一种娄德酵母及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种娄德酵母，同时涉及该娄德酵母菌种在产阿拉伯糖醇中的用途。

背景技术

酱香型白酒生产中，酵母从功能上主要分为两大类。一类是产酒酵母；另一类是产脂酵母。研究表明，酵母除了具有产酒和产香的作用外，一部分酵母还具有产多元醇类物质的作用，如：阿拉伯糖醇、丙三醇、木糖醇、麦芽糖醇等，以增加白酒的醇甜味，提升白酒的品质。

随着人们消费口味的转变，大众从重香型转为香气及口味并重，因此，对白酒中呈味物质的研究显得尤为重要。甜味是一种让人感觉比较愉悦的口感，尤其在酒精度较高的白酒中，微甜味能使酒体显得绵柔醇厚。多元醇是大曲中的酵母菌在生成酒精的同时发酵糖所产生的，由于糖不能进入白酒中，因此，多元醇是形成白酒中甜味的主要来源。通过对大曲中酵母产多元醇情况的研究发现：阿拉伯糖醇的产量最高。阿拉伯糖醇作为糖醇的一员,鉴于其热值低、抗龋齿、以及在人体内代谢不影响胰岛素水平的特性，可作为高档甜味剂广泛添加于保健食品中，此外，阿拉伯糖醇还可以用于改善酒精饮料的品质。

目前用于产阿拉伯糖醇的菌株主要为曲霉菌属、德巴利氏酵母属、汉逊酵母属等等，而娄德酵母产阿拉伯糖醇类物质的研究较少，没有相关的文章或专利。

发明内容

本发明的目的在于提供一株产阿拉伯糖醇的娄德酵母。

本发明的另一目的在于提供该娄德酵母在产阿拉伯糖醇中的用途。

本发明的一种娄德酵母，其形态特征：将菌种划线接种于PDA培养基上，28℃培养2d，菌落直径5～7mm，菌落圆形微隆中凹，颜色乳白色，质地呈蜡质，不透明，菌落边缘光滑。

该菌种已2016年6月13 日保藏到中国典型培养物保藏中心（地址：中国 武汉 武汉大学），保藏号：CCTCC NO：M 2016322，名称：娄德酵母FBKL2.0073(Lodderomyces>elongisporus>

本发明的一种FBKL2.0073(Lodderomyces> strain FBKL2.0073)的分离，包括以下步骤：

（一）对娄德酵母(Lodderomyces>)的分离：

从贵州茅台酒股份有限公司酱香型白酒大曲中，取粉碎的大曲样品10g,加入装有90ml无菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶中，28℃摇床振荡30 min，混匀。在超净工作台中吸取1 mL菌悬液注入装有9 mL无菌生理盐水的试管中，进行梯度稀释，取 10^-1，,10^-2，10^-3、10^-4,10^-5梯度分别进行倾注和涂布平板。28>

（二）培养基：

鉴定培养基：孟加拉红培养基，蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g，琼脂20g，氯霉素0.1g，1/3000孟加拉红溶液100mL，蒸馏水1000mL。

保藏培养基：麦芽汁琼脂培养基，麦芽膏粉130g/L,氯霉素0.1g/L,琼脂15/L,PH5.8—6.2。

种子培养基：葡萄糖1g，酵母膏0.5g，蛋白胨1g, 蒸馏水50mL ,121℃灭菌20min。

液态发酵培养基：葡萄糖10g，酵母膏0.5g，蛋白胨1g, 蒸馏水50mL,115℃灭菌20min。

（三）菌种的保种和传代：

1.菌种保藏培养基：

（1）麦芽汁琼脂培养基：麦芽膏粉130g/L,氯霉素0.1g/L,琼脂15g/L,PH5.8—6.2，115℃灭菌20min。

（2）YEPD（YPD）培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g,蒸馏水1000ml，pH6.0,115℃灭菌20min。

2.保存方法有4种：

（1）传代培养酵母菌种保存法：将酵母接种于麦芽汁琼脂斜面培养基上，置温箱28℃培养2d后，将橡胶塞用灭菌固体石蜡熔封，移至4℃冰箱保存，一般酵母在4℃冰箱内可以保存一个月,需定期移植。

（2）砂土管酵母菌种保存法：取清洁的海沙，用1mol/L的氢氧化钠溶液清洗，然后再用1mol/L的盐酸溶液清洗，在后用流水冲洗。分装试管，约2-3厘米深，干热灭菌，加入酵母培养液1mL左右与砂土混匀，置真空干燥管内干燥，待完全干燥后熔封保存。

（3）真空冷冻干燥酵母菌种保存法：将待保存的微生物细胞或者孢子悬浮在合适的保护剂中，预先将细胞冷冻，使水冻结，然后在真空条件下，使冰升华以除去大部分水，残留的一些不冻结的水分，再通过蒸发从细胞中除去。

（4）液体石蜡法：亦称矿物油保藏法，将酵母菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法，是定期移植保藏法的辅助方法。

（四）菌种的生态特征：

该菌形成的菌落在PDA培养基上，28℃培养2d，菌落直径5～7mm，菌落圆形微隆中凹，颜色乳白色，质地呈蜡质，不透明，菌落边缘光滑。菌落易挑起。细胞为卵圆形，细胞2.52～5.74μm，长2.84～6.80μm，能产子囊孢子。

（五）菌种的培养特性

（1）培养温度20℃～30℃，最适温度28℃～30℃；

（2）培养pH 3～7.5，最佳范围为4.5～5.0。

细胞为卵圆形，细胞2.52～5.74μm，长2.84～6.80μm，产子囊孢子，芽殖，根据《酵母菌的特征及鉴定手册》，从样品中经筛菌、分离、纯化、镜检、生理生化以及采用16SrDNA测序，将测得序列在DNAMAN软件中进行序列反转，在NCBI中进行BLAST比对，再用MEGA5软件建立所分离菌株的系统发育树，确定所分离的菌株为娄德酵母(Lodderomyces elongisporus>strain)，并将其命名为娄德酵母>Lodderomyces>FBKL2.0073)。

本发明的一种娄德酵母在产阿拉伯糖醇中的用途。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明的娄德酵母FBKL2.0073对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，容易培养和保存及工业化生产，生产成本低，不污染环境，不破坏生态平衡。

附图说明

图 1 发酵液中产阿拉伯糖醇的 TLC 结果图。

具体实施方式

一种娄德酵母FBKL2.0073(Lodderomyces> FBKL2.0073)的分离方法，包括以下步骤：

a、菌种的分离：从贵州茅台酒股份有限公司的酒曲中, 称取10g大曲样品放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,振荡约30min。取1ml样品悬液进行10倍梯度稀释分别由10^-4、10^-5、10^-6和10^-7稀释度的样品悬液中各取0.2ml涂布于分离培养基上,28℃静止培养2d,>

b、菌种的保种和传代：

1.菌种保藏培养基：

（1）麦芽汁琼脂培养基：麦芽膏粉130g/L,氯霉素0.1g/L,琼脂15g/L,PH5.8—6.2，115℃灭菌20min。

（2）YEPD（YPD）培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g,蒸馏水1000ml，pH6.0,115℃灭菌20min。

2.保存方法：

（1）传代培养酵母菌种保存法：将酵母接种于麦芽汁琼脂斜面培养基上，置温箱28℃培养2d后，将橡胶塞用灭菌固体石蜡熔封，移至4℃冰箱保存，一般酵母在4℃冰箱内可以保存一个月,需定期移植。

（2）砂土管酵母菌种保存法：取清洁的海沙，用1mol/L的氢氧化钠溶液清洗，然后再用1mol/L的盐酸溶液清洗，在后用流水冲洗。分装试管，约2-3厘米深，干热灭菌，加入酵母培养液1mL左右与砂土混匀，置真空干燥管内干燥，待完全干燥后熔封保存。

（3）真空冷冻干燥酵母菌种保存法：将待保存的微生物细胞或者孢子悬浮在合适的保护剂中，预先将细胞冷冻，使水冻结，然后在真空条件下，使冰升华以除去大部分水，残留的一些不冻结的水分，再通过蒸发从细胞中除去。

（4）液体石蜡法：亦称矿物油保藏法，将酵母菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法，是定期移植保藏法的辅助方法。

试验例1：产多元醇能力测定

（1）活化菌种：将筛选出的酵母先活化，28 ℃培养48h。

（2）种子培养：将活化好的菌株挑一环分别接入含有50ml种子培养基的250 mL 三角瓶中，28℃，160 r/min，摇瓶培养24 h。

（3）发酵液制备：将上种子培养液按5%的接种比例接入含有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28 ℃，160 r/min，摇瓶培养5 d，4℃储存备用。

（4）产多元醇分析：通过薄层层析法对发酵液中的多元醇产物进行初步定性和粗定量检测。依据发酵液中产物斑点的比移值(Rf)与阿拉伯糖醇标准品比移值(Rf)之间的关系来对发酵液中产物进行定性，并依据发酵液斑点的大小和颜色深浅来对酵母多元醇产物进行定量分析。取发酵液1 mL，10 000r / min离心 10 min，用毛细吸管将上清点样于微晶纤维素板上，放入配比为: 正丁醇:冰乙酸:水＝5:1:2（V/V）的展开剂中层析4h,层析图谱的显色采用饱和硝酸银丙酮溶液(A)-氢氧化钠酒精溶液(B)。 展层后将板取出，自然干燥，先将溶液A喷于层析纸上，干燥后再喷溶液B于层析滤纸，待形成黑色或棕色显色点后，再用6mol/L的氨水溶解多余的硝酸银，然后在流水下冲洗 2min，吹干后即得到清晰的层析谱图（见图 1) ，从图中可以看出。

表1多元醇标品薄层层析比移值

阿拉伯糖醇标品和发酵液样品的显色点在同一水平线上，并计算两者比移值（Rf）均为0.409，因而认定二者为同一物质，即发酵液含有阿拉伯糖醇，说明这株娄德酵母(Lodderomyces elongisporus)具有产阿拉伯糖醇的能力。由表1 可以明显看到，标品阿拉伯糖醇的迁移率 Ｒf值和发酵液样品的迁移率一致。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。