一种检测HCV感染者血清中抗包膜糖蛋白抗体的化学发光试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及化学发光免疫分析定性/定量试剂盒，具体涉及一种应用重组的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)包膜糖蛋白(E1、E2)抗原包被微孔板，检测生成的包被抗原-待测抗体-酶标二抗复合物，可以对HCV感染者血清中的抗E1、抗E2抗体进行体外定性/定量测定，建立HCV感染者血清中抗E1、抗E2抗体的检测技术并进行方法学评价，该试剂盒可应用于丙型病毒性肝炎的筛查诊断、病情监测、预后评估、疾病机理和流行病学研究。

背景技术

1974年Golafield M首先报告输血后非甲非乙型肝炎，1989年Choo QL，Weiner AJ等在Houghton M领导下利用分子生物学技术克隆出了非甲非乙型肝炎的主要病原体随后被命名为丙型肝炎病毒(HCV)的基因序列，由此引起的疾病称为丙型肝炎(Hepatitis C)。现已证实丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，50-85％感染者成为慢性感染，并可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，10-30％患者可发展为肝硬化，其中肝细胞癌(HCC)年发生率约1-7％，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。2014年世界卫生组织最新统计表明：全世界大约超过1.85亿人感染了HCV，其中感染率以东亚(3.8％)、中亚(3.7％)、北非/中东(3.6％)、南亚(3.4％)及东欧(2.9％)为最高，每年全球约35万人死于与丙肝有关的疾病。我国丙型肝炎每年发病人数呈逐年上升趋势，中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会公布的历年“全国法定传染病疫情情况”资料显示：从2007年发病人数不足9.2万上升到2014年的20.3万；据此推算国内大约有4000万HCV感染者，各省市感染率不尽相同，平均感染率约为3.2％，是HCV感染的高流行区。随着HCV感染治疗进入泛基因时代，重组蛋白酶抑制剂的直接使用(Direct Acting Antiviral，DAA)可大大提高患者实现持续病毒学应答的比例(>95％)，有望改变HCV感染威胁的严峻局面，但目前DAA治疗尚面临着诸多有待解决的问题：(1)“边缘人群”无法接受有效治疗，如注射毒品者、服刑人员以及男同性恋等，加剧了疾病的流行；(2)经规范化DAA治疗后，仍有部分患者未出现持续病毒学应答或治疗失败，且DAA治疗并不能防止HCV再次感染；(3)医保支付比例低、治疗费用昂贵，患者每疗程治疗费用在数万元-数十万元人民币。由此可知，慢性HCV感染在未来很长一段时间内依旧是人类健康和全球公共卫生安全的重大威胁。

HCV属于黄病毒科，病毒体呈球形，基因组为单股正链RNA，全长约9.6kb，有7个基因型(1-7)和67个基因亚型，在我国以1b和2a基因型常见，HCV基因组由两端的5'非编码区(5'-NCR)、3'非编码区(3'-NCR)和中间的一个开放读码框(ORF)组成，ORF与5'-NCR下游紧邻，其基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能编码一个由3010～3030个氨基酸组成的多聚蛋白前体，如图1所示，在宿主细胞信号肽酶和病毒自身蛋白酶的作用下，裂解产生10种HCV蛋白，如图2所示，包括：3种结构蛋白，即核衣壳蛋白(Core)、包膜糖蛋白(E1，E2)、跨膜蛋白(P7)；6种非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。Core、E1、E2、P7共同组装成完整的病毒颗粒，非结构蛋白在病毒的生活周期中发挥重要作用。

Core、E1、E2、P7是HCV外壳蛋白骨架的主要组成部分，其中包膜糖蛋白E1、E2分别由位于基因组的第915-1490nt位点(E1)和1491-2579nt位点(E2)，分别编码192个氨基酸(E1蛋白)和363个氨基酸(E2蛋白)。包膜糖蛋白E1作为融合亚单位，包膜糖蛋白E2作为受体结合亚单位，分别在HCV侵入细胞过程中起重要的作用。因此，检测HCV病毒包膜糖蛋白E1、E2刺激机体所产生的抗体来评价HCV感染者的传染性、病程进展、药物疗效具有十分重要的意义，HCV编码的包膜糖蛋白与病毒的致病机制密切相关，该领域的研究受到了分子生物学、传染病学以及流行病学专家的广泛关注。

然而，目前国内外对抗包膜糖蛋白E1、E2抗体检测的化学发光免疫分析试剂盒及相关技术的研究尚属空白，国外有学者采用重组Core、E1、E2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白建立免疫印迹方法检测HCV感染者血清中相应蛋白抗体(

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测HCV感染者血清中抗HCV包膜糖蛋白抗体的CLIA定量试剂盒及检测方法，该试剂盒可以对HCV感染者血清中的抗E1、抗E2抗体进行体外定性/定量测定，建立HCV感染者血清中抗E1、抗E2抗体的检测技术并进行方法学评价，该试剂盒可应用于丙型病毒性肝炎的筛查诊断、病情监测、预后评估、疾病机理和流行病学研究。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测HCV感染者血清中抗包膜糖蛋白抗体的化学发光试剂盒，包括由重组的HCV包膜糖蛋白抗原包被得到的微孔板和分别独立包装的样本稀释液、阴性对照、阳性对照、酶标记物工作液、底物液A、底物液B及洗液，底物液A包括鲁米诺、邻苯基苯酚、4-咪唑苯酚及碳酸缓冲液(CB)；底物液B包括过氧化脲与磷酸缓冲液(PB)。

作为优选，底物液A包括质量浓度为0.8g/L的鲁米诺、质量浓度为0.008g/L的邻苯基苯酚、质量浓度为0.025g/L的4-咪唑苯酚及pH9.0且摩尔浓度为0.1mol/L的碳酸缓冲液(CB)；底物液B包括质量浓度为0.3g/L的过氧化脲、pH7.4且摩尔浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲液(PB)。

作为优选，样本稀释液是含有体积浓度为20％的牛血清、pH7.4且摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

作为优选，阴性对照为热灭活的非HCV感染者(抗包膜糖蛋白抗体阴性)血清或血浆，且人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒表面抗原测试呈阴性，含体积浓度为0.2％的ProClin300防腐剂；

作为优选，阳性对照为热灭活的HCV感染者(抗包膜糖蛋白抗体阳性)混合血清或血浆，且人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒表面抗原测试呈阴性，含体积浓度为0.2％的ProClin 300防腐剂。

作为优选，酶标记物工作液是用酶标记抗体稀释液将酶标记物原液稀释至质量浓度为0.05μg/ml(酶标记物原液是质量浓度为1mg/ml的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG标记物)；酶标记抗体稀释液是含有质量体积浓度为5％的牛血清白蛋白(BSA)、体积浓度为0.5％的酶稳定剂、体积浓度为0.1％的吐温-20、质量浓度为5μg/ml的抗鼠抗体阻断剂、质量浓度为1μg/L的红色色素、体积浓度为0.2％的Proclin 300、pH7.4且摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液(PBS)。

作为优选，洗液是含有体积浓度为0.5％的吐温-20、体积浓度为0.2％的Proclin300、pH7.4且摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)；使用时，洗液是20倍浓缩洗液按照1∶19的比例稀释而成，20倍浓缩洗液是含有体积浓度为10％的吐温-20、体积浓度为4％的Proclin300、pH7.4且摩尔浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

具体的洗涤方法为，弃去孔内液体，将稀释后的洗液300μl注满各孔，静置时间不超过60秒，弃去孔内洗液，重复洗3-5次后拍干。

一种检测HCV感染者血清中抗包膜糖蛋白抗体的化学发光检测方法，包括以下步骤：

(1)在重组的HCV抗包膜糖蛋白抗原包被的微孔板中，先加入样本稀释液100μl，再加入10μl待测样本，盖上封板膜，振荡混匀，37℃±1℃温度下温育30min，洗涤除去未结合的组分；

(2)设抗体阳性对照1孔，阴性对照2孔，分别加入阴、阳性对照各100μl；设空白对照孔1孔，不加任何样本；盖上封板膜，振荡混匀，37℃±1℃温度下温育30min，洗涤除去未结合的组分；

(3)除空白对照孔，其余孔内加入100μl用酶标记物工作液，盖上封板膜，振荡混匀，37℃±1℃温度下温育30min，洗涤除去未结合的酶标记物工作液；

(4)每孔依次加入底物液B、底物液A各50μl，振荡混匀室温避光放置15分钟；

鲁米诺在碱性环境下被辣根过氧化物酶氧化而处于激发态，当从激发态回到基态时，辐射出最大发射波长为425nm的光，酶促发光产生的光信号通过光电倍增管进行信号转换后得到相应的信号值，相对发光强度比值高低与HCV感染者血清中HCV感染者血清中抗包膜糖蛋白E1、E2抗体浓度呈正比；

(5)用化学发光免疫分析仪测量每孔的相对发光强度值RLIV，当样本RLIV与阴性对照RLIV均值的比值≥2.1时，为阳性；反之，为阴性。

作为优选，包被微孔板的抗原为重组的HCV包膜糖蛋白抗原(E1或E2)；

包被微孔板的制备方法包括以下步骤：将重组的HCV包膜糖蛋白抗原采用包被液稀释至0.5μg/ml，将稀释后HCV抗包膜糖蛋白抗原按照100μl量加入到微孔板中，2-8℃过夜或37℃2h，洗液洗去没有吸附到板上的蛋白，使用时每孔300μl洗液，反复洗3遍，拍干；完成包被的微孔板洗板拍干后，立即封闭；

将完成包被的微孔板按200μl每孔的量加入封闭液，2-8℃过夜或37℃2h封闭，封闭完成后，将封闭液甩掉，利于包被的微孔板密封长期保存。

作为优选，包被液是pH7.4且摩尔浓度为0.02mol/L的磷酸缓冲液(PB)；封闭液是含有质量体积浓度为5％的牛血清白蛋白(BSA)、质量体积浓度为1％的蔗糖、质量体积浓度为4％的明胶、体积浓度为0.2％的Proclin 300、pH7.4且摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

作为优选，当试剂空白的RLIV值应<30000，否则实验无效，需重复检验；每个阴性对照值E1应≤115000，E2≤300000，且两个阴性对照孔读数与阴性对照平均值之间相差≤10％，否则实验无效，需重复检验；每个阳性对照值E1应>241500，E2>630000，否则实验无效，需重复检验。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的试剂盒通过洗涤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开；再加入辣根过氧化物酶标二抗结合在固相载体上，再加入反应底物鲁米诺，鲁米诺在碱性环境下被辣根过氧化物酶氧化而处于激发态，当从激发态回到基态时，辐射出最大发射波长为425nm的光，酶促发光产生的光信号通过光电倍增管进行信号转换后得到相应的信号值，用RLIR(相对发光强度比值)表示，待测抗E1或E2抗体的浓度与化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系；由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法具有很高的敏感度。

本试剂盒可以对HCV感染者血清中的抗E1、抗E2抗体进行体外定性/定量测定，建立HCV感染者血清中抗E1、抗E2抗体的检测技术并进行方法学评价，该试剂盒可应用于丙型病毒性肝炎的筛查诊断、病情监测、预后评估、疾病机理和流行病学研究。

附图说明

图1为HCV的基因结构组成及编码的多聚蛋白。

图2为HCV结构蛋白和非结构蛋白结构3D图。

图3为抗包膜糖蛋白E1抗体的化学发光试剂盒的线性评价

图4为抗包膜糖蛋白E2抗体的化学发光试剂盒的线性评价

图5为抗包膜糖蛋白抗体的化学发光试剂盒示意图。

具体实施方案

丙型肝炎病毒HCV的基因组为单股正链RNA，全长约9.6kb，有7个基因型(1-7)和67个基因亚型，在我国以1b和2a基因型常见，HCV基因组由两端的5'非编码区(5'-NCR)、3'非编码区(3'-NCR)和中间的一个开放读码框(ORF)组成，ORF与5'-NCR下游紧邻，其基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能编码一个由3010～3030个氨基酸组成的多聚蛋白前体，如图1所示。在宿主细胞信号肽酶和病毒自身蛋白酶的作用下，裂解产生10种HCV蛋白，如图2所示，包括：3种结构蛋白，即核衣壳蛋白(Core)、包膜糖蛋白(E1，E2)、跨膜蛋白(P7)；6种非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。

目前国内外对抗包膜糖蛋白E1、E2抗体检测的化学发光免疫分析试剂盒及相关技术的研究尚属空白，国外有学者采用重组Core、E1、E2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白建立免疫印迹方法检测HCV感染者血清中相应蛋白抗体，结果表明：在HCV感染者中不同蛋白的抗体阳性率是存在差异的，我们分析可能与HCV感染者的不同病程进展、不同基因型、DAA治疗前后以及血清中存在循环免疫复合物有关。由于免疫印迹法的灵敏度不高，常规用于临床诊断丙型肝炎的试剂盒又都是采用HCV核衣壳区重组蛋白C-22、非结构蛋白NS3区重组蛋白C-200抗原、非结构蛋白NS4区重组蛋白C-200和NS5等作为混合包被抗原的第四代试剂来检测抗体，检测抗体的方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金方法等，但这些试剂盒只能检测HCV感染者血清中混合抗体，不能区分是何种蛋白成分的抗体，无法全面揭示单个HCV蛋白成分在HCV感染者的病情监测、预后评估和流行病学研究等方面的临床意义；如包膜糖蛋白E1刺激机体产生抗体(anti-E1)及循环免疫复合物(E1-IC)，在HCV感染者不同基因型及亚型、不同临床分期(慢性、肝硬化、肝癌)、抗病毒治疗前后是否存在差异？迄今为止，均未见相关报道。因此，建立检测HCV感染者血清中包膜糖蛋白E1、E2相应抗体或循环免疫复合物中相应抗体的高灵敏度检测方法用于HCV感染者病情监测、预后评估和流行病学研究具有重要意义。

本实施方案提供一种用于检测HCV感染者血清中抗HCV包膜糖蛋白抗体的CLIA定量试剂盒，用于体外辅助诊断或疾病机制研究，此检测试剂盒采用化学发光免疫分析法，基于ELISA间接法原理：

微孔内预先包被重组HCV包膜糖蛋白E1或E2抗原，受检标本血清中待测抗E1或E2抗体与固相载体表面的相应抗原结合。通过洗涤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入辣根过氧化物酶标二抗结合在固相载体上。再加入反应底物鲁米诺，鲁米诺在碱性环境下被辣根过氧化物酶氧化而处于激发态，当从激发态回到基态时，辐射出最大发射波长为425nm的光，酶促发光产生的光信号通过光电倍增管进行信号转换后得到相应的信号值，用RLIR(相对发光强度比值)表示，待测抗E1或E2抗体的浓度与化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法具有很高的敏感度。

一、制备检测抗包膜糖蛋白抗体的微孔板

1、抗原：微孔板用重组的HCV包膜糖蛋白E1、E2抗原包被，E1重组蛋白购自中国北京义翘神州生物技术有限公司(Sino BiologicalInc.)，规格100ug/支(干粉)，批号LCO8AU1802；E2重组蛋白购自以色列ProSpec-Tany基因技术有限公司，规格20ug/80ul，批号715PHCVE2；

2、微孔板：12×8(可拆)，采用固相载体为聚丙乙烯制成的96孔微孔发光板Nunc；微孔板Nunc购置美国Thermo Fisher公司。

3、稀释：将重组的HCV包膜糖蛋白E1或E2抗原(原始标定质量浓度为1mg/ml)采用包被液[pH7.4且摩尔浓度为0.02mol/L的磷酸缓冲液(PB)]稀释至0.5μg/ml；

4、包被：将稀释后重组的HCV包膜糖蛋白E1或E2抗原按照100μl量加入到微孔板中，2-8℃过夜(过夜时长为20-24h)，也可在37℃2h；

5、包被后洗板：洗去没有吸附到板上的蛋白，每孔300μl，反复洗3遍，拍干；其中，浓缩洗液(20×)是含有体积浓度为10％的吐温-20、体积浓度为4％的Proclin 300、pH7.4且摩尔浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，使用前按照1∶19的比例进行稀释成洗液(1×)，洗液(1×)是含有体积浓度为0.5％的吐温-20、体积浓度为0.2％的Proclin 300、pH7.4且摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，待用；

完成包被的微孔板洗板拍干后，要立即进行封闭，如果洗板后干燥时间超过半小时，包被抗原的活性会明显下降；

6、封闭：将完成包被的微孔板按200μl每孔的量加入封闭液[含有质量体积浓度为5％的牛血清白蛋白(BSA)、质量体积浓度为1％的蔗糖、质量体积浓度为4％的明胶、体积浓度为0.2％的Proclin 300、pH7.4摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)]，2-8℃20-24h，也可在37℃2h封闭；

7、封闭后甩板：将封闭液甩掉，利于包被的微孔板密封长期保存。

8、干燥：除去微孔板上残余的洗液，利于密封长期保存，如果是短期内使用，直接拍干就可使用，加入干燥剂置于2-8℃冷藏保存待用。

二、制备试剂盒

1、样本稀释液的制备：

样本稀释液是含有体积浓度为20％的牛血清、pH7.4且摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，其配制方法为：将200ml牛血清加入1L定容瓶内，再加入Na

2、阴性对照制备：

阴性对照为热灭活的非HCV感染者(抗E1和E2抗体阴性)血清或血浆，且人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒表面抗原测试呈阴性，含体积浓度为0.2％的ProClin 300防腐剂。

3、阳性对照制备：

阳性对照为热灭活的HCV感染者(抗E1和E2抗体阳性)混合血清或血浆，且人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒表面抗原测试呈阴性，含体积浓度为0.2％的ProClin300防腐剂。具体制备方法：收集HCV感染者混合血清或血浆(人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒表面抗原测试呈阴性)，采用U-Tube蛋白超滤浓缩(30KD)管(购置于德国默克，型号为：U-Tube 20-30)浓缩IgG抗体(50ml浓缩至10ml)，浓缩后的HCV感染者混合血清或血浆中加入体积浓度为0.2％的ProClin 300防腐剂。

4、洗液：

浓缩洗液(20×)是有体积浓度为10％的吐温-20、体积浓度为4％的Proclin300、pH7.4且摩尔浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲盐溶液，其配制方法为：向1L定容瓶内加入Na

5、酶标记物工作液制备

酶标记物工作液是用酶标记抗体稀释液将酶标记物原液稀释至质量浓度为0.05μg/ml(酶标记物原液是质量浓度为1mg/ml的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG标记物，酶标记物原液购自杭州隆基生物科技有限公司)，酶标记抗体稀释液是含有质量体积浓度为5％的牛血清白蛋白(BSA)、体积浓度为0.5％的酶稳定剂、体积浓度为0.1％的吐温-20、质量浓度为5μg/ml的抗鼠抗体阻断剂、质量浓度为1μg/L的红色色素、体积浓度为0.2％的Proclin300、pH7.4且摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，其配制方法为：向1L定容瓶内加入Na

6、底物液B：

底物液B是含有质量浓度为0.3g/L的过氧化脲、pH7.4且摩尔浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲液(PB)，其配制方法为：向1L定容瓶内加入Na

7、底物液A：

底物液A是含有质量浓度为0.8g/L的鲁米诺、质量浓度为0.008g/L的邻苯基苯酚、质量浓度为0.025g/L的4-咪唑苯酚、pH9.0且摩尔浓度为0.1mol/L的碳酸缓冲液(CB)，其配制方法为：向1L定容瓶内加入无水碳酸钠0.56g，无水碳酸氢钠7.96g，鲁米诺0.8g，邻苯基苯酚0.008g，4-咪唑苯酚0.025g，最后加入双蒸水定容至1L，溶液的pH＝9.0±0.1。配置好底物液A置2-8℃避光冷藏保存待用。

8、封板膜及自封袋(含干燥剂)。

9、每盒试剂如图5所示，由分别独立包装的样本稀释液、阴性对照、阳性对照、酶标记物工作液、底物液A、底物液B、洗液、检测抗包膜糖蛋白抗体的微孔板(96孔)、封板膜与自封袋(含干燥剂)等组成。

三、收集血清：采集静脉血收集血清，或用乙二胺四乙酸二钠盐或钾盐(EDTA)抗凝收集血浆，一周内进行检测的血清或血浆样本可于2～8℃存放，如需长时间，应置于-20℃，应避免反复冻融和交叉污染。

四、检测方法

1、准备

(1)将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温。

(2)将浓缩洗液按照1∶19的比例加入到去离子水或蒸馏水中，混匀备用。

2、检测

(1)加样：将用重组的HCV抗包膜糖蛋白抗原包被微孔板中固定于板架；每次检验设阴性对照2孔、阳性对照1孔，分别加入阴、阳性对照各100μl；设空白对照孔1孔，不加任何样本，

其余孔先加入样本稀释液100μl，再加入10μl待测样本，盖上封板膜，振荡混匀，37℃±1℃温度下温育30min，洗涤除去未结合的组分；

(2)加酶标记物工作液：除空白对照孔不加酶标记物工作液，其余孔内加入100μl酶标记物工作液；

(3)温育：盖上封板膜，振荡混匀，37℃±1℃温度下温育30min；

(4)洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置时间不超过60秒，弃去孔内洗液，重复洗5次后拍干；

(5)显色：每孔依次加入底物液B、底物液A各50μl，振荡混匀室温避光放置15分钟；

(6)检测：用化学发光免疫分析仪(TZD-CL-200S)测量每孔的相对发光强度值(RLIV)，计算每孔的相对发光强度比值(RLIR＝样本RLIV/阴性对照RLIV均值)，当样本RLIV与阴性对照RLIV均值的比值≥2.1时，为阳性；反之，为阴性。

(7)质量控制

①试剂空白值应<30000，否则实验无效，需重复检验。

②每个阴性对照值：E1应≤115000，E2≤300000，且两个阴性对照孔读数与阴性对照平均值之间相差≤10％，否则实验无效，需重复检验。

③每个阳性对照值：E1应>241500，E2>630000，否则实验无效，需重复检验。

五、检测仪器

半自动化学发光免疫分析仪(TZD-CL-200S，厦门天中达生物科技有限公司)

六、实验数据

1、精密度试验

批内不精密度：取已筛查到的高、低两个浓度样本，分别重复检测20次(孔)，计算RLIR均值和SD，计算批内CV％。

批间不精密度：取已筛查到的高、低两个浓度样本，每天上午、下午各检测1次，共进行10天20批次检测，计算RLIR均值和SD，计算批间CV％，结果见表1。

表1精密度实验统计结果及性能判断(n＝20)

由表1可知，批内变异系数CV％小于10％，批间变异系数CV％小于15％。

2、空白限和检出限

(1)空白限：选择5份未感染HCV受检者血清，每天测2批，共检测6天，记录RLIR值，共获得60个结果；按I类错误(α＝0.05)，即LoB有5％的可能性含有待测物；采用非参数检验将空白样品的结果由小到大排序，第95百分位数值即为空白限LoB，结果见表2。

表2空白样本测定结果(RLIR)

由表2可知，采用非参数方法估计空白样品测量结果第95百分位数，即第95百分位数的抗E1抗体、抗E2抗体结果分别为1.18RLIR和1.26RLIR。

(2)检出限

选择期望浓度为1～5倍LoB的血清标本5份作为低浓度样本，每天检测2次，连续测定6天，采用非参数分析法计算LoD；5个低浓度样本连续12次的测定，结果见表3，结果呈非正态分布，使用非参数程序估计LOD，即：LOD＝LOB+Ds.β，Ds.β是低浓度样品测定值中位数(M)和第5个百分位数值的差值。

表3系列稀释样本测定结果(RLIR)

由表3可知，抗E1抗体系列稀释样本检测值的中位数为3.64RLIR，D

3、线性

分析测量范围(AMR)：按EP6-A2文件要求进行设计，取未感染HCV受检者血清(低值L：抗E1抗体1.66RLIR，抗E2抗体1.55RLIR)和HCV感染者血清(高值H：抗E1抗体41.28RLIR，抗E2抗体19.46RLIR)，按照5L，4L+1H，3L+2H，2L+3H，1L+4H，5H的比例配制6份样本，每份标本检测2次取均值，以预期均值和实测均值分别为横坐标和纵坐标作回归分析，得到回归方程(见图3,4)：抗E1抗体y＝0.955X+0.4782，抗E2抗体y＝0.9763X-0.2601，三者b在0.95～1.05之间，相关系数r≥0.975(r2≥0.95)，则抗E1、E2抗体的分析测量范围分别为1.66-41.28RLIR和1.55-19.46RLIR，可参见图3和图4。

4、干扰实验

将类风湿因子、乙型肝炎病毒表面抗体、乙型肝炎病毒e抗体、梅毒螺旋体抗体、人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和(或)Ⅱ型抗体阳性的血清标本分别与抗E1(20.64RLIR)、抗E2(9.73RLIR)抗体阳性血清等量混合，同时以样本稀释液作对照，结果均无交叉反应。

5、实例应用

采用制备好的抗HCV包膜糖蛋白E1和E2抗体检测试剂，分别对HCV感染者(随机选取慢性HCV感染者45例)血清相应抗体进行检测，统计每个蛋白抗体在慢性HCV感染者中的阳性率，结果见表4。

表4慢性HCV感染者血清抗包膜糖蛋白E1、E2抗体阳性率调查

*注：采用厦门新创公司生产的抗HCV混合抗体筛查试剂盒。

由表4可知，抗包膜糖蛋白E1、E2抗体的阳性率(RLIR≥2.1为阳性)分别为：抗E1抗体35.56％(16/45)、抗E2抗体46.67％(20/45)。

6、最适酶标抗体浓度及抗原工作浓度的选择

(1)将酶标抗体50μl，100μl，150μl分别加入已包被的孔中，保温、洗涤，加发光底物后，读取RLIV，结果见表5。

表5酶标抗体工作量的选择(RLIV)

表5可知，加样量为50μl和100μl比较，对灵敏度影响较大而对阴性样本影响不大；加样量100μl和150μl相比，对灵敏度影响不大而对本底影响较大。50uI和100μl酶结合物的加样量都在包被的有效空间内发生作用，所以灵敏度呈较好的线性关系，本底也不受影响，而150μl酶加样量在包被板的有效空间之外，所以灵敏度影响不大，而酶结合物则有部分和未能完全封闭的的空白板非特异性吸附，造成本底高了很多。由此可知，抗E1、E2抗体检测试剂盒的最适酶结合物加样量为100μl。

(2)棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度

①包被液将抗原系列稀释(将抗原浓度为1mg/ml稀释为0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2ug/ml，4μg/ml后，按行进行包被2～8℃过夜、洗涤；

②将阳性对照、阴性对照加样，保温、洗涤；

③加按工作浓度稀释的酶标抗体，保温、洗涤；

④加底物显色，读取RLIV值。

表6包膜糖蛋白E1、E2抗原包被浓度比较(RLIV)

表6可以看出，抗原的包被浓度对包被结果影响比较大：在2-0.5ug/ml之间，吸附于包被板上的抗原均处于饱和状态，对结果影响较大；而继续往下稀释，则明显影响灵敏度，证明0.5ug/ml(1∶2000)处于抗原包被饱和的临界点，且以此包被浓度最为经济。