气相色谱串联质谱/质谱法同时测定豆芽中6种植物生长调节剂残留的方法

技术领域

本发明涉及一种豆芽中6种植物生长调节剂残留的测定方法，尤其是涉及一种通过气相色谱串联质谱/质谱法对豆芽中6种植物生长调节剂进行定量检测的方法。

背景技术

近年来，随着“毒豆芽”事件的屡次曝光，引起了人民对豆芽质量安全的高度重视。所谓“毒豆芽”，是指在豆芽生产过程中非法添加对人体有害的工业原料、激素、农药、兽药、抗生素等，从而改变豆芽生产周期和外观，增加豆芽产量，最后流入市场销售的豆芽，因其添加的很多物质都对人体有害，故称为毒豆芽。

植物生长调节剂是人工合成的对植物的生长发育有调节作用的化学物质和从生物中提取的天然植物激素。根据其作用可分为：植物生长抑制剂，植物生长促进剂，植物生长延缓剂。在生产上常用的有3种类型植物生长促进剂生长素类，分别是：吲哚衍生物，如吲哚乙酸(IAA)，吲哚丁酸(IBA)；氯代苯的衍生物，如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，2,4-D丁酯；萘乙酸类，如萘乙酸(NAA)；防落素，如4-氯苯氧乙酸(4-CPA)。它们的生理作用与内源激素相似，可以促进植物叶片的扩大生长，维管束的分化、根的形成。不法商贩在生产豆芽时通过添加豆芽激素，使豆芽长得粗壮长，无毛根，从而来迎合群众的选购意愿。

而人类食用后可以通过新陈代谢将其降解，正常使用情况下合理地使用植物生长调节剂，将它在豆芽中的残留量控制在一定范围内，是不会对人体造成危害的。但是不合理的过量植物生长调节剂被人体吸收后，长期食用会对人体产生蓄积危害。GB 2760-2014规定经表面处理的新鲜蔬菜中2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的的最大使用量0.01g/kg，最高残留限量≤2.0mg/kg。国家食品药品监督管理总局发布的食药监食监三便函[2014]73号文件提供了一种气相色谱质谱联用法(GC-MS)，检测豆芽中4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)6种植物生长调节剂，并且要求测定低限(LOQ)为0.03mg/kg。美国规定了果蔬类蔬菜中2,4-D的残留限量为0.1mg/kg。实验过程中发现豆芽基质干扰较大，尤其是吲哚乙酸(IAA)和吲哚丁酸(IBA)，回收率低，GC-MS法无法准确定量。因此迫切需要建立一个准确、可靠的气相色谱-串联质谱/质谱(GC-MS/MS)测定方法。

国内外关于豆芽中相关药物残留的检测方法报道较少。目前，植物生长调节剂的检测方法主要有气相色谱法(GC)，气相色谱-质谱法(GC-MS)，气相色谱串联质谱/质谱法(GC-MS/MS)，高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱/质谱法(LC-MS/MS)。

常宇文报道了一种利用凝胶渗透色谱-气相色谱法测定豆芽中2,4-二氯苯氧乙酸残留量的方法。石金娥采用GC-MS法检测了豆芽中4-氯苯氧乙酸、萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2,4-D-乙酯、2,4-D-丁酯、吲哚乙酸、吲哚丁酸7种植物生长调节剂的残留量。吴平谷利用气相色谱质谱(GC-MS)法测定了豆芽中2,4-D-乙酯、2,4-D-丁酯、4-氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、β-萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、多效唑、激动素、6-苄基腺嘌呤10种植物生长调节剂的残留量。李殷利用气相色谱串联质谱法测定了豆芽中4-氯苯氧乙酸和2,4-二氯苯氧乙酸2种植物生长调节剂的残留量。柴勇利用高效液相色谱法测定了豆芽中赤霉素、激动素、6-苄氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸4种激素的残留量，方法的测定低限＜0.5mg/kg。刘春生利用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)法检测了豆芽中咪鲜胺、头孢氨苄、诺氟沙星、6-苄氨基嘌呤、赤霉酸、2，4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸7种药物的残留量。刘印平利用气相色谱质谱(GC-MS)法测定了豆芽中4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2,4-二氯苯氧乙酸丁酯、吲哚丁酸、β-萘乙酸6种植物生长调节剂的残留量。

发明内容

为了解决现有豆芽中植物生长调节剂残留检测的难题，本发明的目的是提供一种气相色谱串联质谱/质谱法测定豆芽中4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)残留量的方法，该方法准确、快速、高效，测定低限均为15μg/kg，回收率和精密度均符合残留分析要求，并且完全满足国内外有关法规对豆芽中植物生长调节剂残留的要求，可为进出口豆芽植物生长调节剂残留的监管提供技术支持。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

气相色谱串联质谱/质谱法同时测定豆芽中6种植物生长调节剂残留的方法，6种植物生长调节剂为4-氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸、2,4-D-丁酯和吲哚丁酸，该方法包括以下步骤：

1)样品处理：

①样品提取

分别称取两份豆芽试样各10.0g(精确至0.01g)于两个50mL离心管中(一份用于测定4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)，另一份用于测定2,4-二氯苯氧乙酸丁酯)，分别加入40μL加酸，再加入20mL乙腈，3.0g氯化钠，涡旋混匀，4000rpm离心5min后，取10mL上层乙腈，用旋转蒸发仪浓缩至近干，分别都用甲醇复溶。

②衍生

向第一份复溶液加入1mL三氟化硼甲醇衍生溶液，涡旋混匀，40℃加热衍生10min，取出冷却后待净化用；

③净化

将衍生液和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯的复溶液合并后转移至离心管中，加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液和2.0mL纯水，涡旋混匀，4000rpm离心机离心5min，取出上层有机相，向下层水相再加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液重复萃取一遍，合并两次萃取液，40℃水浴下氮吹至1.0mL以下，再用乙酸乙酯-正己烷混合溶液定容至1.0mL，过膜后转移至进样瓶中供GC-MS/MS分析测定。

2)测定：采用气相色谱串联质谱/质谱法，其中：

液相色谱条件为：

a)色谱柱为HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm；

b)进样口温度：220℃；

c)程序升温：80℃保温1.0min，10℃/min升温至230℃，保温4min，30℃/min升温至320℃保温3min；

d)载气：氦气，纯度≥99.999％，流速：1.0mL/min；

e)进样方式：不分流进样；

f)进样量：2μL；

质谱条件为：

a)电离模式：电子轰击源(EI)；

b)电离能量：70eV；

c)离子源温度：230℃；

d)接口温度：280℃；

e)离子检测模式：多反应监测模式(MRM)；

所述的多反应监测条件如下：

其中，带“*”的为定量离子，其余为定性离子；

(3)标准曲线的制作

纯溶剂标准溶液：移取0.25mL 4-氯苯氧乙酸、2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸的混合工作溶液于10mL玻璃离心管中，再加入1.0mL三氟化硼甲醇溶液，涡旋混匀，40℃加热衍生10min，取出冷却后加入0.25mL2,4-D-丁酯工作溶液，然后按照步骤③进行净化，制备成含量为50ng/mL、75ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、500ng/mL的标准溶液；

基质匹配标准溶液：准确吸取适量空白样品基质，氮吹干，分别加入等量的混合标准工作液，混匀后，配成系列基质匹配的标准工作溶液，现配现用；

(4)空白试验

不加试样，在步骤1)和步骤2)相同实验条件下进行试验；

(5)结果计算和表述

按公式以下公式计算试样中各个植物生长调节剂含量：

式中：

X—试样中各个植物生长调节剂的含量，单位为微克每千克；

C—由标准工作曲线得到样液中各个植物生长调节剂的浓度，单位为纳克每毫升；

V—样液最终定容体积，单位为毫升；

m—最终样液所代表的试样质量，单位为克。

本发明的测定方法采用气相色谱串联质谱/质谱法同时测定豆芽中6种植物生长调节剂，方法简便、快速、准确、可靠，测定低限、回收率和精密度均符合要求。

本发明的测定方法具有以下技术效果：

1)首次开发了气相色谱串联质谱/质谱法同时测定豆芽中6种植物生长调节剂残留的方法，填补了技术空白；

2)提供了气相色谱串联质谱/质谱法同时测定豆芽中6种植物生长调节剂残留的最优条件。

附图说明

图1为空白豆芽样品的选择性离子流图。

图2为4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)混合标准溶液的选择性离子流图。

图3为空白豆芽样品添加4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)混合标准溶液(15μg/kg)的选择性离子流图。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明

1试剂和材料

1.1正己烷：色谱纯。

1.2甲醇：色谱纯。

1.3甲酸：色谱纯。

1.4三氟化硼甲醇溶液：优级纯。

1.5乙腈：色谱纯

1.6乙酸乙酯：色谱纯

1.7氯化钠：分析纯

1.8 50mL聚丙烯具塞塑料离心管、10mL聚丙烯具塞塑料离心管、250mL具塞锥形瓶、100mL浓缩瓶、10mL玻璃离心管等器皿、一次性无菌注射器，0.22μm过滤膜，1.0mL、2.0mL、5.0mL带刻度玻璃移液管等。

1.9乙酸乙酯-正己烷混合液：吸取体积为2mL的乙酸乙酯和8mL的正己烷配成体积比为1:4的乙酸乙酯-正己烷混合液。

1.2.10标准品：信息见表1

表1标准品信息

1.2.11标准溶液及试剂配制

植物生长调节剂(6种)储备液1.0mg/mL：分别称取0.01g(精确至0.1mg)上述植物生长调节剂标准品，用甲醇分别溶解定容至10mL，4℃保存。分别准确量取适量的4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸5种标准储备液，混合，用甲醇稀释配制成100.0μg/mL和10.0μg/mL的5种混合标准溶液，2,4-D-丁酯标准溶液按照此法单独配制成100.0μg/mL和10.0μg/mL标准溶液，4℃保存。

标准工作溶液：准确吸取一定量的5种混合标准溶液，用甲醇稀释至200ng/mL、300ng/mL、600ng/mL、1200ng/mL、2000ng/mL的标准工作溶液，2,4-D-丁酯标准溶液按照此法单独配制成200ng/mL、300ng/mL、600ng/mL、1200ng/mL、2000ng/mL，4℃保存。

2、仪器和设备

2.1 Agilent 7890A/5975C气相色谱-串联质谱联用仪，配有电子轰击离子源(EI)

2.2色谱柱：Agilent HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)

2.3 MS2MiniShaker涡旋混合仪；

2.4离心机：飞鸽牌TDL80-2B，不低于4000rpm

2.5分析天平；金诺牌TD3102。

2.6分析天平；Mettler AE260。

2.7 Buchi R215旋转蒸发仪；

2.8氮吹仪

3、测定步骤

3.1样品前处理

3.1.1样品提取

分别称取两份豆芽试样各10.0g(精确至0.01g)于两个50mL离心管中(一份用于测定4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)，另一份用于测定2,4-二氯苯氧乙酸丁酯)，分别加入40μL加酸，再加入20mL乙腈，3.0g氯化钠，涡旋混匀，4000rpm离心5min后，取10mL上层乙腈，用旋转蒸发仪浓缩至近干，分别都用甲醇复溶。

3.1.2衍生

向第一份复溶液加入1mL三氟化硼甲醇衍生溶液，涡旋混匀，40℃加热衍生10min，取出冷却后待净化用；

3.1.3净化

将衍生液和2,4-D-丁酯的复溶液合并后转移至离心管中，加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液和2.0mL纯水，涡旋混匀，4000rpm离心机离心5min，取出上层有机相，向下层水相再加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液重复萃取一遍，合并两次萃取液，40℃水浴下氮吹至1.0mL以下，再用乙酸乙酯-正己烷混合溶液定容至1.0mL，过膜后转移至进样瓶中供

GC-MS/MS分析测定。

3.2测定

3.2.1气相相色谱串联质谱/质谱条件

由于测试条件取决于所使用的仪器，因此不可能给出色谱分析的普遍参数。采用下列操作条件已被证明对测试是合适的。

(1)气相色谱条件

A)色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；

B)进样口温度：220℃；

C)程序升温：80℃(1.0min)10℃/min230℃(4min)30℃/min320℃(3min)；

D)载气：氦气，纯度≥99.999％，流速1.0mL/min；

E)进样方式：不分流进样；

F)进样量：2μL。

(2)质谱条件

A)电离模式：电子轰击源(EI)，能量为70eV；

B)离子源温度：230℃；

C)接口温度：280℃；

D)离子检测模式：多反应监测模式(MRM)；

E)碰撞气：高纯氮气；

F)监测离子对及碰撞能量见表2

表2多反应监测条件

其中，带“*”的为定量离子，其余为定性离子。

3.2.2标准工作曲线的制作

纯溶剂标准溶液：移取0.25mL 4-氯苯氧乙酸、2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸的混合工作溶液于10mL玻璃离心管中，再加入1.0mL三氟化硼甲醇溶液，涡旋混匀，40℃加热衍生10min，取出冷却后加入0.25mL2,4-D-丁酯工作溶液，然后按照3.1.3步骤进行净化，制备成含量为50ng/mL、75ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、500ng/mL的标准溶液。(相当于样品中添加10.0、15.0、30.0、60.0、100.0μg/kg 6种植物生长调节剂混合标准溶液)

基质匹配标准溶液：准确吸取适量空白样品基质，氮吹干，分别加入等量的混合标准工作液，混匀后，配成系列基质匹配的标准工作溶液，现配现用。

3.2.3空白试验

除不加试样外，均按上述步骤进行。

4、结果计算和表述

按公式(1)计算试样中各个植物生长调节剂含量：

式中：

X—试样中各个植物生长调节剂的含量，单位为微克每千克；

C—由标准工作曲线得到样液中各个植物生长调节剂的浓度，单位为纳克每毫升；

V—样液最终定容体积，单位为毫升；

m—最终样液所代表的试样质量，单位为克。

5、方法测定低限

本发明方法对于豆芽中4-氯苯氧乙酸、2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸等6种植物生长调节剂的测定低限均为15μg/kg。

6、方法的回收率和精密度

本方法回收率实验设定了三个添加浓度，按本方法所确定的实验条件，对每个添加浓度进行6次实验，回收率及精密度结果见表3。

表3豆芽中6种植物生长调节剂同时测定方法的添加回收实验

7、结论

综合上述情况，本发明方法的回收率、测定低限和精密度等各项技术指标均符合要求，方法应用于豆芽中6种植物生长调节剂同时检测，重现性良好。本发明建立的检验方法操作简便、结果准确。