一种预测乳腺癌对曲妥珠单抗联合化疗治疗敏感性的生物标志物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种预测乳腺癌对曲妥珠单抗联合化疗治疗敏感性的生物标志物，具体的涉及预测HER2阳性乳腺癌患者对联合治疗敏感性的TRBV7-7生物标志物。

背景技术

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，占所有女性恶性肿瘤的23％。据2017年美国癌症统计数据显示每年约有25万女性被诊断为乳腺癌，占女性恶性肿瘤发病率首位，乳腺癌死亡约4万例为女性恶性肿瘤死亡率第二位。2015年中国癌症统计数据显示乳腺癌已成为我国女性恶性肿瘤发病率的首位，每年新发病人数约26.9万、死亡约7.1万例。新辅助化疗(Neoadjuvant Chemotherapy,NAC)是在20世纪70年代初由Frei首先提出，主要应用于局部进展期肿瘤在化疗后使不可切除的肿瘤达到可切除或由不可保乳达到可保乳的目的。NAC在乳腺癌中应用是由意大利米兰癌症研究所率先使用。两项大型临床研究证实NAC与辅助化疗的效果在远期生存方面没有差异。NAC在乳腺癌的降期降级、提高保乳率、评估化疗药物的敏感性方面具有明显的优势。当前，NAC已成为局部进展期乳腺癌的标准治疗方式。NAC后达到病理完全缓解(pathologic complete response,pCR)的乳腺癌患者在无病生存期和长期生存率上有显著的提高。因此确定对新辅助化疗敏感的乳腺癌患者对于其治疗具有重要的意义。

TCR是T细胞表面识别抗原的分子，也是T细胞产生免疫应答的第一个关键分子，经典的克隆选择学说认为：TCR是在胚系基因的基础上，于胸腺中进行V(variable)、D(diversity)、J(joining)、C(constant)基因片段重排(组合、插入、剪接)而形成多样性的抗原互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3，其中“CDR3区”(又称超变区)组成最具有多样性的CDR3受体库。TCR是由α、β链或γ、δ链构成的异源性二聚体，其中人TCRβ链重排基因全长为由不连贯分布的TRBV(48个功能性基因片段)、TRBJ(13个功能性基因片段)、TRBD(2个功能性基因片段)和TRBC(2个功能性基因片段)基因重排而形成，TCRβ链“CDR3区”是由“TRBV末端-TRBD-TRBJ前端”基因和“连接处核背酸插入或剪接”构成，单个人体TCRβ链本身的多样性及β链与α链组合的多样性，能形成至少10¹¹以上种类的TCR，不同T细胞克隆具有不同序列或不同长度的TCR>

现有研究发现，特异性的免疫细胞，尤其是肿瘤浸润性的淋巴细胞对乳腺癌的预后具有重要的作用。随着测序技术的发展，应用高通量测序技术对TCR CDR3进行受体库的研究，为免疫学的发展带来新的思路，同时为肿瘤的免疫研究及治疗提供了重要的手段。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，在于提供一种预测HER2阳性乳腺癌患者对新辅助化疗疗法敏感性的生物标志物，。

本发明的目的之二，在于提供一种检测试剂盒，用于发现曲妥珠单抗联合化疗治疗的受益群众，从而实现HER2阳性乳腺癌患者的个性化治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测TRBV7-7表达的试剂在制备用于预测HER2阳性乳腺癌患者对曲妥珠单抗联合化疗剂治疗的反应或敏感性的产品中的应用。

进一步，所述样品为人外周血。

在本发明中，可以评估作为生物学样品的患者样品可以是血液样品或血浆样品。获得血液样品和血浆样品的方法是本领域公知的。患者样品可以在新辅助疗法之前或在辅助疗法之前得自患者。

进一步，所述化疗剂包括烷化剂类、亚硝脲类、乙撑亚胺类、甲基迷胺类、磺酸烷基酯类、抗代谢物类、长春花生物碱类、表鬼臼毒素类、抗生素、丝裂霉素C、放线菌素、铂配位复合物、蒽二酮类、甲基肼衍生物、激素和拮抗剂。

进一步，所述化疗的药物包括紫杉醇、卡铂、表柔比星。

进一步，所述试剂包括检测TRBV7-7基因频率或表达水平的试剂。

进一步，所述检测基因频率的试剂包括使用免疫组库测序方法检测TRBV7-7基因频率的试剂。

进一步，所述检测基因表达水平的试剂包括针对TRBV7-7的探针、引物、抗体或配体。

一种用于预测HER2阳性乳腺癌患者对曲妥珠单抗联合化疗剂疗法的反应或敏感性的试剂盒，所述试剂盒包括检测样本中TRBV7-7的试剂。

进一步，所述试剂盒包括特异性扩增TRBV7-7基因的引物；优选的，所述引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

进一步，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、GAPDH内参引物、PCR反应液、反转录试剂、阴性对照和阳性对照。

附图说明

图1是利用二代测序检测与HER2阳性乳腺癌患者治疗疗效相关的基因频率的差异统计图；

图2是利用QPCR检测TRVB7-7在HER2阳性乳腺癌患者的差异表达情况图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测曲妥珠单抗联合化疗剂治疗HER2阳性乳腺癌患者前后TCR及TCRB表达谱，发现在病理完全缓解(pCR)组和非完全缓解组(non-pCR)不同频率的基因，从而为HER2阳性乳腺癌患者个性化治疗提供重要的手段。通过测序及分析发现，TRBV7-7在pCR组和non-pCR组呈现显著性的差异，提示TRBV7-7可作为标志物筛选新辅助化疗的受益患者，以期实现乳腺癌患者的个性化治疗。

生物标志物

在本发明中，标志物等同于生物标志物或分子标志物，是在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白，(单独使用或与其他定性术语组合例如乳腺癌标志物、乳腺癌特异性标志物、对照标志物、外源标志物、内源标志物)指可测量、可计算或可以其他方式获得的，与任何分子或分子组合相关，可用作生物和/或化学状态的指示物的参数。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)和蛋白(例如肽、多肽)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。本发明的TRBV7-7还涵盖与其变体和/或同源物的氨基酸序列，以及该序列的片段具有至少85％、至少90％或至少95％同源性的蛋白质，前提是变体蛋白质(包括同等型)、同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种TRBV7-7特异性抗体识别。

为了测定一种氨基酸或核酸序列与如本文中描述的氨基酸或核酸序列是否具有某种程度的同一性，技术人员可使用本领域公知的手段和方法，例如比对，或是手工或是通过使用本领域已知的或本文中描述的计算机程序。依照本发明，术语“相同”或“百分比同一性”在两种或更多种氨基酸或核酸序列的语境中指如使用本领域已知的序列比较算法或通过手工比对和目视检查测量的，在比较窗口上或在指定区域上为最大对应进行比较和比对时，两种或更多种序列或亚序列相同，或规定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同，认为具有例如60％至95％或更大序列同一性的序列是基本相同的。此类定义也适用于测试序列的互补物。优选地，所描述的同一性在长度为至少约15至25个氨基酸或核苷酸的区域上、更优选在长度为约50至100个氨基酸或核苷酸的区域上存在。

检测技术

本发明的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、免疫检测技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

本发明还涵盖用于评估或测定TRBV7-7的表达水平别的免疫测定方法，诸如通过Western印迹和基于ELISA的检测。

TRBV7-7的表达水平也可以利用免疫凝集、免疫沉淀(例如免疫扩散、免疫电泳、免疫固定)、Western印迹技术(例如(原位)免疫细胞化学、亲和层析、酶免疫测定法)等等在蛋白质水平上测定。溶液中纯化的多肽的量也可以通过物理方法，例如光度法来测定。量化混合物中特定多肽的方法通常依赖于特异性结合，例如抗体的。利用抗体特异性的特异性检测和量化方法包括例如免疫测定法方法。例如，患者样品中本发明标志物/指示物蛋白质的浓度/量可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。或者，可实施Western印迹分析或免疫染色。Western印迹组合通过电泳分开蛋白质混合物和使用抗体特异性检测。电泳可以是多维的，诸如2D电泳。通常，将多肽在2D电泳中根据它们的表观分子量沿一维分开并根据它们的等电点延另一维分开。

在本发明中，术语“抗体”在本文中以最广义使用，而且包括但不限于单克隆和多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、CDR嫁接抗体、人源化抗体、骆驼化(camelized)抗体、单链抗体和抗体片段和片段构建物，例如F(ab’)2片段、Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、双特异性scFv、双抗体、单域抗体(dAb)和微型抗体(minibody)，它们展现期望的生物学活性，特别是对TRBV7-7或对其同源物、变体、片段和/或同等型的特异性结合。

免疫组库测序

免疫组库(Immune Repertoire，IR)是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。免疫组库测序(Immune Repertoiresequencing(IR-SEQ))是以T/B淋巴细胞为研究目标，以多重PCR或5’RACE技术目的扩增决定B细胞受体(BCR)或T细胞受体(TCR)多样性的互补决定区(CDR区)，再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。

化疗剂

在本发明中，化疗剂包括能提供抗癌治疗效果的任何活性剂，而且可以是化学药剂或生物学药剂，特别是能够干扰癌或肿瘤细胞的化学药剂或生物学药剂。优选的活性剂是那些起抗瘤(化学毒性或化学抑制性)药剂的作用的，其抑制或阻止恶性细胞形成、成熟或增殖。化疗方案或化疗剂的非限制性例子包括紫杉醇、烷化剂类(alkylating agents)诸如氮芥类(nitrogen mustards)(例如双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil))、亚硝脲类(nitrosoureas)(例如，卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、和司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU))、乙撑亚胺类(ethylenimines)/甲基蜜胺类(methylmelamines)(例如三乙撑蜜胺(thriethylenemelamine)(TEM)、三乙烯(triethylene)、硫代磷酰胺(thiophosphoramide)(塞替派(thiotepa))、六甲基蜜胺(hexamethylmelamine)(HMM，六甲蜜胺(altretamine)))、磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)(例如，白消安(busulfan))、和三嗪(triazines)(例如，达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC))；抗代谢物类(antimetabolites)诸如叶酸类似物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、三甲曲沙(trimetrexate))、嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、氟脱氧尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)(AraC，阿糖胞苷(cytarabine))、5-氮胞苷(azacytidine)、2,2’-二氟脱氧胞苷)、和嘌呤类似物(例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、2’-脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)(喷司他丁(pentostatin))、红羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine,EHNA)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)，2-CdA))；自天然产物开发的抗有丝分裂药物(例如，帕利他赛(paclitaxel)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(例如，长春碱(vinblastine,VLB)、长春新碱(vincristine)、和长春瑞滨(vinorelbine))、多西他赛(docetaxel)、雌莫司汀(estramustine)、和磷酸雌莫司汀)、表鬼臼毒素类(epipodophylotoxins)(例如依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、抗生素(例如放射菌素(actimomycin)D、道诺霉素(daunomycin)(柔红霉素(rubidomycin))、daunorubicon、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))、丝裂霉素(mitomycin)C、放线菌素(actinomycin))、酶(例如L-门冬酰胺酶)、和生物反应修饰剂(biologicalresponse modifier)(例如干扰素-α、IL-2、G-CSF、GM-CSF)；混杂的药剂，包括铂配位复合物(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂(oxaliplatin))、蒽二酮类(anthracenediones)(例如米托蒽醌(mitoxantrone))、取代的脲(即，羟基脲(hydroxyurea))、甲基肼(methylhydrazine)衍生物(例如N-甲基肼(MIH)、丙卡巴肼(procarbazine))、肾上腺皮质抑制剂(例如米托坦(mitotane)(o,p’-DDD)、氨鲁米特(aminoglutethimide))；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂(例如泼尼松(prednisone)和等同物、地塞米松(dexamethasone)、氨鲁米特(aminoglutethimide))、妊娠素(progestin)(例如己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate))、雌激素(例如己烯雌酚(diethylstilbestrol)、乙炔基雌二醇(ethinyl estradiol)及其等同物)；抗雌激素(例如他莫昔芬(tamoxifen))、雄激素(例如丙酸睾酮(testosterone propionate)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)及其等同物)、抗雄激素(例如氟他胺(flutamide)、促性腺素释放素类似物、亮丙瑞林(leuprolide))和非类固醇抗雄激素(例如氟他胺(flutamide))等。

术语“反应”在本发明的语境中指示患有、怀疑患有或倾向于患HER2阳性乳腺癌的受试者/患者显示对包含曲妥珠单抗联合化疗剂的化疗方案的反应。技术人员会容易地能够确定依照本发明的方法用曲妥珠单抗联合化疗剂的人是否显示反应。例如，反应可以反映为来自乳腺癌，特别是HER2阳性乳腺癌的痛苦减轻，诸如肿瘤生长降低和/或停止、肿瘤的尺寸缩小和/或癌症的一种或多种症状改善。优选地，反应可以反映为乳腺癌的转移性转化的指数诸如降低或减少，诸如预防转移形成或降低转移数目或尺寸。

术语“敏感性”在本发明的语境中指示患有、怀疑患有或倾向于患HER2阳性乳腺癌的受试者/患者以某种方式对与化疗方案组合的曲妥珠单抗的治疗显示阳性反应。技术人员会容易地能够确定依照本发明的方法用曲妥珠单抗联合化疗剂的人是否显示反应。患者的反应在与如上文描述的“反应”的患者相比时可以是不太明显的。例如，患者可以经历较少的与疾病有关的痛苦，尽管可能没有测量到肿瘤生长或转移性指示物的降低，和/或患者对与化疗方案组合的曲妥珠单抗的反应可以仅仅是瞬时性质的，即肿瘤和/或转移的生长可以仅仅是暂时降低或停止的。

在本发明中，术语“表达水平”也可以指样品中本发明的标志物/指示物蛋白质的浓度或量。

具体实施例

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与乳腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

1.1纳入标准

1.研究纳入经病理确诊ER/PR阴性HER2阳性浸润性乳腺癌患者26例，平均年龄48岁，患者临床分期为II-III期，21位患者接受4-6个周期的曲妥珠单抗联合紫杉醇+卡铂治疗(TCH)新辅助治疗，5位患者接受曲妥珠单抗联合表柔比星+紫杉醇(ATH)新辅助治疗。患者既往未因乳腺癌行任何其他抗肿瘤治疗(包括放疗、化疗及靶向治疗、内分泌治疗)。其中11例患者术后病理疗效达病理完全缓解(pCR)和15例患者为非完全缓解(non-pCR)。

1.2样本和临床资料采集

取得患者知情同意后，采集患者新辅助治疗前的外周血样本。

采集血样本后，于4℃，1600g离心10min，即得到分离后所需血细胞。血浆样本处理完后，分离得到的血浆及剩余血细胞均保存到-30℃冰箱中，避免反复冻融。

2、DNA的提取和定量

采用QIAamp DNA Mini Kit(商品号：51306)提取外周血细胞中的DNA，实验步骤详见说明书。

Qubit(Invitrogen，the Quant-iT TM dsDNA HS Assay Kit)定量所提取的DNA，要求DNA≥1g，OD260/OD280≥1.8，OD260/OD2300≥2。

3、TCRB的多重PCR扩增

使用QIAGEN的多重PCR试剂盒进行TCRB的CDR3的多重PCR扩增

3.1 PCR1反应

配置PCR1反应体系：2×多重PCR缓冲液25μl，5×Q溶剂5μl，上下游引物各1μl，DNA模板600ng。

PCR1扩增条件：95℃15min；(94℃30s，60℃90s，72℃30s)×10个循环；72℃5min；4℃保持。

使用磁珠(Agencourt No.A63882,Beckman,Beverly,MA,USA)纯化PCR产物的目标片段。

3.2 PCR2反应

对PCR1的扩增产物进行第二轮的PCR扩增

向扩增产物中加入2μl通用引物，25μl phusion master mix，加入无核酸酶水至终体积50μl；

反应程序：98℃1min；(98℃20s，65℃30s，72℃30s)×25个循环，72℃5min，4℃保持。

4、多重PCR产物目的片段的纯化、构库以及测序

1)琼脂糖凝胶电泳检测(400mA/100V,2h)

2)回收200-350bps的目的片段；

3)使用QIAGEN公司的QIAquick Gel Purification Kit进行纯化；

4)构建cDNA文库

5)使用Illumina HiSeq 3000平台对样品进行上机测序。

5、数据分析

1)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；

2)将1)中得到的测序序列与IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量；

3)对2)的结果进行序列结构分析，免疫组库表达谱分析、Biomarker分析。

6、统计学分析

使用GraphPad Prism 5.0进行统计学分析，结果数据以mean±SEM、或者中位数和范围；使用Mann-Whitney U检测或非配对t检验对不同组间比例和变量进行比较分析，使用Pearson对单变量间的相关性进行分析。使用双边分析，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

病理完全缓解组(pCR)和非完全缓解组(non-pCR)之间进行基因信息学分析，发现完全缓解组中TRBV7-7的频率显著降低(如图1所示)。

实施例2 QPCR测序验证TRBV7-7的差异表达

1、样本收集

研究纳入临床经病理确诊ER/PR阴性HER2阳性浸润性乳腺癌患者80例，平均年龄47岁，患者处于临床II-III期。32例患者接受曲妥珠单抗联合表柔比星+紫杉醇(ATH)的新辅助治疗，48例患者接受曲妥珠单抗联合紫杉醇+卡铂(TCH)的新辅助治疗。经统计，疗效non-pCR的患者49人，疗效pCR的患者31人。

2、RNA提取及质量分析

2.1 RNA的提取

使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA，具体操作按说明书进行。

2.2 RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、逆转录

使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作，具体步骤按试剂盒说明书进行。

4、QPCR扩增

1)引物设计

根据TRBV7-7和GAPDH的序列设计扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其中，扩增TRBV7-7基因的引物序列对如SEQ ID NO.1～2所示，扩增内参基因GAPDH的引物序列对如SEQ ID NO.3～4所示。

2)反应体系的配置

向无菌EP管中加入去离子水8.5μl、SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl、正(反)向引物1μl、SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl、模板2μl混合均匀；其中，SYBRGreen聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

3)反应程序

95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

结果如图2所示，pCR组与non-pCR组相比，联合治疗前的乳腺癌患者样本中的TRBV7-7低表达，差异具有统计学意义。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院肿瘤医院

<120> 一种预测乳腺癌对曲妥珠单抗联合化疗治疗敏感性的生物标志物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acaggatgta actctcag 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataattgaag taagtcagaa ac 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aactctggta aagtggatat tg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20