产蛋白酶菌株LS20‑2‑2及其产低温蛋白酶的方法

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是产蛋白酶菌株LS20-2-2及其产低温蛋白酶的方法。

背景技术

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是全球用途最广泛的酶制剂之一，可用于洗涤剂，制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、酱油，以及纺织、医药品、化妆品等的生产和生物材料的提取上。商业化蛋白酶按来源分为动物蛋白酶、植物蛋白酶及微生物蛋白酶。微生物蛋白酶与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、产量高等优点，更易实现工业化生产。低温蛋白酶是在低温条件0-40℃下可以水解蛋白质肽键的酶类，在低温下0-50℃仍能保持着较高的催化活力，这使其在工业应用上有较大的优势，如在低温或室温下进行催化过程，降低了加热和冷却处理的强度，能够节省生产成本，并使生产过程便于监控。另外，低温蛋白酶具有热不稳定性，利用该特点，可在酶反应结束后，采用温和的热处理使酶迅速失活，从而快速经济地终止反应，在食品加工中有利于保持食物的口感和质量。因此在食品，洗涤等工业具有广泛应用前景。

类芽孢杆菌属(Paenibacillus)是1993年Ash等通过对芽孢杆菌属(Bacillus)第三类群菌种的16S rRNA基因序列的分析，将其从芽孢杆菌属中独立出来的。属于厚壁菌门，杆菌纲，芽胞杆菌目，类芽胞杆菌科。目前已发现有190个种，广泛地存在于土壤、植物根际、空气、水、食物、动物体、南极沉积物等各种生境中。据报道，类芽孢杆菌属的多个种具有植物防病和植物促生作用、对人畜安全无污染。许多类芽孢杆菌菌株代谢产物中含有多种可利用的生物活性物质，有些菌株可以产抗生素、多糖、对重金属及抗生素具有较强的耐受能力肽类、蛋白类、吡嗪类和酚类等抗菌物质，还有产碱性果胶酶、凝乳酶、木聚糖酶等酶类的报道。有些菌株也被证明有产生蛋白酶的功能。在农业、食品、环境和医药等方面具有潜在应用价值。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种产蛋白酶菌株 LS20-2-2及其产低温蛋白酶的方法，可有效解决低温蛋白酶的制备问题。

本发明的技术方案为：一种产蛋白酶菌株LS20-2-2，分类命名为皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)，2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13053，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；是从青藏高原采集的土壤样品中分离筛选出来的菌株。

所述产蛋白酶菌株LS20-2-2生产低温蛋白酶的方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将菌株LS20-2-2接种到含有质量浓度0.8-1.2％脱脂奶粉的LB平板培养基上，18-22℃培养至有透明圈产生；

(2)种子培养：将产生透明圈的单菌落接种于种子培养基中，25-28℃培养20-28h，得种子液；所述的种子培养基是由重量计的蛋白胨0.8-1.2％，酵母粉0.2-0.8％，NaCl 0.8-1.2％和余量为蒸馏水制成；

(3)发酵培养：将种子液按体积2-5％接种量接种于发酵培养基中发酵，发酵温度为25-28℃， pH为7-9，转速为160-180r/min，发酵72-86h，得发酵液；

所述发酵培养基是由重量计的：碳源0.5-1.0％，氮源0.9-1.5％，K₂HPO₄0-0.1％，产酶促进剂>

(4)收集蛋白酶：将发酵液在3-5℃下，转速8000-12000rpm，离心5-10min，取上清液；3-5℃下，边搅拌边向上清液中缓慢加入硫酸铵，每升溶液加入硫酸铵472-662克，使上清液中硫酸铵的饱和度达到70-90％，充分溶解后3-5℃盐析8-12h，得盐析液；将盐析液3-5℃下，转速5000-8000rpm，离心20-30min，取沉淀，用pH7.2的质量浓度20-50mmol/L磷酸缓冲液溶解沉淀，得到蛋白酶粗酶液；将蛋白酶粗酶液转入截留分子量为3500D透析袋中，放置于2.5-3.5L的质量浓度20-50mmol/L磷酸缓冲液中，透析过夜除盐，期间换缓冲液2-3次，将透析液冷冻干燥，得低温蛋白酶。本发明制备工艺简单、高效，节能环保，制备出的酶活性高，并且可在低温条件下有效的制备蛋白酶，所制备的蛋白酶在30℃-50℃酶活性高达

80-95％，0℃-40℃保温60min仍保持80％以上的活性，有较高的低温稳定性；该菌株发酵过程中产生特殊香味，所产蛋白酶为胞外酶，收集方便。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做详细说明。

本发明一种产蛋白酶菌株LS20-2-2，分类命名为皮氏类芽孢杆菌(Paenibacilluspeoriae)，2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13053，是从青藏高原采集的土壤样品中分离筛选出来的菌株。菌株的16SrDNA基因序列如SEQ ID NO1所述。

本发明的菌株筛选是通过对来源于青藏高原土壤样品进行微生物菌种的分离、培养，将分离得到的菌株接种至初筛培养基表面，4℃培养3-5天，菌落周围产生明显的透明圈，挑取透明圈与菌落直径比最大的菌株作为复筛菌株。复筛是将初筛菌株接种于复筛培养基中发酵测发酵液酶活的方法。所述初筛培养基优选为含有1.0％脱脂奶粉的LB培养基，所属复筛培养基优选为：酪蛋白1.0％，酵母粉0.4％，葡萄糖1.0％，K₂HPO₄>2SO₄·7H₂O>

经过筛选获得一株蛋白酶高产菌株，命名为LS20-2-2。从而提供了一种蛋白酶生产菌株，其具有在低温条件下产蛋白酶的优良特性的。经16S rDNA序列鉴定，属于皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)。LS20-2-2为革兰氏染色为阳性，细胞呈短杆状(0.5-1.0μm× 3.0-6.0μm)，单个排列。该菌株在LB培养基表面形成菌落圆形、乳白色、不透明菌落；在脱脂奶粉平板上可产生明显的透明圈。该菌种产生的蛋白酶最适反应温度为40℃，最适pH 为7-9。

本发明的蛋白酶产生菌种，可以是自然筛选的原始菌株、自然变异或人工诱变的变异菌株，也可以是通过分子生物学技术，从原始菌株或诱导变异菌株中获取低温蛋白酶基因，将基因转入受体菌，构建的工程菌株。

本发明的蛋白酶产生菌种LS20-2-2可采用常规的斜面法保存，此方法是将菌种接种于含有1.0％脱脂奶粉的LB斜面培养基表面，20℃培养2-3天后置于4℃冰箱保藏；或是将本发明菌种加入LB液体培养基20℃培养1-2天，离心取菌体，用20％脱脂奶粉+10％甘油制成菌悬液。

本发明在具体实施中可由以下实施例给出：

实施例1

本发明所述产蛋白酶菌株LS20-2-2生产低温蛋白酶的方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将菌株接种到含有0.8％脱脂奶粉的LB平板培养基中，18℃培养至有透明圈产生；

(2)种子培养：将产生透明圈的单菌落接种于种子培养基中，25℃培养20h，得种子液；所述的种子培养基是由重量计的蛋白胨0.8％，酵母粉0.2％，NaCl 0.8％和蒸馏水98.2％制成；

(3)发酵培养：将种子液按体积2％接种量接种于发酵培养基中发酵，发酵温度为25℃，pH 为7.0，转速为160r/min，发酵72h，得发酵液；

所述发酵培养基是由重量计的：玉米粉0.5％，蛋白胨0.9％，K₂HPO₄>

(4)收集蛋白酶：将发酵液在3℃下，转速12000rpm，离心5min，取上清液；3℃下，边搅拌边向上清液中缓慢加入硫酸铵，每升溶液加入硫酸铵472克，使上清液中硫酸铵的饱和度达到70％，充分溶解后3℃盐析8h，得盐析液；将盐析液3℃下，转速5000rpm，离心30min，取沉淀，用pH7.2的质量浓度20mmol/L磷酸缓冲液溶解沉淀，得到蛋白酶粗酶液；将蛋白酶粗酶液转入截留分子量为3500D透析袋中，放置于2.5L的质量浓度20mmol/L磷酸缓冲液中，透析过夜除盐，期间换缓冲液2次，将透析液冷冻干燥，得低温蛋白酶。

实施例2

本发明所述产蛋白酶菌株LS20-2-2生产低温蛋白酶的方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将菌株接种到含有1.0％脱脂奶粉的LB平板培养基上，20℃培养至有透明圈产生；

(2)种子培养：将产生透明圈的单菌落接种于种子培养基中，26℃培养24h，得种子液；所述的种子培养基是由重量计的蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，NaCl 1.0％和蒸馏水97.5％制成；

(3)发酵培养：将种子液按体积4％接种量接种于发酵培养基中发酵，发酵温度为26℃，pH 为8，转速为170r/min，发酵80h，得发酵液；

所述发酵培养基是由重量计的：葡萄糖1.0％，酪蛋白1.2％，酵母粉0.3％，K₂HPO₄0.1％，>2SO₄>

(4)收集蛋白酶：将发酵液在4℃下，转速10000rpm，离心8min，取上清液；4℃下，边搅拌边向上清液中缓慢加入硫酸铵，每升溶液加入硫酸铵561克，使上清液中硫酸铵的饱和度达到80％，充分溶解后4℃盐析10h，得盐析液；将盐析液4℃下，转速7000rpm，离心25min，取沉淀，用pH7.2的质量浓度30mmol/L磷酸缓冲液溶解沉淀，得到蛋白酶粗酶液；将蛋白酶粗酶液转入截留分子量为3500D透析袋中，放置于3L的质量浓度30mmol/L磷酸缓冲液中，透析过夜除盐，期间换缓冲液2次，将透析液冷冻干燥，得低温蛋白酶。

实施例3

本发明所述产蛋白酶菌株LS20-2-2生产低温蛋白酶的方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将菌株接种到含有1.2％脱脂奶粉的LB平板培养基上，22℃培养至有透明圈产生；

(2)种子培养：将产生透明圈的单菌落接种于种子培养基中，28℃培养28h，得种子液；所述的种子培养基是由重量计的蛋白胨1.2％，酵母粉0.8％，NaCl1.2％和96.8％蒸馏水制成；

(3)发酵培养：将种子液按体积5％接种量接种于发酵培养基中发酵，发酵温度为28℃，pH 为9，转速为180r/min，发酵86h，得发酵液；

所述发酵培养基是由重量计的：淀粉1.0％，脱脂奶粉1.5％，Mn₂SO₄>

(4)收集蛋白酶：将发酵液在5℃下，转速8000rpm，离心10min，取上清液；5℃下，边搅拌边向上清液中缓慢加入硫酸铵，每升溶液加入硫酸铵662克，使上清液中硫酸铵的饱和度达到90％，充分溶解后5℃盐析12h，得盐析液；将盐析液5℃下，转速8000rpm，离心20min，取沉淀，用pH7.2的质量浓度50mmol/L磷酸缓冲液溶解沉淀，得到蛋白酶粗酶液；将蛋白酶粗酶液转入截留分子量为3500D透析袋中，放置于3.5L的质量浓度50mmol/L磷酸缓冲液中，透析过夜除盐，期间换缓冲液3次，将透析液冷冻干燥，得低温蛋白酶。

本发明是一种来自青藏高原土壤的皮氏类芽孢杆菌Paenibacillus peoriae产蛋白酶的方法。具体步骤包括菌株的筛选、种子液的制备、产酶培养基的制备和粗酶的制备。该方法所生产的蛋白酶的酶学特征为：

1、最适反应温度为40℃，在20℃-50℃范围内酶活力高，温度高于50℃后，酶活下降迅速，表现出明显的低温蛋白酶特性；在0℃-40℃内酶活力稳定，40℃保温1h后仍保持86.8％的活性；60℃、70℃和80℃处理1h后，蛋白酶的活性仅为原活性的11.7％、11.2％和5.6％，与低温蛋白酶对热敏感的特性相符。

2、最适pH为7.0-9.0，在pH5.0-7.0时酶活稳定，属于中性蛋白酶；

3、金属离子Fe²⁺、Zn²⁺可部分抑制酶的活性，而Mn²⁺及表面活性剂Tween-20、Tween-80对酶活性有明显的促进作用。

本发明制备的蛋白酶的酶学特征是经过反复实验得出的，相关实验资料如下：

本发明所用的酶测定方法：

蛋白酶活力采用Folin法测定：底物和酶液分别在40℃下预热2min，取0.5mL稀释的酶液，加入0.5mL底物，在40℃下反应10min后，加入1mL10％三氯乙酸终止反应。在40℃下保温10min后迅速冷却。以12000rpm离心2min，取1mL上清液加入0.4mol/L碳酸钠5mL，混匀加入lml福林试剂(Solarbio)，混匀后在40℃保温20min。以缓冲液代替上清做试剂空白调仪器零点，用分光光度计测定680nm处OD值，对照组反应时先不加底物酪蛋白溶液，反应10min后先加三氯乙酸再加底物。标准曲线用不同浓度的L-酪氨酸来制定。

酶活力定义为：每毫升酶液在一定温度与pH条件下每水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个活力单位(U)。

实验1：低温下产蛋白酶菌株的筛选

将高原菌经过初筛和复筛得到低温下产蛋白酶菌株。

具体为：采于青藏高原农田的土样用常规梯度稀释法分离、培养菌株。用灭菌牙签挑取单菌落点接于1.0％脱脂奶粉平板(脱脂奶粉1g，蒸馏水50mL，115℃蒸汽灭菌15min；蛋白胨1.0g，酵母粉0.5g，NaCl 1.0g，琼脂1.5g，蒸馏水50mL，121℃蒸汽灭菌25min。将两瓶溶液混匀后倒平板)，4℃培养72h，根据产生的水解圈半径与菌落半径比值的大小，选取比值较大的菌株作为初筛的产蛋白酶菌株。

复筛是将初筛所得菌株接种于复筛培养基中培养。具体为：将低温下能产蛋白酶的菌株用灭菌牙签挑取单菌落接种于复筛培养基(酪蛋白1.0％，酵母粉0.4％，葡萄糖1.0％， K₂HPO₄>2SO₄·7H₂O>

实验2：蛋白酶产生菌(LS20-2-2)的鉴定

将筛选得到的菌株进行鉴定，确定其分类学地位。

参照《伯杰细菌鉴定手册》和《细菌系统鉴定手册》，对LS20-2-2菌株进行生理生化鉴定试验，结果如表1所示，鉴定该菌为革兰氏阳性菌：LS20-2-2菌株能水解酪蛋白，明胶，淀粉，使硝酸盐还原。

表1LS20-2-2菌株生理生化鉴定

注：“+”表示反应为阳性；“-”表示反应为阴性。

16S rDNA序列分析，具体步骤如下：

(1)基因组DNA提取：按细菌总DNA提取试剂盒(Promega)操作手册进行。

(2)PCR扩增。扩增体系为50μL，包括无菌双蒸水19μL，正向和反向引物各2μ L，模板DNA2μL，2×Es Taq MasterMix(康为)25μL。

反应条件：每个反应30个循环，每个循环包括94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸10min，首次循环在95℃下预变性2min。

PCR扩增引物：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)；1492R(5’–GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。

(3)琼脂糖切胶纯化

用DNA胶回收试剂盒回收1500bp左右的目的片段，电泳检测纯化后DNA纯度和含量。

(4)目的片断的TA克隆和筛选

以-T为载体进行TA连接，连接体系为10μL，包括2×Rapid Ligation Buffer 5μL，-T Vector 1μL，PCR product 3μL，T₄DNA>

(5)质粒DNA提取和PCR鉴定

质粒提取按照OMEGA公司的质粒提取试剂盒操作步骤进行。PCR以SP6 (5'-ATTTAGGTGACACTATAG-3')、T7(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')为引物。

(6)DNA测序

将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送华大基因测序。通过GenBank数据做相似性分析。

实验3：蛋白酶产生菌(LS20-2-2)的发酵培养

将筛选所得发酵用菌株先接种于种子培养基进行扩增，再接种于发酵培养基中进行发酵。具体为：将LS20-2-2菌种斜面接种于种子培养基中，25℃、180rpm，培养24小时后，将种子液以5％接种量加入到发酵培养基(酪蛋白1.2％，酵母粉0.3％，葡萄糖1.0％，K₂HPO₄0.1％，>2SO₄0.02％，Tween-80>

用80％硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，离心后取沉淀，以常规方法脱盐后得酶液，酶液经冷冻干燥得到蛋白酶原粉。

实验4：蛋白酶最适温度及热稳定性

分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃进行酶促反应10 min，测定蛋白酶的活力。蛋白酶反应最适温度如图1所示，本发明制备的蛋白酶最适反应温度为40℃，在20-50℃范围内酶活力高，温度高于50℃后，酶活迅速降低。

将上述制备的稀释酶液分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、 70℃、80℃温度下水浴保温1h放入冰水混合物中，与未被保温处理的酶活力相比较，测定蛋白酶剩余活力。蛋白酶的热稳定性如图2所示，本发明制备的蛋白酶在0-40℃内酶活力稳定，60℃、70℃和80℃处理1h，蛋白酶的活性仅为原活性的11.7％、11.2％和5.6％。

实验5：低温蛋白酶最适pH及pH稳定性

配制pH 3.0(柠檬酸-柠檬酸钠)、pH 5.0(磷酸)、pH 7.0(磷酸)、pH 9.0(甘氨酸-氢氧化钠)、 pH 11.0(碳酸盐)缓冲液，分别用缓冲液配不同pH的1％酪蛋白溶液作为底物，测定蛋白酶酶活。将酶液用不同pH的缓冲液稀释，4℃保存20h后，测定剩余酶活力。

本发明制备的蛋白酶反应最适pH值如图3所示，本发明菌株分泌的蛋白酶在pH5.0-11.0均有活性，且在pH7.0-9.0左右表现出较高活力。如图4所示，酶液在pH5.0-7.0条件下保持稳定，处理后仍保持98％以上酶活，属于中性蛋白酶。

实验6：各种抑制剂对酶活的影响

在酶反应最佳温度和最佳pH条件下，于反应体系中加入不同抑制剂，使反应体系中离子浓度达到2μmol/mL，以未加抑制剂的酶活力为对照100％，由图5可以看出：Mn²⁺、Tween-80、>2+的抑制作用最强，相对酶活降至78％，其次为Fe²⁺，>

本发明制备工艺简单、高效，节能环保，制备出的酶活性高，酶活最高可达202U/mL，并且可在低温条件下有效的制备蛋白酶，所制备的蛋白酶在30℃-50℃具有较高酶活，0℃ -40℃保温60min仍保持80％以上的活性，有较高的低温稳定性；该菌株发酵过程中产生特殊香味，所产蛋白酶为胞外酶，收集方便。

SEQUENCE LISTING

<110>河南省科学院生物研究所有限责任公司

<120>产蛋白酶菌株LS20-2-2及其产低温蛋白酶的方法

<130>2016

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1548

<212>DNA

<213>皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)

<400>1

agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg60

ggttgtttag aagcttgctt ctaaacaacc tagcggcgga cgggtgagta acacgtaggc120

agcctgccca caagacaggg ataactaccg gaaacggtag ctaatacccg atacatcctt180

ttcctgcatg ggagagggag gaaagacgga gcaatctgtc acttgtggat gggcctgcgg240

cgcattagct agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag300

agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta360

gggaatcttc cgcaatgggc gaaagcctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt420

ttcggatcgt aaagctctgt tgccagggaa gaacgtcttg tagagtaact gctacaagag480

tgacggtacc tgagaagaaa gccccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta540

gggggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggc tctttaagtc600

tggtgtttaa tcccgaggct caacttcggg tcgcactgga aactggggag cttgagtgca660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc720

agtggcgaag gcgactctct gggctgtaac tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttaggggt840

ttcgataccc ttggtgccga agttaacaca ttaagcattc cgcctgggga gtacggtcgc900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag cagtggagta tgtggtttaa960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc ctctgaccgg tctagagata 1020

gacctttcct tcgggacaga ggagacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatg cttagttgcc agcaggtcaa 1140

gctgggcact ctaagcagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200

tcatcatgcc ccttatgacc tgggatacac acgtactaca atggccggta caacgggaag 1260

cgaaatcgcg aggtggagcc aatcctagaa aagccggtct cagttcggat tgtaggctgc 1320

aactcgccta catgaagtcg gaattgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata 1380

cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttacaac acccgaagtc 1440

ggtggggtaa cccgcaaggg agccagccgc cgaaggtggg gtagatgatt ggggtgaagt 1500

cgtaacaagg taaccaatca ctagtgcggc cgcctgcagg tcgaccat1548