MASP-1在区分初发暴发性和经典1型糖尿病中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及MASP-1在区分初发暴发性1型糖尿病(FT1DM)和其他类型的糖尿病(尤其是经典1型糖尿病)中的应用。

背景技术

1.糖尿病

糖尿病是一种因体内胰岛素分泌绝对或者相对不足导致的一系列临床综合症。国际糖尿病联盟International Diabetes Federation，IDF)发布的“全球糖尿病概览”(theDiabetes Atlas)是国际上有关糖尿病全球患病情况和相关信息的权威参考书和重要的数据来源。根据IDF的最新数据，2013年全球约有3.87亿成年人糖尿病患者，占全世界人口的8.3％，其中9840万中国糖尿病患者人数居全球之首，约占全球糖尿病人总数的四分之一。至2035年，如果这些趋势仍在持续，则全球大约有5.92亿的人群。与发达国家相比，中国达到理想的诊疗环境还需要一定的时间，而糖尿病所带来的一些临床并发症愈发明显，给病人以及患者家属带来了肉体上、精神上与经济上巨大的负担。

根据WHO糖尿病病因学分型体系，糖尿病可分为4个大类，即1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和继发性糖尿病。其中，1型糖尿病(Type 1 Diabetes Mellitus，T1DM)也称为胰岛素依赖型糖尿病，是由自身胰岛B细胞受损导致胰岛素绝对不足所引起的糖尿病。

1999年WHO将1型糖尿病分为经典1A型糖尿病(Autoimmune type1 diabetes，1A型糖尿病)和特发性1B型糖尿病(Idiopathic type 1 diabetes，1B型糖尿病)。在1A型糖尿病患者中，胰岛相关的自身抗体如胰岛细胞抗体(Isletcellantibody，ICA)、谷氨酸脱羧酶抗体(Glutamic acid decarboxylase antibody，GADAb)、胰岛自身抗体(IA-2/IA-2βAb)可作为免疫标志，而自身抗体阴性者则被归入1B型糖尿病。

2.暴发性1型糖尿病

日本学者Imagawa等在2000年提出了暴发性1型糖尿病(Fulminant Type 1Diabetes Mellitus，FT1DM)。该糖尿病为1型糖尿病的新亚型，其表现为：发病急骤，胰酶增高，β细胞短时间内大量严重被破坏并导致高血糖和酮症酸中毒，发病初期常伴有发热、咳嗽或腹痛、腹泻等呼吸系统和消化系统症状，合并电解质紊乱、肝肾功能不全、横纹肌溶解等，一旦得不到及时治疗，病死率很高。

由于该病胰岛自身抗体检测呈阴性，且胰腺病理学无胰岛渗出或水肿等胰岛炎症状，根据糖尿病的分类，被归为特发性1B型糖尿病。FT1DM患者以成年人多见，小于20岁的青少年患者仅8.7％，并且发病率无性别和季节性差异。另外，FT1DM发病率在东亚地区偏高，日本、韩国、中国及菲律宾均有报道。根据Imagawa在日本2003年的报道，以酮症或酮症酸中毒发病的T1DM(1型糖尿病)患者中，FT1DM高达15％-20％。在韩国T1DM患者中，FT1DM约占7.1％，并且占成年型糖尿病患者的30.4％。在中国有关FT1DM的报道并不多。

与普通T1DM相比，FT1DM具有以下显著特点：(1)病程时间非常短，常在一周以内就发展为酮症酸中毒；(2)发病伴随严重的代谢紊乱，例如：意识障碍，酮症酸中毒和电解质紊乱；(3)发病时胰岛功能几乎完全、不可逆的损坏；(4)部分患者发病时可合并多脏器功能损害，严重时可发生横纹肌溶解、急性肾功能衰竭甚至心跳骤停，若得不到及时治疗，FT1DM病死率很高。

3.甘露聚糖相关丝氨酸蛋白酶-1(Mannose-Associated Serine Protease-1，MASP-1)

甘露聚糖相关丝氨酸蛋白酶-1(Mannose-Associated Serine Protease-1，MASP-1)也称为甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-1(Mannan-binding lectin serineprotease 1)，是一种由MASP1基因编码的丝氨酸蛋白酶，其作为涉及先天性和获得性免疫应答的补体系统的凝集素途径组分发挥作用。

MASP-1作为酶原合成，当该酶原与凝集素途径的病原识别分子(甘露聚糖结合凝集素和胶原凝集素)复合时被活化。该蛋白酶并不直接参与补体活化，但可能通过切割补体C2或通过活化其他补体丝氨酸蛋白酶(如MASP-2)扩大补体活性。

MASP-1还能切割纤维蛋白原和八因子，从而可能在凝血中起到作用。据报道，该基因缺乏丝氨酸蛋白酶结构域的剪切变体可作为补体途径的抑制剂。

本领域中尚无区分初发暴发性1型糖尿病和其他糖尿病(尤其是非暴发性1型糖尿病)的高灵敏度、高特异性鉴别指标和有效方法。为了对糖尿病进行更为对症的预防和治疗，本领域中迫切需要开发出能对1型糖尿病进行更为精细分型的生物学和临床指标。

发明内容

本发明正是提供了一种以MASP-1作为分子标志物诊断初发暴发性1型糖尿病、区分初发暴发性1型糖尿病与其他糖尿病的应用。本发明还提供了一种检测样品中甘露聚糖相关丝氨酸蛋白酶-1(MASP-1)蛋白水平的方法，以及本发明检验药物对暴发性1型糖尿病的治疗效果和/或筛选候选治疗药物的方法

在本发明的一些方面中，提供了检测对象样品中甘露聚糖相关丝氨酸蛋白酶-1(MASP-1)水平的物质在制备用于诊断初发暴发性1型糖尿病(初发FT1DM)的产品中的应用。

在本发明的另一些方面中，还提供了一种诊断初发暴发性1型糖尿病(初发FT1DM)的方法，所述方法包括检测对象样品中MASP-1水平的步骤。

在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：(a)检测对象样本中的MASP-1的水平；(b)将(a)中检测到的MASP-1水平与正常对照值进行比较；若比较结果显示对象样品中的MASP-1水平高于正常对照，则提示所述对象患有初发暴发性1型糖尿病。

在本发明的一些实施方式中，所述诊断还包括将本发明基于MASP-1水平的诊断与其他糖尿病诊断方法结合。

在本发明的另一些方面中，提供了检测对象样品中甘露聚糖相关丝氨酸蛋白酶-1(MASP-1)水平的物质在制备用于糖尿病分型的产品中的应用，所述糖尿病分型区分初发暴发性1型糖尿病(初发FT1DM)与其他类型的糖尿病，其中，所述其他类型的糖尿病包括：非初发暴发性1型糖尿病、非暴发型1型糖尿病、2型糖尿病。

在本发明的另一些方面中，还提供了一种糖尿病分型方法，所述糖尿病分型区分初发暴发性1型糖尿病(初发FT1DM)与其他类型的糖尿病，其中，所述其他类型的糖尿病包括：非初发暴发性1型糖尿病、非暴发型1型糖尿病、2型糖尿病，所述方法包括检测对象样品中MASP-1水平的步骤。

在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：(a)检测对象样本中的MASP-1的水平；(b)将(a)中检测到的MASP-1水平与正常对照值进行比较；若比较结果显示对象样品中的MASP-1水平高于正常对照，则提示所述对象患有初发暴发性1型糖尿病。

在本发明的一些实施方式中，所述分型还包括将本发明基于MASP-1水平的分型与其他糖尿病分型方法结合。

在本发明的另一些方面中，提供了检测对象样品中甘露聚糖相关丝氨酸蛋白酶-1(MASP-1)水平的物质在制备用于确定药物对初发暴发性1型糖尿病的治疗效果和/或筛选治疗暴发性1型糖尿病的候选药物的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，提供了一种确定药物对初发暴发性1型糖尿病的治疗效果和/或筛选治疗暴发性1型糖尿病的候选药物的方法，所述方法包括：测定并比较所述对象使用所述药物或候选药物之前和之后的MASP-1水平，若MASP-1水平降低则该药物或候选药物对暴发性1型糖尿病具有治疗效果。

如本文各方面中所述，其中，所述物质是用于检测MASP-1DNA水平、mRNA水平和/或蛋白质水平的物质，例如针对MASP-1的抗体、针对MASP-1的特异性探针、针对MASP-1的基因芯片或蛋白质芯片。

在本发明的一些实施方式中，MASP-1具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，或为其同源序列，例如与所述对象物种对应的MASP-1多肽序列；MASP-1基因具有SEQ ID NO:1、21、22或23所示核苷酸序列，或为其同源序列，例如与所述对象物种对应的MASP-1基因序列。

如本文各方面中所述，所述检测通过检测全长MASP-1、MASP-1特征肽段和/或其编码序列进行，优选所述MASP-1特征肽段选自SEQ ID NO:2-20中的一种或多种。

如本文各方面中所述，所述物质是用于通过如下方法中的一种或多种来检测MASP-1的物质：多维液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析、免疫组化法、化学发光法、放射性同位素法、荧光发光法(如免疫荧光法)、酶标法、胶体金法、实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印记法原位杂交法、蛋白质印迹法。

在一些实施方式中，所述物质带有可检测标记物，例如放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)、或它们的任合组合。

如本文各方面中所述，所述样品获自所述对象，例如获自人或非人哺乳动物，如灵长类动物、啮齿类动物、家畜、宠物等，优选人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴；和/或，所述样品选自：新鲜组织或细胞样品、福尔马林固定样品、石蜡包埋样品、血液(如全血、血清、血浆)、体液(如淋巴液、脑脊液、组织液)、腹水。

如本文各方面中所述，所述样品中存在高于对照水平的MASP-1指示所述对象罹患初发暴发性1型糖尿病，例如所述对照水平选自：由所述对象健康时的MASP-1水平、通过统计学确定的健康群体标准水平、或经标准化的水平。

如本文各方面中所述，所述产品选自：检测试剂盒、检测条、检测卡、检测笔、检测仪器或它们的任意组合；和/或，所述产品还包含选自下组的一种或多种物质：容器、缓冲剂、助剂、溶剂、阳性对照物、阴性对照物、使用说明书、用于糖尿病诊断和/或分型的其他物质。

在本文的另一些方面中，还提供了一种检测样品中甘露聚糖相关丝氨酸蛋白酶-1(MASP-1)水平的方法，包括：检测样品中选自SEQ ID NO:2-20的一种或多种多肽或其编码序列的水平。

在一些实施方式中，所述检测通过多维液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析、免疫组化法、化学发光法、放射性同位素法、荧光发光法(如免疫荧光法)、酶标法、胶体金法、实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印记法原位杂交法、蛋白质印迹法等方法进行。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：MASP-1在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度归一化后的比值，它们的计算来源于表2内各个肽段的表达量，用于整体表征蛋白质的表达量信息。图中，“FC”表示变化倍数(fold change)，“*”表示p≤0.05，“***”表示p≤0.005；

图2：采用MASP-1作为暴发性1型糖尿病病人发病初期诊断指标时，所获得的ROC曲线。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究发现MASP-1在暴发性1型糖尿病初发患者中的水平显著高于正常人、治疗后的暴发性糖尿病患者、1型糖尿病患者及2型糖尿病患者，由此提出MASP-1可作为诊断初发暴发性1型糖尿病、以及糖尿病分型(尤其是1型糖尿病细分)的分子标志物。

并且，本发明人在方法学研究中进一步发现采用MASP-1作为诊断初发暴发性1型糖尿病、以及糖尿病分型(尤其是1型糖尿病细分)的分子标志物，在诊断和/或分型中可获得高灵敏度、特异性和准确性，具有很高的临床应用价值。此外，基于相关研究，本发明的MASP-1还可进一步作为确定药物对初发暴发性1型糖尿病的治疗效果和/或筛选治疗暴发性1型糖尿病的候选药物的分子标志物。

此外，本发明人还发现了MASP-1的特征肽段，为MASP-1的定性和定量以及本发明的方法和应用提供了有利的工具。

如本文说用，术语“初发”是指首次发生且未经治疗的疾病。如本文说用，术语“初发暴发性1型糖尿病”是指未经治疗的暴发性1型糖尿病。如本文所用，术语“非初发暴发性1型糖尿病”或与初发暴发性1型糖尿病对应的“其他类型的糖尿病”包括：非初发的暴发性1型糖尿病、非暴发型1型糖尿病、2型糖尿病等。

如本文所用，术语“甘露聚糖相关丝氨酸蛋白酶-1”或“MASP-1”可互换使用，且具有本领域中已知的含义。例如，MASP-1蛋白可为Gene ID:5648所示的序列、或可为其同源序列、或其同工型序列，例如如SEQ ID NO:1、21、22或23所示的序列，。MASP-1可为全长MASP-1蛋白或其编码序列，也可为MASP-1的特征片段(例如参见表2)或其编码序列。

如本文所用，术语“检测物质”或“检测MASP-1的物质”可互换使用，均是指特异性针对MASP-1且可用于直接或间接检测出MASP-1的水平的试剂和/或设备。

由于MASP-1分子的序列在本领域中是已知的，本领域普通技术人员可基于常规手段制备或通过市售获得特异性针对MASP-1分子的试剂。例如，本发明中可用的检测试剂包括但不限于：对MASP-1分子具有检测特异性的抗体、探针。

为了便于检测，本发明的检测试剂还可带有可检测标记，所述可检测标记包括但不限于：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)等。

如本文所用，术语“产品”或“本发明的产品”可互换使用，是指包含检测生物样品中MASP-1的物质的、可用于本发明应用中的产品。本发明的产品包括但不限于：检测试剂盒、检测条、检测卡、检测笔、检测仪器或它们的任意组合。本发明的产品还包含选自下组的一种或多种物质：容器、缓冲剂、助剂、溶剂、阳性对照物、阴性对照物、使用说明书、用于糖尿病诊断和/或分型的其他物质。

如本文所用，术语“正常对照”是指用作参照的MASP-1水平，其包括但不限于：由同一对象的患病前样品中测得的MASP-1水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

试剂及实验流程

(1)化学试剂

所有缓冲液均用Milli-Q水(Millipore，Bedford，MA，USA)配制。二硫苏糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、尿素(Urea)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三(羟甲基)氨基乙烷-盐酸(Tris-HCl)等购自Bio-Rad公司(Hercules，CA，USA)；甲酸(Formic acid，FA)、碳酸氢铵(NH4HCO3)等购自Sigma公司(St.Lous，MO，USA)；HPLC级乙腈(ACN)和甲醇(Methanol)购自Fisher公司(Fair Lawn，NJ，USA)；胰酶(Trypsin)购自Promega公司(Madison，WI，USA)；TMTMass Tagging Kits(90066)购自Thermo Scientific公司(Waltham，MA，USA)。

(2)人类血清样本的收集与制备

本发明共涉及到60例人类血清样本：暴发性1型糖尿病初发病人(5例，已由临床诊断为FT1DM且未经治疗的患者)及治疗1年(5例，常规治疗)，正常血糖(15例)，1型糖尿病(T1DM，20例，未经治疗)，2型糖尿病(T2DM，15例，未经治疗)。

所有60例样本均来源于上海交通大学附属第六人民医院。人血液样品的获取严格遵照中国法律和伦理委员会的指导方针进行，每个病人都签署了知情同意书。

(3)高丰度蛋白质的去除

采用Agilent公司的MARS(multiple affinity removal system 5188-6411)去除7种人类血清蛋白质高丰度组分(即白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、转铁蛋白、结合珠蛋白和纤维蛋白原)。

具体操作为：取28μL血清加入400μL A液，采用0.22μm的超滤管，4℃，1000g，离心15min。用4mL A液平衡MARS柱子后，取过滤后的滤出液200μL于柱子上，4℃，100g，离心1min。加入300μL A液，4℃，100g，离心1min，将全部滤液转移至新离心管中。用2mL B液缓缓洗脱下结合在柱子上的高丰度蛋白质组分。再用4mL A液平衡柱子后，将剩余200μL左右血清样品重复以上操作一次，将滤液合并到上步的离心管中，冻干，-80℃保存。

(4)蛋白质浓度荧光定量

去除高丰度蛋白质后的60例血清样本以及由多样本混合后形成的样本(称为mix，经高丰度蛋白质去除后的所有60例血清样本等量混合所得)冻干后用300μL 2D裂解液(8Murea，40mM Tris，65mM DTT)复溶，然后用荧光定量。具体操作为：蛋白质定量均采用色氨酸荧光法。取20μL蛋白质溶液加入至1mL尿素溶液(8M urea，20mM Tris-HCl，pH 7.6)中。激发荧光波长设置为295nm，吸收测量荧光波长设置为350nm。标准品色氨酸倍比稀释后用于绘制标准曲线并计算样品中蛋白质浓度。样本中色氨酸平均含量按1.3％计算。

(5)溶液内酶解

溶液内酶解步骤依据于FASP酶解。根据荧光定量的结果，取14μg步骤(4)所得样本加入50μL 8M UA缓冲液(8M尿素，0.1M Tris-HCl，pH8.5)，分别置于10k超滤管(OMEGAfilter，OD010C35)上，再加入2μL 1M DTT，并置于37℃温箱中1.5h。之后，向体系中加入10μL 1M IAA，室温暗反应30min。

经过上述操作，蛋白质完全变性，二硫键被打开，巯基被封闭。此后，向体系中加入300μL 0.2M TEAB，于20℃，13000g离心15min。之后，弃掉滤液，再用200μL 0.2M TEAB缓冲液洗膜三次，超滤条件为4℃，13000g离心15min。最后，按质量比(胰酶：蛋白质＝1：25)向超滤管中加入100μL含有胰蛋白酶的0.2M TEAB，置于37℃摇床中，酶解16h。再按酶：蛋白质＝1：25向超滤管中加入胰蛋白酶继续酶解4h。酶解后的肽段混合物13000g离心收集滤出液，冻干-80℃保存，供后续实验使用。

(6)TMT体外同位素标记

TMT Mass Tagging Kits(Thermo Scientific，90066)共有六个通道(分别为126、127、128、129、130、131)，每个通道标记1个样本，其中126通道用于标记mix内参样本，共标记12组，标记顺序如下表1。

TMT标记步骤：先分别用14μL 0.2M TEAB缓冲液溶解酶解后肽段，43μL ACN溶解标记试剂；然后将标记试剂加入至肽段中，混匀室温放置1.5h，进行标记；最后加入8μL 5％羟胺终止反应15min，将每一组内6个通道肽段混合，最终合并好的14管样品加入ddH₂O反复冻干三次，-80℃保存。

表1.样品标记信息

其中，FT1DMa和FT1DMc分别表示暴发性1型糖尿病初发及相应的治疗1年的病人，N表示正常血糖，T1表示1型糖尿病人，T2表示2型糖尿病人，其中以上字母之后的数字表示不同样品的序号，即同一种疾病类型的不同个体；mix是混合样本，用于作为内参

(7)肽段脱盐

取步骤(6)所得标记并冻干后的样品用900μL 0.2％TFA的水溶液充分溶解，每个样品取200μL用填有C18的stage-tip脱盐，平行操作两份。

首先，填有两层C18的stage-tip需用100μL甲醇活化，于室温1500g离心2min，去滤液。之后，用100μL含0.2％TFA的80％乙腈洗填料，以最大限度去除污染物，离心条件同上。然后用100μL含0.2％TFA的水溶液平衡填料3次，室温1500g离心2min，去滤液。每个样品取200μL结合到stage-tip上，室温低速800g离心5min，以保证样品与C18填料充分结合。之后用100μL含0.2％TFA的水溶液洗填料3次，于室温2000g离心2min，以去除盐类等不能与C18填料结合的亲水成分。最后，用100μL含0.2％TFA的90％乙腈洗脱，离心条件同上，并收集滤液，冻干后供质谱分析使用。

(8)多维液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析

LC-MS/MS质谱检测在nanoHPLC-Orbitrap Fusion(Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA)系统上进行。

液相色谱为Easy-nLC-1000系统(ThermoFisher Scientific)；反相柱为喷针反相柱(tip column，75μm×150mm，C18，3μm)；反相的洗脱液为0.1％甲酸的水溶液(A)和0.1％甲酸的乙腈溶液(B)。样品上样到反相柱上后经由流速为0.3μL/min的反相洗脱体系洗脱，有效洗脱梯度为：5min，4％B；150min，26％B，155min，40％B；160min，90％B，质谱分析时间为180min。

从反相柱上洗脱下的肽段进入四极杆-静电场轨道阱-线性离子阱三合一组合式质谱Orbitrap Fusion进行分析，采用data-dependent的数据采集模式，以最大化采集速率(top speed)进行二级质谱图采集。动态排除设置为：若某母离子鉴定到1次，则在接下来的2min内不再对该质量母离子进行检测。母离子碎裂模式采取HCD模式，一级谱图和二级谱图分辨率分别设置为60000和15000(在200m/z时)。

(9)数据库搜索

质谱采集到的原始文件用Maxquant1.5.2.8软件进行分析，采用的数据库是Uniprot homo sapiens数据库。搜库参数设置如下：子离子(fragment ion)质量偏差20ppm以内，母离子(precursor ion)质量偏差6ppm以内，蛋白酶设置为胰蛋白酶，最大允许缺失酶切位点为2，固定修饰设置为半胱氨酸的羧甲基化(carbamidomethylation，+57Da)，可变修饰设置为甲硫氨酸的氧化(oxidation，+16Da)以及位于赖氨酸残基的游离氨基末端的TMT-6plex标记均设置为可变修饰，蛋白质和肽段的假阳性率(false discovery rate，FDR)设置为0.01。

(10)统计学及生物信息学分析

所有样品数据经过中位数矫正，然后除以内参样品，做对数处理。组间两两比较用秩和检验，经FDR矫正。所有数据分析和统计学检验都使用R安装包或者Excel完成。

实施例1.差异蛋白质分析与标志物寻找

差异蛋白质分析基于统计数值P值(P value)，它是当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率。如果P值很小，说明原假设情况的发生的概率很小，而如果出现了，根据小概率原理，我们就有理由拒绝原假设，P值越小，我们拒绝原假设的理由越充分。总之，P值越小，表明结果越显著。

标志物的诊断价值可以通过ROC曲线(受试者工作特征曲线)的曲线下面积判断，ROC曲线指受试者工作特征曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高。一般认为，曲线下面积高于0.9时诊断价值较高。

暴发性糖尿病人初发(即治疗前)、暴发性糖尿病人治疗后、正常血糖组、2型糖尿病人组、1型糖尿病人组两两比较发现，MASP-1在暴发性糖尿初发病人血清中表达量显著高于治疗后、正常人组、1型糖尿病组及2型糖尿病组。

与暴发性糖尿初发病人发病初期(FT1DMa)比较，治疗后(FT1DMc)MASP-1的丰度降低了2.14倍，其中配对t检验显示其P值为0.0015。与正常对照(N)比较，MASP-1的丰度在暴发性糖尿初发病人发病初期(FT1DMa)增加了2.66倍，BH校正后的秩和检验p值小于0.05，用MASP-1做受试者工作特征曲线(ROC曲线)，曲线下面积为1。

而暴发性糖尿初发病人治疗后(FT1DMc)、1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)分别与正常对照组相比较，其丰度变化倍数均在1.3以下，BH校正后的秩和检验p值均大于0.05。此外，暴发性糖尿初发病人治疗后(FT1DMc)、1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)分别与正常对照组用MASP-1做受试者工作特征曲线(ROC曲线)，曲线下面积分别为为0.747，0.523和0.662(可参见图2)。

从上述结果可以看出，在暴发性1型糖尿病病人发病初期，其血清MASP-1丰度较正常对照是显著增加的，而1型糖尿病病人和2型糖尿病病人的血清MASP-1丰度较正常对照则无显著性变化，

因此，血清MASP-1可作为区分暴发性1型糖尿病发病初期和其他1型糖尿病的分子分型诊断标志物。

实施例2.MASP-1特征肽段的鉴定

用质谱的方法，我们在血清中首次鉴定到如下属于MASP-1的特征肽段。它们可以用于表征蛋白质MASP-1的血清表达量：

表2.血清中鉴定到的MASP-1特征肽段列表

实施例3.MASP-1在不同组内的定量展示

如图1所示，分别展示了MASP-1在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度归一化后的比值，它们的计算来源于表2内各个肽段的表达量(采用Maxquant1.5.2.8软件自动计算)，用于整体表征蛋白质的表达量信息。

具体的，MASP-1在暴发性1型糖尿病病人发病初期血清中表达量显著高于正常人组，而在1型糖尿病人血清中表达量与正常人无显著差异。

实施例4.MASP-1用于区分暴发性1型糖尿病病人发病初期和1型糖尿病诊断的ROC曲线

标志物的诊断价值可以通过ROC曲线(受试者工作特征曲线)的曲线下面积判断，ROC曲线指受试者工作特征曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高。一般认为，曲线下面积高于0.9时诊断价值较高。

如图2所示，分别展示了分别采用MASP-1作为暴发性1型糖尿病病人发病初期诊断指标时，所获得的ROC曲线。如图所示，采用MASP-1作为指标，诊断暴发性1型糖尿病病人发病，ROC曲线下面积为1，具有较高的判定为暴发性1型糖尿病病人的价值。而采用MASP-1作为指标，判断1型糖尿病的发生，ROC曲线下面积为0.523，则无诊断效果。

综上所述，本发明揭示了血清MASP-1具有作为区分初发暴发性1型糖尿病和经典1型糖尿病的诊断标志物的价值，并在具体实验中在不同人组(正常血糖组、1型糖尿病人组、2型糖尿病人组)血清中鉴定到了属于MSAP-1的特征肽段(表2)，该些特征肽段能用于表征蛋白质的表达量信息。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

上海市第六人民医院

<120> MASP-1在区分初发暴发性和经典1型糖尿病中的应用

<130> 167469 1CNCN

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 699

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

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Thr Gly Val Ile Thr Ser Pro Asp Phe Pro Asn Pro Tyr Pro Lys

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Thr Leu Ser Asp Val Leu Gln Tyr Val Lys

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<210> 23

<211> 615

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 23

Met Ser Ile Thr Phe Arg Ser Asp Phe Ser Asn Glu Glu Arg Phe Thr

1 5 1015

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Pro Pro Val His Gly Lys Ile Glu Pro Ser Gln Ala Lys Tyr Phe Phe

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245 250 255

Pro Gly Glu Leu Glu His Gly Leu Ile Thr Phe Ser Thr Arg Asn Asn

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