一种利用Genomic‑SSR和EST‑SSR两类标记鉴评蝴蝶兰遗传多样性的方法

技术领域

本发明涉及植物种质资源评价技术领域，具体地，涉及一种利用Genomic-SSR和EST-SSR两类标记鉴评蝴蝶兰遗传多样性的方法。

背景技术

蝴蝶兰(Phalaenopsis)，系兰科(Orchidaceae)蝴蝶兰属(Phalaenopsis)多年生附生植物，如何平衡植物种质资源的收集和有效利用之间的矛盾是21世纪的焦点问题之一，受到世界性的广泛重视。蝴蝶兰，是世界上栽培最广泛、最普及的洋兰品种之一，具有极高的观赏价值与经济价值，而由于其在全世界各地广泛流行，杂交新品种层出不穷，加上地区间品种交换频繁，使其资源收集的数量越来越庞大，同物异名和同名异物的情况也越发严重，反而阻碍了蝴蝶兰种质资源的有效利用。

早期SSR标记开发需要构建基因组文库，通过测序寻找含有SSR结构的克隆，再根据SSR侧翼的保守序列设计特异性引物进行PCR扩增，这种基于基因组数据开发的SSR标记被称为Genomic-SSR。随着功能基因组学的发展，各个重要物种的EST(express sequence tags)序列数量迅速增大，基于EST序列开发EST-SSR成为微卫星标记新的发展方向，而且EST是来源于基因转录区域的3’或5’端测序的cDNA序列，与功能基因紧密连锁，所以利用EST序列开发SSR作为功能标记已广泛用于构建与特定功能相关的遗传连锁功能图谱。由于标记开发的来源不同，在其他花卉如梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)等观赏植物研究中发现Genomic-SSR与EST-SSR具有一定的遗传差异性。如果在蝴蝶兰中也存在这种差异性，将会对蝴蝶兰的遗传多样性评价以及相关研究具有非常重要的指导意义。因此，本研究采用Genomic-SSR以及EST-SSR两类SSR分子标记对412个蝴蝶兰栽培种质的遗传差异性进行分析，为下一步综合运用不同来源的SSR标记进行相关研究奠定基础。现有遗传多样性评价，通常只采用一类SSR标记，检测的代表性不够全面。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种利用Genomic-SSR和EST-SSR两类标记鉴评蝴蝶兰遗传多样性的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种鉴评蝴蝶兰遗传多样性的引物组合，所述引物组合由2对Genomic-SSR引物和8对EST-SSR引物组成，2对Genomic-SSR引物分别为G-1和G-2，G-1的序列如SEQ ID NO：1～2所示，G-2的序列如SEQ ID NO：3～4所示；8对EST-SSR引物分别为E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7、E-8，E-1的序列如SEQ ID NO：5～6所示，E-2的序列如SEQ ID NO：7～8所示，E-3的序列如SEQ ID NO：9～10所示，E-4的序列如SEQ ID NO：11～12所示，E-5的序列如SEQ ID NO：13～14所示，E-6的序列如SEQ ID NO：15～16所示，E-7的序列如SEQ ID NO：17～18所示，E-8的序列如SEQ ID NO：19～20所示。

如上所述的引物组合在鉴评蝴蝶兰遗传多样性中的应用。

一种鉴评蝴蝶兰遗传多样性的方法，包括如下步骤：

(1)提取待分析蝴蝶兰的总DNA；

(2)对如上所述的引物组合进行荧光标记后，以步骤(1)的DNA为模板分别进行PCR反应；

(3)记录每对引物的扩增峰型，对获得的数据进行分析处理，评价蝴蝶兰种质的遗传多样性。

优选地，提取待分析蝴蝶兰的总DNA时，以蝴蝶兰的嫩根作为提取样本。

优选地，所述PCR的扩增体系为DNA模板1μl、5μM的上下游引物1μl、5U/μl的Taq酶0.1μl、缓冲液6μl、加水补充至15μl。

优选地，所述PCR的扩增程序为95℃，5min；94℃，30sec；58℃，35sec；35个循环；72℃，35sec，60℃，30min；15℃。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次利用Genomic-SSR和EST-SSR两类SSR标记共同检测蝴蝶兰种质的遗传多样性可弥补仅用单一分子标记检测的局限性，实验结果更有可靠性和代表性。另SSR分子标记技术现多采用凝胶电泳检测的方法，稳定性差，检测效率低，操作人员的主观性强，而本研究为了提高了SSR分子标记的检测效率和稳定可靠性，本发明采用荧光标记毛细管电泳检测法来进行蝴蝶兰SSR分子检测，能够一定程度上降低了因人为实验操作因素等引起的实验结果误差，技术上更有进步性。

本发明以收集保存在本单位蝴蝶兰资源圃的412份蝴蝶兰种质为试材，利用SSR分子标记系统揭示蝴蝶兰种质资源的遗传多样性并进行资源的综合评价。这将可以为蝴蝶兰种质的收集、品种鉴定提供对照材料；并为蝴蝶兰的种质创新提供基本数据，更有效地选择合适的育种亲本；还可挖掘更多蝴蝶兰种质资源的优异品种，满足市场需求等。

附图说明

图1为部分蝴蝶兰种质总DNA琼脂糖检测结果，自左向右依次为蝴蝶兰种质1～24号；M：Marker 2000bp。

图2为荧光标记引物对蝴蝶兰样本的检测峰值图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

下列实施例中所采用的412份蝴蝶兰种质资源均取自广东省环境园艺研究所的广东名优花卉种质资源圃的兰花种质圃中。

实施例1

一种利用Genomic-SSR和EST-SSR两类标记鉴评蝴蝶兰遗传多样性的方法，包括如下步骤：

(1)取样：挑选生长健壮的嫩根，放入保鲜袋，然后用冰盒盛放，取完后迅速带回实验室备用。

(2)DNA提取：选取蝴蝶兰的嫩根，利用Tiangen公司的DNA提取试剂盒，提取412份蝴蝶兰种质的基因组DNA，部分蝴蝶兰种质总DNA琼脂糖检测结果见图1。结果表明采用植株的嫩根耗时短，效率高，提取效果最佳。DNA提取完成后，对DNA的质量和浓度进行检测。利用A260计算DNA样品的浓度，A230/A260及A260/A280的比值评价DNA样品的纯度。

(3)筛选蝴蝶兰Genomic-SSR和EST-SSR两类引物：选取已设计好的55对SSR引物(包括30对Genomic-SSR引物与25对EST-SSR引物)进行毛细管电泳检测筛选，获得10对效果较好的引物(包括2对Genomic-SSR引物与8对EST-SSR引物)，引物序列见表1。其中EST-SSR引物的扩增效率普遍高于Genomic-SSR引物，之后对其加荧光标记重新合成荧光标记引物，进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系见表2，PCR扩增程序为：95℃，5min；94℃，30sec；58℃，35sec；35个循环；72℃，35sec，60℃，30min；15℃。

表1筛选出的10对SSR引物序列信息

其中1～2号为Genomic-SSR引物，3～10号为EST-SSR引物。

表2为PCR反应体系各组分及加入量

扩增产物采用ABI公司的3730xl DNA analyzer基因分析仪检测引物的多态性：取PCR产物1.0μL、ROX-500分子量内标(北京阅微基因公司)0.5μL和Hi-Di甲酰胺8.5μL混合加入96孔板，95℃变性3min，1×Buffer缓冲液上机检测，扩增结果中如峰型一致且存在不同片段长度则为存在多态性，若峰型一致但均为同一片段长度则视为无多态性(如图2所示)。

(4)数据分析及评价：对所有试材进行多态性检测，之后采用POPGENE1.31和PowerMarker软件进行以下遗传多样性参数的分析：扩增产物的多态位点数(N)，多态位点百分率(The percentage of polymorphic loci,P),观测等位基因数(Observed number of alleles,A)，有效等位基因数(Effective number of alleles,Ae)，Nei’s基因多样性指数(Nei’s gene diversity,H)(Nei,1973)，香农信息指数(Shannon’s information index,I)；以及多态信息含量(Polymorphic information content,PIC)和分子标记指数(Marker index,MI)；并对比两类SSR标记的检测效率。

(5)遗传多样性分析：结果表明10对SSR引物共扩增出145条带，条带范围从130bp到532bp不等，其中144条(99.31％)为多态性带。每对引物能扩增出的多态性条带数目从4条(Estssr4)到21条(Estssr1)不等，平均每对引物可以扩增出14.4条多态带。每条引物扩增出的多态带比率在80％(Estssr4)到100％之间。平均的PIC值和MI值分别为：0.66和27.42，其中引物FRI04具有较高的PIC值(0.91)和MI值(56.2)，而引物Estssr4具有较低的PIC值(0.34)和MI值(1.68)。详细检测参数结果见表3、表4。同时分析对比了Genomic-SSR和EST-SSR两种SSR标记的遗传差异性，研究结果表明(如表5所示)，在标记多态性及基因型鉴别等方面Genomic-SSR和EST-SSR均具有显著的遗传差异性，两类标记平均检测到的有效等位基因数、Shannon指数和基因多样性指数差异很小，但从原候选引物数对比来看，EST-SSR类引物具有更高的有效性。综合来看，同时采用两类Genomic-SSR和EST-SSR两类SSR标记的检测效率更高，更具代表性。

表3为10对SSR引物的蝴蝶兰遗传多样性参数

表4为10对SSR引物的蝴蝶兰种质遗传多样性分析

表5.Genomic-SSR引物和EST-SSR引物检测的的遗传多态性比较

本发明首次把两类SSR分子标记技术同时用于蝴蝶兰种质资源的遗传多样性鉴评上。结果表明，SSR标记检测的实验操作过程简单，易操作，扩增带型清晰稳定，重复性好。基于分子标记鉴定种质资源，相对于田间农艺性状进行资源鉴评，具有不受时间限制、客观性强等特点。综合两类分子标记进行遗传多样性的鉴定评价，保证了对基因组更大程度的代表性和覆盖性，能很好地代表蝴蝶兰种质资源的遗传多样性，代表性强。对蝴蝶兰种质资源的保存、评价与利用都具有重要意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院环境园艺研究所

<120> 一种利用Genomic-SSR和EST-SSR两类标记鉴评蝴蝶兰遗传多样性的方法

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<170> PatentIn version 3.3

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