一种血必净注射液中五类化合物的检测方法

技术领域

本发明属于药物成分的分析技术领域，涉及一种血必净注射液中五类化合物的检测方法，具体涉及一种血必净注射液中红花黄酮类化合物、赤芍单萜糖苷类化合物、丹参儿茶酚类化合物、川芎和当归苯酞类化合物以及其它化合物共47个化合物的检测方法。

背景技术

脓毒症是由感染引起的宿主失调性反应导致的致命性器官功能障碍(SOFA评分≥2)的危重疾病。然而，目前脓毒症的治疗药物仍然非常有限，新药研发成功率低。血必净注射液是由天津红日药业股份有限公司研制生产的抗脓毒症中成药，2004年获中国FDA批准上市。该中药制剂由红花、赤芍、丹参、川芎和当归五味中药所组复方，经提取制备而成，具有活血化瘀、疏通经络、溃散毒邪的功效。作为脓毒症常规治疗中的加载药物，血必净注射液在临床上被大量使用，与抗生素(抗感染)等化药形成药效互补，是中国抗脓毒症用药特色之一。

信息学研究结果提示有四类来自血必净注射液组成中药的成分可能具有与血必净注射液抗脓毒症疗效相关的药效活性，包括：第一类成分是红花黄酮类成分(具有抗炎、抗氧化、抗凝血和保护神经细胞等药效活性)；第二类成分是赤芍单萜糖苷类成分(具有抗炎、抗氧化、抗凝血和保护神经细胞等药效活性)；第三类成分是丹参儿茶酚类成分(具有抗炎、抗氧化、保护内皮细胞和心肌细胞等药效活性)；第四类成分是川芎和当归苯酞类成分(具有抗炎、抗氧化、扩张血管、保护神经细胞等药效活性)。除此以外的血必净注射液中其它化学成分划归为第五类成分，这些成分也可能与血必净注射液的疗效相关。血必净注射液产品的质量均一性对血必净注射液临床用药的有效性和安全性进行系统再评价至关重要，而目前血必净注射液的厂方质控标准的化合物仅为芍药苷(1.0–1.7mg/mL)和羟基红花黄色素A(0.2–0.5mg/mL)(见Cheng C,Lin J-Z,Li L,Yang J-L,Jia W-W,Huang Y-H,Du F-F,Wang F-Q,Li M-J,Li Y-F,Xu F,Zhang N-T,Olaleye E.Olajide,Sun Y,Li J,Sun C-H,Zhang G-P,and Li C(2016)Pharmacokinetics and disposition of monoterpene glycosides derived from Paeonia lactiflora roots(Chishao)after intravenous dosing of antiseptic XueBiJing injection in human subjects and rats.Acta Pharmacol Sin 37:530–544.)，这两个成分仅来自于赤芍和红花，因此对于血必净注射液的质量均一性的评价是远远不够的。

目前，现有文献报道对血必净注射液中的某些成分建立了检测方法，但这些方法存在以下不足：(1)血必净注射液中一些含量相对较高、可能具有与血必净注射液疗效相关的化合物并未列入一同检测目标对象，例如：芍药内酯苷、阿魏酸等；(2)基于本研究团队前期的人体药代动力学研究结果，血必净注射液中某些化学成分在制剂中含量不高，但在人体内暴露水平(体内药物浓度)相对较高，例如：洋川芎内酯G虽然在注射液中含量不及洋川芎内酯I，但是洋川芎内酯G是静注给药血必净注射液后人体内暴露最显著的川芎当归苯酞类成分，因此这个化合物对血必净注射液临床有效性和临床用药的安全性评估也是不容忽视的。可见，有必要建立能够全面分析血必净注射液中各类化学成分含量的分析方法，对于提高制剂加工生产中的质控水平、临床合理用药均具有积极意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种血必净注射液中五类化合物的检测方法，用于解决现有技术中缺乏全面地检测血必净注射液中的化学成分的方法的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种血必净注射液中五类化合物的检测方法，包括以下步骤：

1)将血必净注射液采用有机溶剂稀释后，制备待测液；

2)分别配制标准溶液A、标准溶液B和标准溶液C，所述标准溶液A为血必净注射液中第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分标准品的溶液，所述标准溶液B为血必净注射液中第三类化合物中任意一种或多种成分标准品的溶液，所述标准溶液C为血必净注射液中第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分标准品的溶液；

3)将步骤1)中获得的待测液和步骤2)中配制的标准溶液A，采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)同时测定第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分的含量；

4)将步骤1)中获得的待测液和步骤2)中配制的标准溶液B，采用超高效液相-高分辨质谱联用分析系统(UPLC/Q-TOF MS)同时测定第三类化合物中任意一种或多种成分的含量；

5)将步骤1)中获得的待测液和步骤2)中配制的标准溶液C，采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)同时测定第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分的含量。

优选地，所述第一类化合物为7种红花黄酮类化合物成分，包括有山奈酚-3-O-葡萄糖苷(CAS号为480-10-4)、野黄芩苷(CAS号为27740-01-8)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(CAS号为21637-25-2)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(CAS号为17650-84-9)、山奈酚-3-O-槐糖苷(CAS号为19895-95-5)、槲皮素-3-O-芸香糖苷(CAS号为153-18-4)、羟基红花黄色素A(CAS号为78281-02-4)。

优选地，所述第二类化合物为8种赤芍单萜糖苷类化合物成分，包括有芍药内酯苷(CAS号为39011-90-0)、芍药苷(CAS号为23180-57-6)、氧化芍药苷(CAS号为39011-91-1)、苯甲酰芍药苷(CAS号为38642-49-8)、牡丹皮苷C(CAS号为172760-03-1)、苯甲酰氧化芍药苷(CAS号为72896-40-3)、牡丹皮苷J(CAS号为262350-52-7)、没食子酰芍药苷(CAS号为122965-41-7)。

优选地，所述第三类化合物为9种丹参儿茶酚类化合物成分，包括有原儿茶醛(CAS号为139-85-5)、原儿茶酸(CAS号为99-50-3)、丹参素(CAS号为76822-21-4)、迷迭香酸(CAS号为20283-92-5)、丹酚酸D(CAS号为142998-47-8)、丹酚酸C(CAS号为115841-09-3)、丹酚酸A(CAS号为96574-01-5)、紫草酸(CAS号为28831-65-4)、丹酚酸B(CAS号为115939-25-8)。

优选地，所述第四类化合物为7种川芎和当归苯酞类化合物成分，包括有洋川芎内酯A(CAS号为62006-39-7)、3-羟基-3-丁基苯酞(自制)、洋川芎内酯G(CAS号为94530-85-5)、洋川芎内酯I(CAS号为94596-28-8)、洋川芎内酯H(CAS号为94596-27-7)、洋川芎内酯N(自制)、开环洋川芎内酯I(自制)。

更优选地，所述3-羟基-3-丁基苯酞的化学结构式为：

更优选地，所述洋川芎内酯N的化学结构式为：

更优选地，所述开环洋川芎内酯I的化学结构式为：

优选地，所述第五类化合物为16种其它类化合物成分，包括有尿嘧啶(CAS号为66-22-8)、丁二酸(CAS号为110-15-6)、苯甲酸(CAS号为65-85-0)、腺嘌呤(CAS号为73-24-5)、对羟基苯甲酸(CAS号为99-96-7)、对香豆酸(CAS号为501-98-4)、苯丙氨酸(CAS号为150-30-1)、没食子酸(CAS号为149-91-7)、咖啡酸(CAS号为331-39-5)、阿魏酸(CAS号为1135-24-6)、没食子酰乙酯(CAS号为831-61-8)、尿苷(CAS号为58-96-8)、腺苷(CAS号为58-61-7)、鸟苷(CAS号为118-00-3)、儿茶素(CAS号为154-23-4)、绿原酸(CAS号为327-97-9)。

优选地，步骤1)中，所述有机溶剂为体积百分比为5-15％的甲醇水溶液。更优选地，所述有机溶剂为体积百分比为10％的甲醇水溶液。

优选地，步骤1)中，所述血必净注射液与有机溶剂的体积比为1：1-10000。更优选地，所述血必净注射液与有机溶剂的体积比为1：10-1000。

优选地，步骤2)中，所述标准溶液A、标准溶液B和标准溶液C分别采用有机溶剂稀释后定容，配制而成。

更优选地，所述有机溶剂为体积百分比为5-15％的甲醇水溶液。进一步优选地，所述有机溶剂为体积百分比为10％的甲醇水溶液。

优选地，步骤2)中，所述标准溶液中各成分的浓度范围为12.3-9000nM。所述nM为nmol/l。

优选地，步骤3)中，所述采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)同时测定第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分的含量，包括以下步骤：

A1)采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的超高效液相色谱(UPLC)，对待测液和标准溶液A中第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分进行分离；

A2)采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的三重四极杆质谱(MS/MS)，确定待测液和标准溶液A中第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分，采用外标法同时对待测液中的第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分的含量进行定量检测。

更优选地，步骤A1)中，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：T3柱；柱温：30-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：4-6μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含20-30mM甲酸)，B相为甲醇(含20-30mM甲酸)；分析时间：13min；梯度洗脱。

进一步优选地，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：Waters AcquityHSS T3柱(100mm×2.1mm ID，1.8μM)；柱温：40℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相：水-甲醇溶液(含25mM甲酸)，其中，A相为水(含25mM甲酸)，B相为甲醇(含25mM甲酸)；分析时间：13min；梯度洗脱。

进一步优选地，所述梯度洗脱程序的具体为(见表1)：

0-8.0min，A相：B相体积比为98：2-30：70；

8.0-11.0min，A相：B相体积比为30：70-2：98；

11.0-13.0min，A相：B相体积比为2：98-98：2。

表1

表1的Curve一栏中数值含义如下(参见图1)：当溶剂B相洗脱比例从t₁时的B1增加到t₂时的B2时，若Curve设为1，表示t₁时B1瞬间增加到B2，再维持至t₂；若Curve设为11，B1将维持至t₂再瞬间增加到B2；若Curve设为6，B1则匀速增加到B2。

更优选地，步骤A2)中，所述三重四极杆质谱(MS/MS)的测定条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI^-)；工作模式：选择反应监测(SRM)；测定参数的数值见表2。所述测定参数包括有保留时间(t_R)、Q1扫描范围、Q3扫描范围、扫描时间、负离子模式优化去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)。

表2测定参数的数值表

进一步优选地，所述测定参数中保留时间(t_R)、Q1扫描范围、Q3扫描范围、扫描时间的数值见表3。

表3

优选地，步骤4)中，所述采用超高效液相-高分辨质谱联用分析系统(UPLC/Q-TOF MS)同时测定第三类化合物中任意一种或多种成分的含量，包括以下步骤：

B1)采用超高效液相-高分辨质谱联用分析系统(UPLC/Q-TOF MS)中的超高效液相色谱(UPLC)对待测液和标准溶液B中第三类化合物中任意一种或多种成分进行分离；

B2)采用超高效液相-高分辨质谱联用分析系统(UPLC/Q-TOF MS)中的高分辨质谱(Q-TOF MS)，确定待测液和标准溶液B中第三类化合物中任意一种或多种成分，采用外标法同时对待测液中的第三类化合物中任意一种或多种成分的含量进行定量检测。

更优选地，步骤B1)中，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：T3柱；柱温：30-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：4-6μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含20-30mM甲酸)，B相为甲醇(含20-30mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。

进一步优选地，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(100mm×2.1mm ID，1.8μM)；柱温：40℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相：水-甲醇溶液(含25mM甲酸)，其中，A相为水(含25mM甲酸)，B相为甲醇(含25mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。

进一步优选地，所述梯度洗脱程序的具体为(见表4)：

0-1.0min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

1.0-15.0min，A相：B相体积比为98：2-30：70；

15.0-17.0min，A相：B相体积比为30：70-2：98；

17.0-20.0min，A相：B相体积比为2：98-98：2。

表4

更优选地，步骤B2)中，所述高分辨质谱(Q-TOF MS)为电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱。

更优选地，步骤B2)中，所述高分辨质谱(Q-TOF MS)的测定条件为(见表5-6)：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI^-)；毛细管电压(Capillary>–峰采集范围：50-1200Da；保留时间(t_R)、[M-H]^–峰提取值见表6。

表5

表6

进一步优选地，所述保留时间(t_R)、[M-H]^–峰提取值见表7。

表7

优选地，步骤5)中，所述采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)同时测定第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分的含量，包括以下步骤：

C1)采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的超高效液相色谱(UPLC)，对待测液和标准溶液C中第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分进行分离；

C2)采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的三重四极杆质谱(MS/MS)，确定待测液和标准溶液C中第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分，采用外标法同时对待测液中的第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分的含量进行定量检测。

更优选地，步骤C1)中，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：T3柱；柱温：30-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：4-6μl；流动相：甲醇-水溶液(含甲酸、醋酸锂)，其中，A相为甲醇-水溶液(体积比v/v：0.5：99.5-1.5：98.5，含0.5-1.5mM甲酸、20-30μM醋酸锂)，B相为甲醇-水溶液(体积比v/v：0.5：99.5-1.5：98.5，含0.5-1.5mM甲酸、20-30μM醋酸锂)；分析时间：8min；梯度洗脱。

进一步优选地，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：Waters AcquityHSS T3柱(100mm×2.1mm ID，1.8μM)；柱温：40℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相：甲醇-水溶液(含甲酸、醋酸锂)，其中，A相为甲醇-水溶液(体积比v/v：1：99，含1.0mM甲酸、25μM醋酸锂)，B相为甲醇-水溶液(体积比v/v：1：99，含1.0mM甲酸、25μM醋酸锂)；分析时间：8min；梯度洗脱。

进一步优选地，所述梯度洗脱程序的具体为(见表8)：

0-7.0min，A相：B相体积比为94：6-5：95；

7.0-8.0min，A相：B相体积比为5：95-94：6。

表8

更优选地，步骤C2)中，所述三重四极杆质谱(MS/MS)的测定条件为：离子源：ESI源；检测模式：正离子电喷雾电离模式(ESI⁺)；工作模式：选择反应监测(SRM)；测定参数的数值见表9。所述测定参数包括有保留时间(t_R)、Q1扫描范围、Q3扫描范围、扫描时间、负离子模式优化去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)。

表9

进一步优选地，所述测定参数中保留时间(t_R)、Q1扫描范围、Q3扫描范围、扫描时间的数值见表10。

表10

上述外标法是指，利用检测到的标准溶液中血必净注射液中五类化合物成分的标准品含量与其色谱峰面积的线性关系，得到相应线性回归方程，从而由已知含量的标准溶液计算待测液中被测物的含量，进行定量检测。

如上所述，本发明提供的一种血必净注射液中五类化合物的检测方法，针对目前报道的血必净注射液化学成分检测化合物数目较少的现状，能够同时检测血必净注射液中47种五类化合物，包括7种红花黄酮类化合物、8种赤芍单萜糖苷类化合物、9种丹参儿茶酚类化合物、7种川芎和当归苯酞类化合物以及16种其它化合物。本发明所建检测方法更全面地反映血必净注射液的质量均一性，比目前已有的血必净注射液分析方法有更强的分析能力，能够更全面地检测血必净注射液中的化学成分，有效提高血必净注射液的质控水平，也有助于合理选择用药批次用于血必净注射液临床有效性和安全性再评价。

附图说明

图1显示为本发明的超高效液相色谱中Curve数值设定曲线图。

图2显示为本发明的血必净注射液中第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物的液相色谱图，其中，1：山柰酚-3-O-葡萄糖苷；2：野黄芩苷；3：槲皮素-3-O-葡萄糖苷；4：山柰酚-3-O-芸香糖苷；5：山柰酚-3-O-槐糖苷；6：槲皮素-3-O-芸香糖苷；7：羟基红花黄色素A；8：芍药内酯苷；9：芍药苷；10：氧化芍药苷；11：苯甲酰芍药苷；12：牡丹皮苷C；13：苯甲酰氧化芍药苷；14：牡丹皮苷J；15：没食子酰芍药苷；32：尿嘧啶；33：丁二酸；34：苯甲酸；36：对羟基苯甲酸；37：对香豆酸；38：苯丙氨酸；39：没食子酸；40：咖啡酸；41：阿魏酸；42：没食子酰乙酯；43：尿苷；45：鸟苷；46：儿茶素；47：绿原酸。

图3显示为本发明的血必净注射液中第三类化合物成分的液相色谱图，其中，16：原儿茶醛；17：原儿茶酸；18：丹参素；19：迷迭香酸；20：丹酚酸D；21：丹酚酸C；22：丹酚酸A；23：紫草酸；24：丹酚酸B。

图4显示为本发明的血必净注射液中第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分的液相色谱图，其中，25：洋川芎内酯A；26：3-羟基-3-丁基苯酞；27：洋川芎内酯G；28：洋川芎内酯I；29：洋川芎内酯H；30：洋川芎内酯N；31：开环洋川芎内酯I；35：腺嘌呤；44：腺苷。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指相对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

水(纯水，由纯水机制备)；甲醇(≥99.9％、Sigma-Aldrich公司)；47种化合物标准品(＞98％、购买自售卖中药标准品的公司或由实验室自制)；甲酸、醋酸锂(99.999％、Sigma-Aldrich公司)。血必净注射液，由天津红日药业股份有限公司提供，共9批血必净注射液，批号见下表11。

表11血必净注射液批号

2、仪器和色谱柱

超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)由Waters UPLC系统超高液相色谱仪以及AB公司生产的API 4000三重四极杆质谱组成，系统工作软件为Empower(UPLC)和Analyst 1.4.1(质谱)；超高效液相-高分辨质谱联用分析系统(UPLC/Q-TOF MS)由美国Waters公司生产的AcQuityTM UPLC系列超高液相色谱仪以及Waters公司生产的SYNAPT G2HDMS型电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱仪组成，系统工作软件为MassLynx V4.0.1(美国)；Waters AcquityHSS T3色谱柱(100mm×2.1mm ID，1.8μM)。

实施例1

1、样品前处理

移取一定量的血必净注射液，采用体积百分比为5-15％的甲醇水溶液稀释1-10000倍，制备待测液。

分别移取一定量的第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分，采用体积百分比为5-15％的甲醇水溶液稀释1-10000倍，制备标准溶液A，标准溶液A中各成分的浓度范围为12.3-9000nM。

分别移取一定量的第三类化合物中任意一种或多种成分，采用体积百分比为5-15％的甲醇水溶液稀释1-10000倍，制备标准溶液B，标准溶液B中各成分的浓度范围为12.3-9000nM。

分别移取一定量的第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分，采用体积百分比为5-15％的甲醇水溶液稀释1-10000倍，制备标准溶液C，标准溶液C中各成分的浓度范围为12.3-9000nM。

2、测定

2.1第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物的测定

采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的超高效液相色谱(UPLC)，对待测液和标准溶液A中第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分进行分离，并采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的三重四极杆质谱(MS/MS)，确定待测液和标准溶液A中第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分，采用外标法同时对待测液中的第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分的含量进行定量检测。具体测定结果见图1。

其中，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：T3柱；柱温：30-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：4-6μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含20-30mM甲酸)，B相为甲醇(含20-30mM甲酸)；分析时间：13min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：0-8.0min，A相：B相体积比为98：2-30：70；8.0-11.0min，A相：B相体积比为30：70-2：98；11.0-13.0min，A相：B相体积比为2：98-98：2。

所述三重四极杆质谱(MS/MS)的测定条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI^-)；工作模式：选择反应监测(SRM)；测定参数的数值见表2。

2.2第三类化合物的测定

采用超高效液相-高分辨质谱联用分析系统(UPLC/Q-TOF MS)中的超高效液相色谱(UPLC)对待测液和标准溶液B中第三类化合物中任意一种或多种成分进行分离，并采用超高效液相-高分辨质谱联用分析系统(UPLC/Q-TOF MS)中的高分辨质谱(Q-TOF MS)，确定待测液和标准溶液B中第三类化合物中任意一种或多种成分，采用外标法同时对待测液中的第三类化合物中任意一种或多种成分的含量进行定量检测。具体测定结果见图2。

其中，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：T3柱；柱温：30-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：4-6μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含20-30mM甲酸)，B相为甲醇(含20-30mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：0-1.0min，A相：B相体积比为98：2-98：2；1.0-15.0min，A相：B相体积比为98：2-30：70；15.0-17.0min，A相：B相体积比为30：70-2：98；17.0-20.0min，A相：B相体积比为2：98-98：2。

所述高分辨质谱(Q-TOF MS)为电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱。所述高分辨质谱(Q-TOF MS)的测定条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI^-)；毛细管电压(Capillary>–峰采集范围：50-1200Da；保留时间(t_R)、[M-H]^–峰提取值见表6。

2.3第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分的测定

采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的超高效液相色谱(UPLC)，对待测液和标准溶液C中第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分进行分离；并采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的三重四极杆质谱(MS/MS)，确定待测液和标准溶液C中第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分，采用外标法同时对待测液中的第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分的含量进行定量检测。具体测定结果见图3。

其中，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：T3柱；柱温：30-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：4-6μl；流动相：甲醇-水溶液(含甲酸、醋酸锂)，其中，A相为甲醇-水溶液(体积比v/v：0.5：99.5-1.5：98.5，含0.5-1.5mM甲酸、20-30μM醋酸锂)，B相为甲醇-水溶液(体积比v/v：0.5：99.5-1.5：98.5，含0.5-1.5mM甲酸、20-30μM醋酸锂)；分析时间：8min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：0-7.0min，A相：B相体积比为94：6-5：95；7.0-8.0min，A相：B相体积比为5：95-94：6。

所述三重四极杆质谱(MS/MS)的测定条件为：离子源：ESI源；检测模式：正离子电喷雾电离模式(ESI⁺)；工作模式：选择反应监测(SRM)；测定参数的数值见表9。

实施例2

1、样品前处理

移取一定量的血必净注射液，采用体积百分比为10％的甲醇水溶液稀释10-1000倍，制备待测液。

分别移取一定量的第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分，采用体积百分比为10％的甲醇水溶液稀释10-1000倍，制备标准溶液，标准溶液中各成分的浓度范围为12.3-9000nM。

2、测定

采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的超高效液相色谱(UPLC)，对待测液和标准溶液中第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分进行分离，并采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的三重四极杆质谱(MS/MS)，确定待测液和标准溶液中第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分，采用外标法同时对待测液中的第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中任意一种或多种成分的含量进行定量检测。

其中，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：Waters AcquityHSS T3柱(100mm×2.1mm ID，1.8μM)；柱温：40℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相：水-甲醇溶液(含25mM甲酸)，其中，A相为水(含25mM甲酸)，B相为甲醇(含25mM甲酸)；分析时间：13min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：0-8.0min，A相：B相体积比为98：2-30：70；8.0-11.0min，A相：B相体积比为30：70-2：98；11.0-13.0min，A相：B相体积比为2：98-98：2。

所述三重四极杆质谱(MS/MS)的测定条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI^-)；工作模式：选择反应监测(SRM)；测定参数中负离子模式优化去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)的数值见表2，测定参数中保留时间(t_R)、Q1扫描范围、Q3扫描范围、扫描时间的数值见表3。

3、测定方法的线性关系、检出限和定量限

配制各成分的浓度范围为12.3-9000nM的标准溶液，分别进行UPLC/MS/MS检测，以色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应血必净注射液中第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物成分的质量浓度为横坐标(X轴)，进行回归分析，得到回归方程及其相关系数，如表12所示。

由表12可知，上述回归方程的在相应浓度范围内进样时线性关系良好，相关系数r>0.99。对标准溶液中的目标物响应信号，采用最低浓度标样重复进样3次，进行UPLC/MS/MS分析。

表12工作曲线和定量下限

4、加样回收率和精密度

考察血必净注射液中含量较高的第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中成分测定方法的准确度和精密度。所考察化合物用血必净空白溶媒配制“人造血必净”，目标制剂中各成分的浓度为市售血必净注射液中该成分平均浓度的50％、100％、150％，各浓度“人造血必净”配制3份供试品。分析方法的加样回收率用“人造血必净”注射液成分实测浓度与其标示浓度之比表示，分析方法的精密度用同浓度3份“人造血必净”供试品分析结果的RSD值表示。

选取第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中含量较高的成分，按照上述方式进行配制后，进行测定，具体结果见表13。由表13可知，选取的第一类化合物、第二类化合物、除腺嘌呤和腺苷外的第五类化合物中成分的加样平均回收率在78.1-122％之间，表明本方法加样回收率良好，精密度为0.10-13.2％，表明本方法重复性良好。

表13

实施例3

1、样品前处理

移取一定量的血必净注射液，采用体积百分比为10％的甲醇水溶液稀释10-1000倍，制备待测液。

分别移取一定量的第三类化合物中任意一种或多种成分，采用体积百分比为10％的甲醇水溶液稀释10-1000倍，制备标准溶液，标准溶液中各成分的浓度范围为12.3-9000nM。

2、测定

采用超高效液相-高分辨质谱联用分析系统(UPLC/Q-TOF MS)中的超高效液相色谱(UPLC)对待测液和标准溶液中第三类化合物中任意一种或多种成分进行分离，并采用超高效液相-高分辨质谱联用分析系统(UPLC/Q-TOF MS)中的高分辨质谱(Q-TOF MS)，确定待测液和标准溶液中第三类化合物中任意一种或多种成分，采用外标法同时对待测液中的第三类化合物中任意一种或多种成分的含量进行定量检测。

其中，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：Waters AcquityHSS T3柱(100mm×2.1mm ID，1.8μM)；柱温：40℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相：水-甲醇溶液(含25mM甲酸)，其中，A相为水(含25mM甲酸)，B相为甲醇(含25mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：0-1.0min，A相：B相体积比为98：2-98：2；1.0-15.0min，A相：B相体积比为98：2-30：70；15.0-17.0min，A相：B相体积比为30：70-2：98；17.0-20.0min，A相：B相体积比为2：98-98：2。

所述高分辨质谱(Q-TOF MS)为电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱。所述高分辨质谱(Q-TOF MS)的测定条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI^-)；毛细管电压(Capillary>–峰采集范围：50-1200Da；保留时间(t_R)、[M-H]^–峰提取值见表7。

3、测定方法的线性关系、检出限和定量限

配制各成分的浓度范围为12.3-9000nM的标准溶液，分别进行UPLC/Q-TOF MS检测，以色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应血必净注射液中第三类化合物成分的质量浓度为横坐标(X轴)，进行回归分析，得到回归方程及其相关系数，如表14所示。

由表14可知，上述回归方程的在相应浓度范围内进样时线性关系良好，相关系数r>0.99。对标准溶液中的目标物响应信号，采用最低浓度标样重复进样3次，进行UPLC/Q-TOF MS分析。

表14工作曲线和定量下限

4、加样回收率和精密度

选择血必净注射液中含量较高的第三类化合物成分考察方法的准确度和精密度。所考察化合物用血必净空白溶媒配制“人造血必净”，目标制剂中各化合物的浓度为市售血必净注射液中该化合物平均浓度的50％、100％、150％，各浓度“人造血必净”配制3份供试品。分析方法的加样回收率用“人造血必净”注射液成分实测浓度与其标示浓度之比表示，分析方法的精密度用同浓度3份“人造血必净”供试品分析结果的RSD值表示。

选取第三类化合物中含量较高的成分，按照上述方式进行配制后，进行测定，具体结果见表15。由表15可知，选取的第三类化合物成分的加样平均回收率在92.7-119％之间，表明本方法加样回收率良好，精密度为0.59-5.89％，表明本方法重复性良好。

表15

实施例4

1、样品前处理

移取一定量的血必净注射液，采用体积百分比为10％的甲醇水溶液稀释10-1000倍，制备待测液。

分别移取一定量的第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分，采用体积百分比为10％的甲醇水溶液稀释10-1000倍，制备标准溶液，标准溶液中各成分的浓度范围为12.3-9000nM。

2、测定

采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的超高效液相色谱(UPLC)，对待测液和标准溶液中第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分进行分离；并采用超高效液相-质谱联用分析系统(UPLC/MS/MS)中的三重四极杆质谱(MS/MS)，确定待测液和标准溶液中第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分，采用外标法同时对待测液中的第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分中任意一种或多种成分的含量进行定量检测。

其中，所述超高效液相色谱(UPLC)的色谱条件为：色谱柱：Waters AcquityHSS T3柱(100mm×2.1mm ID，1.8μM)；柱温：40℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相：甲醇-水溶液(含甲酸、醋酸锂)，其中，A相为甲醇-水溶液(体积比v/v：1：99，含1.0mM甲酸、25μM醋酸锂)，B相为甲醇-水溶液(体积比v/v：1：99，含1.0mM甲酸、25μM醋酸锂)；分析时间：8min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：0-7.0min，A相：B相体积比为94：6-5：95；7.0-8.0min，A相：B相体积比为5：95-94：6。

所述三重四极杆质谱(MS/MS)的测定条件为：离子源：ESI源；检测模式：正离子电喷雾电离模式(ESI⁺)；工作模式：选择反应监测(SRM)；测定参数中正离子模式优化去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)的数值见表9，测定参数中保留时间(t_R)、Q1扫描范围、Q3扫描范围、扫描时间的数值见表10。

3、测定方法的线性关系、检出限和定量限

配制各成分的浓度范围为1.37-9000nM的标准溶液，分别进行UPLC/MS/MS检测，以色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应血必净注射液中第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分的质量浓度为横坐标(X轴)，进行回归分析，得到回归方程及其相关系数，如表16所示。

由表16可知，上述回归方程的在相应浓度范围内进样时线性关系良好，相关系数r>0.99。对标准溶液中的目标物响应信号，采用最低浓度标样重复进样3次，进行UPLC/MS/MS分析。

表16工作曲线和定量下限

4、加样回收率和精密度

考察血必净注射液中第四类化合物、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分测定方法的准确度和精密度。所考察化合物用血必净空白溶媒配制“人造血必净”，目标制剂中各化合物的浓度为市售血必净注射液中该化合物平均浓度的50％、100％、150％，各浓度“人造血必净”配制3份供试品。分析方法的加样回收率用“人造血必净”注射液成分实测浓度与其标示浓度之比表示，分析方法的精密度用同浓度3份“人造血必净”供试品分析结果的RSD值表示。

取第四类化合物成分、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分，按照上述方式进行配制后，进行测定，具体结果见表17。由表17可知，第四类化合物成分、第五类化合物中腺嘌呤和腺苷成分的加样平均回收率在74.6-137％之间，表明本方法加样回收率良好，精密度为3.60-12.5％，表明本方法重复性良好。

表17

实施例5

采用本方法测定实际多批次血必净注射液样品中47种五类化合物成分的含量，并计算每个成分的批间差，具体见表18。由表18可知，针对不同的样品，该方法均能有效测定其实际样品中47种五类化合物成分的含量，并能够按照血必净注射液日用剂量(100mL/人)计算每个成分的日用剂量并对47个成分进行分档，其中一档成分(化合物日用剂量，>100μmol/人)有1个，为芍药苷，其批间差分别为10.1％；二档成分(10-100μmol/人)有6个，分别为羟基红花黄色素A、苯甲酸、苯丙氨酸、洋川芎内酯I、腺嘌呤和阿魏酸，批间差分别为9.73-19.3％；三档成分(1-10μmol/人)有25个，分别为丁二酸、芍药苷、尿苷、对香豆酸、鸟苷、原儿茶醛、氧化苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、洋川芎内酯N、洋川芎内酯H、咖啡酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、洋川芎内酯G、对羟基苯甲酸、迷迭香酸、3-羟基-3-丁基苯酞、没食子酰芍药苷、丹参素、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、开环洋川芎内酯I、腺苷和丹酚酸B，批间差为10.7–41.8％，四档成分(<1μmol/人)有15个，批间差为8.80–31.6％。从而能够对血必净注射液中47种成分进行有效的质量控制评估。上述方法操作简便、适用性好，结果准确、可靠。

所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点，对于进一步提高产品的质量均一性提供了重要的参考指标，具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。