富血小板血浆的制备方法、制备装置及制得的富血小板血浆

技术领域

本发明涉及血液制品领域，具体涉及一种富血小板血浆的制备方法、制备装置及制得的富血小板血浆。

背景技术

血小板是哺乳动物骨髓巨核细胞胞质裂解脱落下来的小块胞质，具有生物活性，研究发现，血小板在激活状态下能释放多种生长因子，如转化生长因子TGF、血小板衍生生长因子PDGF、胰岛素样生长因子IGF、血管内皮细胞生长因子VEGF、表皮生长因子EGF等。

TGF具有促进成纤维细胞、前成骨细胞、血管内皮细胞的有丝分裂，对细胞的形成发生、增殖、分化过程起着重要作用，它还能促进细胞外基质(ECM胶原蛋白、纤维蛋白等)的表达和抑制ECM的降解。PDGF是在创面中出现最早的生长因子之一，人体内的血管内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、骨髓基质干细胞等其体内都有PDGF的受体，它能使这些细胞进行有丝分裂成倍的增殖，促进血管的形成，增加胶原的合成，激活巨噬细胞和其他生长因子的作用。巨噬细胞被激活后有清除坏死组织的功能，并能二期释放其他各种生长因子，在创伤中后期的修复中起着至关重要的作用。VEGF通过自分泌或旁分泌诱导或促进新生血管的形成，形成对骨再生有利的微环境，可加速慢性伤口的愈合。IGF具有促进细胞分裂并进一步分化的功能，它与PDGF具有协同作用。EGF是一种强有力的细胞分裂促进因子，同时也能促进细胞外基质的合成和沉积。

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是来源于人体的富集血小板细胞的血浆制品，其促进伤口愈合和组织再生修复的作用是通过上述各种生长因子的相互作用和相互调节来完成的。生长因子分泌后立即黏附至靶细胞膜表面，激活细胞膜受体，而这些膜受体再诱导出内在的信号蛋白，激发细胞正常的基因序列表达，并使正常愈合过程加快释放激活生长因子，促进组织再生和修复，例如软骨损伤修复、肌腱与韧带损伤修复、难愈性伤口修复等等。

目前的PRP制品多是采集血液后通过离心工艺制得，其实际血小板含量和血小板活性均较低。因此，急需开发一种新的具有较高血小板含量的PRP制备方法。

发明内容

为克服现有PRP制备工艺中存在的缺陷，本发明的一个目的是提供一种富血小板血浆的制备方法，可有效避免血小板的凝聚。

本发明的另一个目的是提供一种富集浓度较高的富血小板血浆。

本发明的另一个目的是提供一种富血小板血浆的制备装置。

本发明一实施方式提供了一种富血小板血浆的制备方法，包括：提供原料混合液，所述原料混合液包括全血和抗凝剂；将所述原料混合液进行第一次离心使其分离为两层：第一层和第二层，所述第二层位于所述第一层的下部；按体积抽取所述第一层的下1/4～1/3以及所述第二层的上1/4～1/3，将所抽取的两种液体混合得到第二混合液；以及，对所述第二混合液进行第二次离心将其分为三层，取中间层制得所述富血小板血浆。

根据本发明一实施方式，所述中间层包括PRP和白细胞层、与所述PRP和白细胞层邻接的0-3mm红细胞层和与所述PRP和白细胞层邻接的0-3mm PPP层。

根据本发明一实施方式，第一次离心后所述第一层与所述第二层的高度比为40:60～60:40。

根据本发明一实施方式，所述第一次离心的离心条件为：离心力为400～800×g，离心时间为6～30分钟。

根据本发明一实施方式，所述第一次离心的离心条件为：离心力为550～650×g，离心时间为6～15分钟。

根据本发明一实施方式，所述第二次离心的离心条件为：离心力为700～900×g，离心时间为6～30分钟。

本发明一实施方式还提供了一种上述制备方法所制得的血小板血浆。

本发明一实施方式还提供了一种制备方法的富血小板血浆的制备装置，包括：移液部件和离心部件，移液部件用于注入或抽取液体；离心部件用于将液体进行离心处理，以制备所述富血小板血浆；其中，所述离心部件包括至少一个离心管，所述离心管包括管体和活动地设置于所述管体内的浮漂，所述浮漂与所述离心管的入口相连通，在所述管体的侧壁上设置有用于标识离心处理后液体界面位置的标记。

根据本发明一实施方式，所述标记至所述管体底部之间的容积为所述管体有效容积的40％～60％。

根据本发明一实施方式，所述离心管包括设置于所述管体两端的第一密封盖和第二密封盖，所述入口开设于所述第一密封盖，在所述浮漂上开设有通道，所述通道与所述入口通过软管相连通。

根据本发明一实施方式，在所述第一密封盖上开设有通气孔，在所述通气孔上设置有无菌滤膜。

根据本发明一实施方式，所述浮漂为一圆柱体，所述通道呈圆台形，所述通道的高度等于所述圆柱体的高度，所述通道的第一端口位于所述圆柱体的第一底面，所述通道的第二端口位于所述圆柱体的第二底面，所述第一端口的直径小于所述第二端口的直径。

根据本发明一实施方式，所述第二端口的直径与所述圆柱体的底面内径相同。

根据本发明一实施方式，所述装置包括离心管套，所述离心管套包括套管、套管盖和两个弹性体，所述两个弹性体分别设置在所述套管的两端。

本发明提供的PRP制备方法通过离心工艺的改进，可有效避免血小板在制备过程中发生凝聚，工艺简便，易于控制。本发明制备方法制得的PRP中具有高含量的血小板，适宜多领域的临床应用。

附图说明

图1为采用现有技术所制得的富血小板血浆的显微镜图；

图2为本发明一实施方式的离心管的结构示意图；

图3为本发明一实施方式的离心管位于离心管套中的结构示意图；

图4A为实施例1的第一次离心后的分层照片；

图4B为实施例1的第二次离心后的分层照片。

具体实施方式

体现本发明特征与优点的典型实施方式将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。

发明人发现，当离心工艺或离心参数设置不合理时，会产生血小板的“凝聚”现象。具体参见图1，其中a为血小板凝聚体，b为红细胞，“凝聚”的血小板团粒因尺寸与红细胞相当而容易在离心时进入红细胞层，从而会导致PRP制品中的实际血小板含量很低，也会导致PRP制品中血小板活性降低。

为避免上述血小板的“凝聚”，本发明一实施方式通过两次离心处理并将离心处理后的液体控制在一定的层数内，进一步提高了PRP制品中的实际血小板含量。

本发明一实施方式提供的PRP制备方法，采用二次离心工艺，包括以下过程：将全血与抗凝剂混匀并进行第一次离心至将其分离成两层，由上至下分别为第一层(黄色透明层)和第二层(红色浑浊层)，按体积抽取黄色透明层的下1/4～1/3和红色浑浊层的上1/4～1/3，混匀并对所得混合液进行第二次离心至将其分为三层，自上而下分别为贫血小板血浆(PPP)层、富血小板血浆PRP和白细胞(buffy coat)层，以及红细胞层，取中间层即为富血小板血浆。

本发明中，第一层的下1/4～1/3是指位于第一层下端的1/4～1/3体积的第一层液体，其与第二层的上端相接；第二层的上1/4～1/3是指位于第二层上端的1/4～1/3体积的第二层液体，其与第一层的下端相接。

本发明一实施方式的制备方法中，第一次离心的离心程度需至一个关键节点，即白细胞层即将形成但尚未形成的进程阶段，此时，血液只被分离成两层，即黄色透明层(上层)和红色浑浊层(下层)。

于一实施方式中，第一次离心后第一层与第二层的高度比为40:60～60:40，例如40:40、40:45、40:50、40:60、50:40、50:45、50:60、55:40、55:45、55:50、60:40、60:45、60:50等。

本发明中，第一次离心的节点能够避免血小板凝聚，节点的控制与离心速度和时间有关。

于一实施方式中，第一次离心的离心条件为：离心力为400～800×g，离心时间为6～30分钟；优选地，离心力为550～650×g，离心时间为6～15分钟；更优选地，离心力为605×g，离心时间为10分钟。具体地，第一次离心的离心力可以为450×g、500×g、600×g、610×g、700×g、750×g等；离心时间可以为8分钟、9分钟、11分钟、12分钟等。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为400×g、离心时间为6分钟的条件下进行离心后分离成两层。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为400×g、离心时间为30分钟的条件下进行离心后分离成两层。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为800×g、离心时间为6分钟的条件下进行离心后分离成两层。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为800×g、离心时间为30分钟的条件下进行离心后分离成两层。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为550×g、离心时间为6分钟的条件下进行离心后分离成两层。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为550×g、离心时间为15分钟的条件下进行离心后分离成两层。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为650×g、离心时间为6分钟的条件下进行离心后分离成两层。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为650×g、离心时间为10分钟的条件下进行离心后分离成两层。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为650×g、离心时间为15分钟的条件下进行离心后分离成两层。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为605×g、离心时间为6分钟的条件下进行离心后分离成两层。

于一实施方式中，全血与抗凝剂的混合物在离心力为605×g、离心时间为15分钟的条件下进行离心后分离成两层。

本发明中，通过离心力、离心时间调整节点，可将第一次离心后的血液控制为两层，避免了现有技术中采用更大的离心力或更长的时间将血液分为三层而导致的血小板因凝聚而活性降低或逃离中间层造成血小板的收率较低。

本发明提供的PRP制备方法中，第二次离心时血液被分为三层，由上至下依次为贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)层、PRP和白细胞(buffy coat)层、红细胞层，取中间层即为本发明制备方法制得的PRP。

于一实施方式中，中间层包括PRP和白细胞(buffy coat)层。

于一实施方式中，中间层包括PRP和白细胞层、与PRP和白细胞层邻接的0-3mm的红细胞层和与PRP和白细胞层邻接的0-3mm PPP层，即中间层除包括PRP和白细胞层外，也可以包括少量PPP层和/或少量红细胞层。

于一实施方式中，中间层中的红细胞层的厚度可以是大于0小于等于3mm，例如0.1mm、0.5mm、0.8mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm等。

于一实施方式中，中间层中的PPP层的厚度可以是大于0小于等于3mm，例如0.1mm、0.5mm、0.8mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm等。

本发明提供的PRP制备方法中，所述第二次离心的离心条件为：离心力为700～900×g，离心时间为6～30分钟；优选地，离心力为800～850×g，离心时间为6～12分钟；更优选地，离心力为823×g，离心时间为8分钟。具体地，第二次离心的离心力可以为750×g、780×g、820×g、870×g等；离心时间可以为7分钟、9分钟、11分钟等。

本发明提供的PRP制备方法中，所述全血包括人或其他动物的全血，抗凝剂可以为常见的种类和含量，能够阻止血液凝固即可；优选地，所述抗凝剂为ACD-A抗凝剂，其与所述静脉血的体积比为15:85～10:90，例如15:85、15:90、10:90等。

本发明还提供了一种富血小板血浆，其由以上技术方案任一项所述的制备方法制得，其中的血小板富集倍数可以达到全血的3.5-14倍，例如5倍、8倍、10倍等。

本发明制得的PRP中含有高含量的血小板，十分适宜临床使用，尤其是骨科、运动医学科、口腔科、眼科、神经科等，可在美容、生发、慢性伤口愈合等领域发挥巨大作用。

通常，PRP在使用时需经过激活，可以采用以下方式之一或任意的组合进行激活：

(1)近生理激活：即体内胶原蛋白激活。

(2)物理激活：采用具有细长孔型通道设计的物理激活器，反复推挤PRP穿过孔型通道，并借助剪切摩擦力实现激活。

(3)采用CaCl

(4)采用凝血酶(包括牛凝血酶、自体凝血酶)激活。

(5)采用凝血酶+CaCl

本发明提供的PRP制备方法通过离心工艺的改进，可有效避免血小板在制备过程中发生凝聚，工艺简便，易于控制。本发明制备方法制得的PRP中具有高含量的血小板，适宜多领域的临床应用。

本发明一实施方式提供了一种富血小板血浆的制备装置，包括移液部件和离心部件；移液部件用于注入或抽取液体，离心部件用于将液体进行离心处理，以制备富血小板血浆；离心部件可以包括离心机、离心管等。

于一实施方式中，移液部件可以是注射器。

于一实施方式中，离心部件包括至少一个离心管，例如两个，离心管可以为直筒型单腔室离心管。

于一实施方式中，如图2所示，离心管10包括管体11，管体11为一筒状体，例如圆筒，在管体11的两端分别设置有上盖帽12(第一密封盖)和下盖帽13(第二密封盖)以使管体11能够处于密封状态。

于一实施方式中，上盖帽12、下盖帽13与管体11过盈配合或通过胶粘、超声焊接等方式相连接。

于另一实施方式中，上盖帽12、下盖帽13与管体11可通过注塑工艺或挤塑工艺一体成型。

于一实施方式中，在上盖帽12上开设有入口121，入口121用以为移液部件提供接口，在入口121上可设置入口盖以将入口封闭。

于一实施方式中，在上盖帽12上开设有通气孔122，在通气孔122内可设置无菌滤膜以防止污染源进入管体11内，在通气孔122上还设置有孔盖，在进行离心操作时，可将孔盖打开。

于一实施方式中，管体11呈透明或半透明状(由透明材质制得)，以便于观测管体11内液体的状态。在管体11的侧壁上可设置标记15，以用于标识管体11内液体离心分离后的界面位置或者应当抽取的液体部分，标记15可以设置为不同的颜色和形状，具体可以为一条或多条标记线，例如图2所示的标记线b1、a、b2。

于一实施方式中，第一次离心后形成的第一层和第二层的界面位置位于或接近标记15，以便于操作人员把控第一次离心的关键节点，使第一次离心后第一层和第二层的比例位于合适的范围内。

于一实施方式中，标记15处至管体底部之间的容积为管体有效容积的40％～60％，例如45％、50％、55％等，优选为45％。所述管体有效容积是指管体可以容纳的液体体积，通常在PRP制备过程中第一次离心前向离心管中注满原料混合液，即离心管中原料混合液的体积通常等于管体有效容积。

于一实施方式中，标记15也可以示出一定的浮动范围，但浮动范围的上限为标记15以下的容积(标记15至管体底部之间的容积)不超过管体有效容积的60％，浮动范围的下限为标记15以下的容积不少于管体有效容积的40％，在PRP制备过程中，第一次离心后第一层和第二层的界面位置应当位于浮动范围内。

于一实施方式中，标记15包括多条标记线，即标记线a、标记线b1和标记线b2，其中标记线a位于管体有效容积的45％处(标记线a至管体底部之间的容积为有效容积的45％)，用以标识在PRP制备过程中第一次离心后第一层和第二层液体分界的位置；标记线b1位于管体有效容积的63.3％处，标记线b2位于管体有效容积的30％处，标记线b1和b2之间为第一次离心分离后应当抽取的构成所述第二混合液的液体部分。

于一实施方式中，在管体11内设置有浮漂14，浮漂14与离心管10的入口相连通，移液部件可通过浮漂14将原料液注入管体11内。

于一实施方式中，浮漂14设置于管体11的管壁，并能够沿管体11的管壁上下(管体轴线方向)滑动，浮漂14可将管体11的内部划分为上、下两个空腔。

于一实施方式中，浮漂14的形状与管体11相匹配。例如，管体11为圆管，浮漂14为一圆柱体，直径等于或略小于管体11的内径，使得其能够紧贴管体11的四周内壁，并可滑动地设置于管体11内。由于浮漂14紧贴管壁设置，在其沿管壁上下滑动的过程中，能够最大程度的避免位于浮漂14以下的液体进入浮漂14以上的空腔。

于一实施方式中，在浮漂14中开设有通道141，通道141与上盖帽12的入口相连。

于一实施方式中，通道141为圆台形，底部开口大于顶部开口，通道141通过其顶部开口与入口相连，优选地，通道141通过软管与入口相连。

于一实施方式中，浮漂14为圆柱体；通道141呈圆台形，并沿圆柱体的高度方向开设，其高度与圆柱体的高度相同，即，通道141的上端口位于圆柱体的上底面，下端口位于圆柱体的下底面，上端口的直径小于下端口，优选地，通道141下端口的直径与圆柱体横截面的内径相等。

于一实施方式中，可将移液部件，例如注射器，与入口121相连通，并通过软管和通道141向浮漂14下方空腔注入液体或自浮漂14下方空腔抽取液体，通过此方式抽取浮漂14下方空腔的液体，可以减小对浮漂14下液体的扰动。

于一实施方式中，如图3所示，在离心管10外可设置离心管套，离心管套包括套管21、两个套管盖22和两个弹性体23，套管21具有一空腔，用于容纳离心管10。在套管21的内部设置有弹性体23，在离心前可以将离心管10装入离心管套，按下套管盖22将离心管固定，离心管10位于两个弹性体23之间。在离心和操作过程中，弹性体23能够减小减速惯性和其他外力对离心管10内液体的扰动，保持离心后液体分层界面的稳定。

于一实施方式中，两个弹性体23与套管21、套管盖22没有连接关系，使用时，在离心管10的压力作用下，两个弹性体23被夹设于离心管10和套管21的两个底面之间。

于一实施方式中，两个弹性体23分别与两个套管盖22相连。

下面结合附图通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 PRP的制备

(1)将10体积份ACD-A抗凝剂加入到一次性无菌注射器中，推拉注射器推杆，使抗凝剂挂满注射器套筒内壁，抽取受者90体积份静脉血，与抗凝剂混匀。

(2)打开离心管10的入口盖、孔盖，将注射器的下端通过上盖帽12的入口121与通道141液体连通，并将上述含有抗凝剂的静脉血通过通道141注入到带有浮漂14的直筒型单腔室离心管10中；之后，将离心管10装入套管21中并处于两个弹性体23之间，按下套管盖22将离心管10固定。

(3)用另一支同样的离心管在配平后一同放入低速离心机中进行第一次离心，具体离心条件为：605×g离心力离心10分钟，离心管中的原料液如图4A所示被分离成两层，即黄色透明层(上层)和红色的浑浊层(下层)，且黄色透明层与红色浑浊层的高度比约55﹕45，两层液体的界面基本位于图2所示的离心管壁标记15中的标记a处。

(4)抽取标记b1和标记b2之间的液体部分，即黄色透明层的下三分之一和红色浑浊层的上三分之一，并混匀后进行二次离心，具体离心条件为：823×g离心力离心8分钟，二次离心后离心管中的混合液如图4B所示被分离成三层，由上至下分别为PPP层、PRP和白细胞层，以及红细胞层，抽取PRP和白细胞层上约2毫米的黄色层至白细胞层下约1毫米的红细胞层并混匀即得可以避免血小板凝聚的PRP。

血小板浓度的测量

使用血细胞分析仪在相同的条件下分别对实施例1所制得的PRP、静脉血全血及现有技术公开的PRP进行测试，相关数据如表1所示。其中，所使用的现有技术制备的PRP为参照CN108744608A所述方法制备的PRP。

表1

表1示出了全血的血小板浓度为164×10

PRP的生长因子测量

根据酶联免疫法，采用ELISA检测试剂盒检测了本发明实施例1制备的PRP经过低温冷冻的生长因子浓度，表2示出了部分检测结果》

表2.生长因子检测结果

实施例2

本实施例的步骤、工艺条件等与实施例基本相同，主要区别在于：第一次离心的条件为：550×g离心力离心10分钟。

将所制得的PRP在与实施例1相同的条件下进行测试：血小板浓度为1369×10

除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。

本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。