长时间内持续、高效诱导细胞自噬。同时，本发明所述细胞自噬模型的建立方法在能明显诱导自噬的黄嘌呤氧化酶剂量作用下并没有明显降低细胞活力，不会导致明显的细胞凋亡或坏死。

附图说明

图1A为XOD处理细胞后MDC荧光结果；Control为对照组结果，各个处理组的结果以左上角标注的代表XOD浓度的数字相区别(XOD浓度分别为1、5、10、20以及40mU/mL)，处理24h；

图1B为XOD处理细胞后LC3蛋白免疫荧光结果；Control为对照组结果，各个处理组的结果以左上角标注的代表XOD浓度的数字相区别(XOD浓度分别为1、5、10、20以及40mU/mL)，处理24h；

图1C为XOD处理细胞后透射电子显微镜(TEM)结果；Control为对照组结果，各个处理组的结果以左上角标注的代表XOD浓度的数字相区别(XOD浓度分别为1、5、10、20以及40mU/mL)，处理24h；

图1D为XOD处理细胞后Western Blot及量化结果(处理24h)；0表示对照组结果；

图1E为XOD处理细胞后自噬通量Western Blot检测结果(20mU/mL XOD处理24h)，＊表示p＜0.05，VS Control or XOD；

图1F为采用mRFP-GFP-LC3串联的荧光蛋白表达载体系统对XOD处理细胞后自噬通量检测结果(20mU/mL XOD处理24h)；

图1G为XOD处理多种细胞对自噬标志物LC3水平的Western Blot结果(处理24h)；

图2A为经典自噬诱导剂Rapamycin、EBSS和XOD处理细胞后自噬水平比较(MDC荧光结果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM；

图2B为经典自噬诱导剂Rapamycin、EBSS和XOD处理细胞后自噬水平比较(LC3免疫荧光结果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM；

图2C为经典自噬诱导剂Rapamycin、EBSS和XOD处理细胞后自噬水平比较(TEM结果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM；

图2D为经典自噬诱导剂Rapamycin、EBSS和XOD处理细胞后自噬水平比较(WesternBlot及量化结果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM，＊表示p＜0.05，VS each Control(2h/8h/24h)；

图3为常用氧化剂及XOD对细胞凋亡及细胞活力的影响，＊表示p＜0.05，VSControl；其中，XOD：20mU/mL，(a)是Western Blot及量化结果，(b)是流式检测细胞死亡及量化结果，(c)是细胞生长曲线结果；

图4为XOD诱导线粒体自噬的结果，＊表示p＜0.05，VS Control；其中，(A)是线粒体膜电位结果(JC-1染色共聚焦结果)，(B)是线粒体膜电位流式细胞仪量化结果，(C)是免疫荧光双标结果，(D)是线粒体自噬关键蛋白Western Blot及量化结果，(E)是透射电子显微镜结果，(F)是线粒体DNA拷贝数(荧光定量PCR)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。

(一)主要实验部分

1)黄嘌呤氧化酶(XOD)诱导自噬模型实验

L-02细胞采用含10％(体积分数)FBS(胎牛血清)的MEM完全培养基为细胞培养液，在37℃并含有5％CO₂及饱和湿度条件下培养细胞。处于对数生长期时，用2.5‰的胰蛋白酶(即质量分数2.5‰的胰蛋白酶溶液)将细胞消化至不再贴壁，混合MEM完全培养基均匀吹打制成细胞悬液，细胞悬液接种于6孔板等培养器皿中，起始细胞浓度为3×10⁵个细胞/孔，37℃、5％CO₂及饱和湿度条件的细胞培养箱中培养24小时至细胞贴壁生长，密度大约为覆盖培养器皿底面积的50～60％后，处理组分别加入终浓度1、5、10、20、40mU/mL的黄嘌呤氧化酶(XOD)进行处理(处理指加XOD并继续保持培养条件进行培养)24小时，然后检测细胞自噬及线粒体自噬。对照组(Control)加入相同体积水作为对照，后续处理及检测同处理组。

2)类似地，采用XOD处理其他多种细胞如人肝细胞HepG2、人肺细胞BEAS-2B、人成纤维细胞WI-38、人皮肤细胞HaCat、以及大鼠肝细胞Clone 9、小鼠肝细胞AML12，处理组分别加入1、5、10、20、40mU/mL的XOD进行处理24小时，然后采用Western Blot方法检测细胞自噬标志物LC3水平的变化。

3)黄嘌呤氧化酶(XOD)与经典自噬诱导剂诱导的自噬模型的优势评价实验

将L-02细胞按照起始浓度3×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，37℃、5％CO₂及饱和湿度条件细胞培养箱中培养24小时后，随机分组为对照组、雷帕霉素(Rapamycin)组、厄尔平衡盐溶液(EBSS)组和黄嘌呤氧化酶(XOD)组。其中雷帕霉素组加入终浓度为1μM的Rapamycin(通过预实验筛选获得的最佳浓度)，厄尔平衡盐溶液组采用EBSS替换细胞的完全培养基，黄嘌呤氧化酶组采用20mU/mL的XOD处理细胞，在处理2、8和24小时后，分别检测细胞自噬。对照组加入相同体积的溶剂。

4)黄嘌呤氧化酶(XOD)与常用氧化剂诱导的自噬模型的优势评价实验

将L-02细胞按照起始浓度3×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，37℃、5％CO₂及饱和湿度条件细胞培养箱中培养24小时后，随机分组为对照组、不同剂量叔丁基过氧化氢(t-BHP)组、不同剂量百草枯(PQ)组和黄嘌呤氧化酶(XOD)组。首先通过Western>

(二)指标检测方法

1)Western Blot

细胞经过不同处理后，采用Western Blot蛋白免疫印迹法测定相关蛋白相对表达水平。具体过程：用2.5‰的胰蛋白酶将细胞消化后收集细胞，1000g离心5min弃上清，PBS清洗1遍，加入100μL RIPA细胞裂解液(1％protease inhibitor+1％phosphataseinhibitor)，-80℃反复冻融2次后，14000g，4℃，离心20min，取上清为总蛋白，并分装蛋白样品。取少量蛋白用BCA蛋白定量试剂盒，测定蛋白浓度，以总上样量为30μg计算上样体积。蛋白样品与等量2×上样Buffer混匀后煮沸5min，冷却后离心混匀。根据不同分子量，分别配制浓度为7％、10％及12％的浓缩胶，按计算好的体积上样后，150V电泳60min。用半干转转膜仪将蛋白转移到PVDF膜上。5％脱脂奶粉室温封闭2h，弃封闭液，TBST清洗膜后加入相应的一抗溶液，4℃摇床孵育过夜。用TBST洗膜3次，5min/次。5％脱脂牛奶稀释适合的辣根酶二抗，室温孵育2h，TBST清洗4次，5min/次。发光液均匀覆盖膜后，凝胶成像系统进行化学发光，并使用Quantity One软件对显影成像进行定量分析。

2)免疫荧光

2.1)自噬小体检测

采用免疫荧光标记细胞内LC3蛋白以示踪自噬小体。具体过程：处理结束后，4％多聚甲醛室温固定20min后PBS清洗3遍，0.5％TritonX-100室温透化8min后PBS清洗3遍，然后用5％BSA溶液37℃封闭1h。弃BSA溶液后，用新鲜BSA溶液配制LC3(1：200)抗体溶液，加入培养器皿中，4℃孵育过夜。弃一抗，PBS清洗3遍，FITC羊抗兔二抗与5％BSA溶液1：100稀释后加入培养器皿中，37℃孵育1h，PBS清洗3遍，500μL PBS/皿，用激光共聚焦显微镜选择FITCEx/Em:495/530nm波长观察荧光点分布及数量。

2.2)线粒体自噬检测

采用免疫荧光标记细胞内LC3蛋白以示踪自噬小体，并与线粒体标志蛋白SDHA，即线粒体复合物Ⅱ共定位以示踪线粒体自噬体。具体过程：处理结束后，4％多聚甲醛室温固定20min后PBS清洗3遍，0.5％TritonX-100室温透化8min后PBS清洗3遍，然后用5％BSA溶液37℃封闭1h。弃BSA溶液后，用LC3、SDHA及新鲜BSA溶液以1:1:200的比例配制抗体溶液，加入培养皿中，4℃孵育过夜。弃一抗，PBS清洗3遍，FITC羊抗兔二抗与5％BSA溶液1:100稀释后加入培养皿中，37℃孵育1h，PBS清洗3遍，加500μL PBS/皿，用激光共聚焦显微镜选择FITC(Ex/Em:495/530nm)波长观察荧光点分布及数量。

3)自噬体显微观察

透射电子显微镜(TEM)下超微结构的形态学检测是检测自噬体的金指标。在透射电子显微镜下可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性，其周围出现空泡状双层膜样结构、继而双层膜环绕成自噬体、进而与溶酶体融合，消化，也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等。样品制备如下：处理完成后，PBS清洗3遍，用2.5‰的胰蛋白酶将细胞消化后收集细胞于1.5mL EP管中，1000g离心5min弃上清，顺管壁缓慢加入戊二醛1mL/管，4℃静置24h。用PBS冲洗3次，15min/次。后固定、脱水、渗透、包埋、正染色以及超薄切片。

4)MDC染色

MDC是一种非特异性的自噬染色剂，被细胞吸收并选择性识别自噬溶酶体，在激光共聚焦显微镜下可观察到细胞浆及细胞核周围MDC标记的自噬溶酶体呈点状分布，通过细胞内荧光点量及强度的变化的变化来衡量自噬水平的高低。细胞经处理后，PBS清洗1次，用终浓度为100nM的MDC 37℃孵育30min，PBS清洗3次，激光共聚焦下观测。

5)荧光定量PCR

采用荧光定量PCR进行检测mtDNA拷贝数以直接反映细胞线粒体数量并间接反映线粒体自噬水平。参考试剂盒说明书提取DNA，然后再利用DNA作为起始模板在实时PCR仪上进行后续的扩增及检测。具体PCR条件如下：按照20μL反应体系(10μL 2×PCR Taq MasterMix+1μL模板+1μL上游引物+1μL下游引物+7μL DEPC H₂O)加入八联管中，在荧光定量PCR仪上以95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；70℃，10min；循环40次的条件进行定量检测。

(三)实验结果

1)XOD诱导自噬模型的确立

1.1)XOD对细胞自噬水平的影响

MDC荧光染色结果显示，在不同浓度XOD处理条件下，蓝色荧光点代表的自噬溶酶体随XOD剂量的加大而增多(图1A)。随XOD浓度增加，自噬标志蛋白LC3免疫荧光结果显示，绿色荧光点代表的自噬小体明显增多(图1B)。TEM结果显示(图1C)，在不同浓度XOD处理条件下均可以观察到有不同程度的自噬小体形成(箭头所示)，为包裹有内容物的双层膜结构，大小不均一，部分已与溶酶体融合或已被溶酶体降解成空泡样，数量呈明显的剂量效应关系。Western Blot结果显示，随XOD浓度增加，细胞自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达水平依次升高(图1D)，但自噬相关蛋白Atg5、Beclin1、Atg7、Atg12、LAMP2及p62等表达水平均无明显变化(β-Actin为内参蛋白)。以上结果均显示，在本实验条件下，20和40mU/mL浓度XOD处理条件下可显著诱导自噬的发生，因此，后续的实验当中选择诱导效果显著，且用量较小的20mU/mL XOD作为模型处理剂量。

1.2)对XOD诱导的自噬通量进行检测

首先采用自噬溶酶体抑制剂NH₄Cl单独或与XOD联合处理(XOD+NH₄Cl)细胞后，Western>4Cl联合作用后LC3Ⅱ水平进一步升高(p＜0.05)，由此说明NH₄Cl可以抑制XOD诱导的自噬体与溶酶体结合。同时采用mRFP-GFP-LC3串联的荧光蛋白表达载体系统在荧光显微镜下观察细胞自噬通量的变化。结果显示(图1F)，与对照组相比，XOD处理细胞后，受酸碱环境影响的红色荧光和代表LC3水平的绿色荧光明显升高，融合后(Merge)的黄色荧光也比对照组明显升高。这些结果说明XOD确实引起了自噬水平的升高。

1.3)此外采用XOD处理其他多种人和动物细胞，包括人肝细胞HepG2、人肺细胞BEAS-2B、人成纤维细胞WI-38、人皮肤细胞HaCat、以及大鼠肝细胞Clone 9、小鼠肝细胞AML12，以自噬标志物LC3的水平变化来衡量自噬情况，结果发现XOD可以引起上述所有实验细胞LC3水平发生显著变化(图1G)，说明XOD诱导细胞自噬具有很好的普遍性。

2)XOD诱导的自噬模型的优势评价

2.1)与经典自噬诱导剂相比XOD诱导自噬模型的优势

已有的自噬诱导剂有很多，但为了评价XOD诱导自噬模型的优势，将XOD诱导自噬效果与经典自噬诱导剂Rapamycin以及EBSS做了不同时间的比较。将细胞分别用XOD、Rapamycin和EBSS处理2h、8h和24h后，分别检测各自噬指标变化。MDC结果显示(图2A)，细胞处理2h后，与对照组相比，三个处理组的蓝色荧光均增强，处理8h和24h后与对照组相比，各组蓝色荧光均增强，其中XOD处理组最强。LC3免疫荧光结果显示(图2B)，细胞处理2h后，与对照组相比，XOD和Rapamycin绿色荧光点均增多，EBSS处理组变化微弱，处理8h后，三个处理组绿色荧光点数量均较对照组大，处理24h后，XOD处理组绿色荧光点数量仍最大，而Rapamycin和EBSS处理组变化不明显。TEM结果显示(图2C)，细胞处理2h后，与对照组相比，三个处理组均有不同程度的自噬小体形成，其中XOD处理组形成的自噬小体最多，处理8h后，三个处理组均有不同程度的自噬小体形成，XOD处理组最多，Rapamycin处理组次之，EBSS处理组最少。Western Blot结果也显示(图2D)，细胞处理2h后，与对照组相比，EBSS和XOD处理组LC3 Ⅱ表达水平明显升高(p＜0.05)，处理8h后Rapamycin和XOD处理组LC3 Ⅱ表达水平明显升高(p＜0.05)，处理24h后XOD处理组LC3 Ⅱ表达水平明显升高(p＜0.05)。由以上结果可以看出，Rapamycin、EBSS和XOD均可诱导细胞发生自噬，但Rapamycin和EBSS在短时间内(＜8h)可有效诱导自噬，XOD可长时间持续有效诱导细胞自噬，且呈一定的时间依赖效应关系。

2.2)与常用氧化剂诱导自噬模型相比XOD诱导自噬模型的优势

氧化应激条件可诱导自噬的模型已有很多报道，接下来就将XOD与其他常用氧化剂诱导的自噬模型进行对比。首先，Western Blot结果显示(图3(a))，细胞处理24h后，与对照组相比，800μM t-BHP、2mM PQ和20mU/mL XOD处理组LC3Ⅱ表达水平明显升高(p＜0.05)。同样处理条件下，细胞凋亡及坏死检测结果显示(图3(b))，800μM t-BHP和2mM PQ可明显引起细胞凋亡和坏死，但能够显著引起LC3水平变化的XOD(20mU/mL)处理条件下，未引起明显的细胞凋亡或坏死。此外，800μM t-BHP、2mM PQ和20mU/mL XOD分别处理细胞24h后，去除各种诱导剂，继续培养48h，分别于处理0h，24h，48h和72h后MTT法检测细胞活性，结果显示(图3(c))，0h时各组细胞活性处在相同水平，24h后，800μM t-BHP和2mM PQ处理组细胞活力较对照组明显下降，XOD处理活力下降幅度较小，48h和72h后800μM t-BHP和2mM PQ处理组细胞活力继续下降，XOD处理组继续上升，72h时与对照组持平。由以上结果可以看出，与常规氧化剂t-BHP和PQ相比，XOD在诱导细胞自噬的同时，不伴随有细胞凋亡或坏死。

2.3)XOD诱导线粒体自噬

为了进一步检测XOD是否也诱导了线粒体自噬，采用不同的线粒体自噬检测方法对其进行检测。线粒体膜电位降低是线粒体自噬的前提条件，JC-1结果显示(图4(A))，20mU/mL的XOD处理细胞后，红色荧光代表的富集在细胞线粒体内膜的JC-1有较明显的降低，绿色荧光代表的游离状的JC-1有所增加，叠加后可看到黄色荧光增强。可以说明XOD可降低线粒体膜电位。通过流式细胞仪进行定量检测可以发现XOD处理可以显著降低线粒体膜电位(图4(B))。免疫荧光双标是检测线粒体自噬的常用方法，红绿荧光分别标记线粒体和LC3，结果显示(图4(C))，XOD可使标记LC3蛋白的绿色荧光点增多，且与红色荧光标记的线粒体共定位增加。相应采用Western Blot方法检测线粒体自噬标志蛋白BNIP3L、FUNDC1、Parkin和PINK1并进行量化，结果发现XOD可以显著提高这些线粒体自噬的标志蛋白的水平(图4(D))。透射电子显微镜下可以看到(图4(E))XOD处理相比对照组有空泡膜包被的线粒体。此外，荧光定量PCR结果显示(图4(F))，XOD使线粒体mtDNA拷贝数明显降低，说明线粒体数量显著减少，进一步证明了XOD可以引起线粒体自噬。以上这些结果均表明，XOD可以引起明显的线粒体自噬。

mTOR抑制剂(雷帕霉素)和EBSS导致的饥饿均被作为自噬的阳性对照而广泛采用。在诱导自噬效率方面，然而，在许多类型的细胞中，雷帕霉素诱导的自噬水平低且瞬时发生，因此，尽管在一些研究中它能有效诱导自噬，但在一些原代神经元细胞中却没有很好的效果。相比之下，EBSS可诱导各类细胞自噬，但自噬水平的活化程度依然不高，且长时间对细胞进行饥饿处理会对细胞造成不可逆的损伤。通过与经典的自噬诱导剂雷帕霉素和EBSS诱导的自噬在诱导时长以及在不同时间对自噬诱导的程度进行比较。本发明结果发现，与经典自噬诱导剂相比，XOD可在较长时间内持续、高效诱导细胞自噬。

对自噬的研究还存在另外一个难题，在很多实验条件下，自噬往往与细胞凋亡或坏死同时发生，这使得对自噬的针对性研究造成干扰。在第一部分实验中，发现能明显诱导自噬的XOD剂量并没有明显降低细胞活力，鉴于此，通过与第一部分实验中所采用能诱导自噬的氧化剂，在自噬诱导效果以及在相同浓度下对细胞凋亡及死亡程度进行比较。结果发现，在能明显诱导自噬的剂量下，t-BHP及PQ导致了明显的细胞凋亡和坏死，而XOD对细胞生存并没有影响。由此可见，XOD诱导细胞自噬同时不伴随有明显的凋亡或坏死，是一种生理性细胞自噬模型。