丹酚酸B或其药物可接受盐在制备抗SARS-CoV-2的药物中的应用

技术领域

本发明属于药学技术领域，具体涉及一种丹酚酸B或其药物可接受盐在制备抗SARS-CoV-2的药物中的应用。

背景技术

SARS-CoV-2属于冠状病毒的β属，是一种线性单链RNA病毒(ssRNA)。其基因组序列全长约30kb，共包含10个基因。分别是：ORF1ab、ORF1ab、S、ORF3a、E、M、ORF6、 ORF7a、ORF8、N、ORF10。SARS-CoV-2进入宿主细胞由跨膜刺突S糖蛋白(Spike protein， S)介导，其以三聚体的形式存在，每个单体由一个S1和一个S2亚基组成，S蛋白在宿主细 胞蛋白酶的作用下裂解成S1和S2，其中S1与宿主细胞的血管紧张素转化酶2(ACE2)结 合介导病毒的进入，S2亚基负责病毒和细胞膜融合。因此，S蛋白抑制剂可以阻止病毒进入 宿主细胞，S1和S2亚基可作为抗病毒药物筛选的靶点。目前没有针对SARS-CoV-2的特效 药，且无批准上市药物。

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)，为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，其根和根茎 皆可入药，依据已分离化合物的特征和理化性质，将其分为两类：脂溶性丹参酮类化合物与 水溶性酚酸类化合物。丹参水溶性酚酸类成分主要表现为抗氧化作用，丹酚酸B(Salvianolic acid B)是目前已知抗氧化活性最强的天然产物之一，能清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应， 同时它还可抑制血小板聚集，抑制血栓形成，对心、脑、肝、肾等器官具有重要药理作用。 虽然2013年，饶子和等在中国专利CN103127050A中公开了丹酚酸B在制备抗H5N1流感 病毒药物中的应用，但其机理在于丹酚酸B能够有效抑制H5N1流感病毒RNA聚合酶亚基 PAN蛋白的活性从而抑制H5N1流感病毒的复制，选取H5N1型流感病毒RNA聚合酶亚型 PA亚基N端核苷酸序列所表达的PAN蛋白作为靶标蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的抗病毒的药物。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：

本发明一方面提供了一种丹酚酸B或其药物可接受盐在制备抗病毒的药物中的应用，所 述丹酚酸B分子式为C

所述病毒包括HIV-1、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV；优选地，所述病毒为SARS-CoV-2。

本发明另一方面提供了一种丹酚酸B或其药物可接受盐在制备抑制病毒进入靶细胞的药 物中的应用，所述丹酚酸B分子式为C

所述病毒包括HIV-1、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV；优选地，所述病毒为SARS-CoV-2。

本发明再一方面提供了一种丹酚酸B或其药物可接受盐在制备抑制病毒S蛋白介导的病 毒-细胞融合的药物中的应用，所述丹酚酸B分子式为C

所述病毒包括HIV-1、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV；优选地，所述病毒为SARS-CoV-2。

本发明再一方面提供了一种丹酚酸B或其药物可接受盐在制备抑制病毒S蛋白S2亚基 的融合区域HR1、HR2形成六螺旋结构的介导的药物中的应用，所述丹酚酸B分子式为C

所述病毒包括HIV-1、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV；优选地，所述病毒为SARS-CoV-2。

本发明再一方面提供了一种抗病毒的药物组合物，其含有作为活性物质的丹酚酸B或其 药物可接受盐，所述丹酚酸B分子式为C

所述病毒包括HIV-1、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV；优选地，所述病毒为SARS-CoV-2。

本发明再一方面提供了一种抑制SARS-CoV-2进入靶细胞的药物组合物，其含有作为活 性物质的丹酚酸B或其药物可接受盐，所述丹酚酸B分子式为C

所述病毒包括HIV-1、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV；优选地，所述病毒为SARS-CoV-2。

本发明再一方面提供了一种抑制病毒S蛋白介导的病毒-细胞融合的药物组合物，其含有 作为活性物质的丹酚酸B或其药物可接受盐，所述丹酚酸B分子式为C

所述病毒包括HIV-1、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV；优选地，所述病毒为SARS-CoV-2。

本发明再一方面提供了一种抑制病毒S蛋白S2亚基的融合区域HR1、HR2形成六螺旋 结构的介导的药物组合物，其含有作为活性物质的丹酚酸B或其药物可接受盐，所述丹酚酸 B分子式为C

所述病毒包括HIV-1、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV；优选地，所述病毒为SARS-CoV-2。

进一步地，所述药物组合物为注射制剂或口服制剂；

进一步地，所述药物组合物为注射粉针剂、成方制剂片剂、成方制剂胶囊剂、成方制剂 丸剂或成方制剂滴丸剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次提出丹酚酸B或其药物可接受盐在制备抗SARS-CoV-2的药物中的应用，提 供新型冠状病毒感染者新的治疗手段，特别是针对动脉粥样硬化等心脑血管方面慢性基础疾 病的患者，该应用扩大了丹酚酸B的使用范围，且为抑制SARS-CoV-2感染，，特别是在全球 新冠病毒流行的情况下，可为治疗SARS-CoV-2感染所致肺炎(COVID-19)提供新的药物。

本发明丹酚酸B或其药物可接受盐作为抗病毒药物，实验表明：在体外培养细胞Vero-E6 感染模型上，丹酚酸B抗SARS-CoV-2活性的半数有效浓度EC

附图说明

图1为本发明实施例1中丹酚酸B在不同浓度时抑制SARS-CoV-2的抑制率曲线图，其 中横坐标代表丹酚酸B浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照，丹酚酸B对SARS-CoV-2的抑制率，并根据抑制率计算求出丹酚酸B抑制SARS-CoV-2的半数有效浓度EC

图2为本发明实施例2中丹酚酸B在不同浓度时抑制SARS-CoV-2S蛋白假病毒进入靶 细胞的抑制率曲线图，其中横坐标代表丹酚酸B浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照，丹酚酸 B抑制SARS-CoV-2S蛋白假病毒进入的抑制率，并求得丹酚酸B抑制SARS-CoV-2S蛋白假病毒进入的半数抑制浓度IC50值。

图3为圆二色谱(circulardi2chroism,简称CD)的扫描波长(横坐标)与摩尔圆周率(纵 坐标)曲线示意谱图，扫描波长范围为190-260nm。SARS-CoV-2S蛋白六螺旋核心区域多肽 HR1P、HR2P自发形成α-螺旋构像，谱为在208与222nm处呈现双负峰 (SARS-CoV-2-HR1P/HR2P)，给予标准浓度5μM的丹酚酸B后的曲线为 SARS-CoV-2-HR1P/HR2P+Sal-B 5μM。

图4为本发明实施例3中丹酚酸B对靶细胞Vero-E6细胞的存活率曲线图，其中横坐标 代表丹参素浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照、Vero-E6细胞在给予不同浓度丹酚酸B后的 细胞存活百分比。

图5为本发明实施例3中丹酚酸B对靶细胞293T/ACE2细胞的存活率曲线图，其中横坐 标代表丹酚酸B浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照、293T/ACE2细胞在给予不同浓度丹酚酸 B后的细胞存活百分比。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合附图和具体实施方法对本发明内容作进一步说 明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人 员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施 例的目的，不限制于本发明。

以下实施例主要通过构建SARS-CoV-2活毒与SARS-CoV-2S假病毒体外细胞感染模型， 来评价丹酚酸B的抗SARS-CoV-2感染活性，并确证丹酚酸B具有抗SARS-CoV-2感染的能力，同时具有抑制SARS-CoV-2进入靶细胞的过程，丹酚酸B抑制SARS-CoV-2进入靶细胞 是通过抑制SARS-CoV-2S蛋白S2亚基构象改变，从而抑制SARS-CoV-2S蛋白介导的病毒- 细胞融合。提供一种丹酚酸B在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用。

本发明采用的Vero-E6、293T细胞购自美国ATCC，稳定过表达人源SARS-CoV-2受体蛋白ACE2的293T细胞由本单位构建保存。

本发明实施例中采用的细胞生长培养液组成为：DMEM基础培养基，其中添加总体积 10％的胎牛血清和总体积1％的氨苄霉素/链霉素，培养液于4℃储存，使用前37℃水浴预热。

本发明实施例中采用的丹酚酸B购自上海陶素生化科技有限公司，纯度>99％。

本发明实施例中采用的SARS-CoV-2由武汉病毒研究所于感染者体内分离并扩增保存。

本发明实施例中假病毒包装质粒及其来源：假病毒包装骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-为南方 医科大学鉴定保存，已公开的优化后的全长SARS-CoV-2S蛋白核心质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke由上海复旦大学陆路教授惠赠。

本发明实施例中采用的荧光素酶检测试剂盒购自美国PROMEGA公司，包括荧光素酶底 物及细胞裂解液。

本发明实施例中采用的Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、Takara PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、Takara TB

药理实验部分

实施例1丹酚酸B体外对SARS-CoV-2的抑制活性检测

1、方法：

1)将对数生长期的Vero-E6细胞接种于48孔板，3*10^5个细胞/孔，37℃、5％CO

2)药物预孵：采用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基稀释药物。丹酚酸B初始浓度设置为200μM(溶剂为DMSO)，三倍倍比稀释药物，每个浓度药物设置3个复孔，共7 个药物梯度(200、66.67、22.22、7.41、2.47、0.82、0.27μM)，设置溶剂二甲基亚砜(DMSO) 作为对照组，对照组采用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基稀释，给予药物同体积的二 甲基亚砜。去除细胞上清后1)中48孔板中的实验组每孔加入100μl稀释后的药物，对照组 加入100μl稀释后的DMSO，置37℃孵育1h。

3)病毒感染：48孔板每孔加入5μl SARS-CoV-2病毒稀释液(感染复数MOI＝0.05)，并 置细胞于37℃继续孵育1h。

4)换液：充分去除感染物上清，细胞用200μl PBS洗一遍。重新在每孔加入200μl含对 应浓度药物的培养基，继续于37℃中培养24h后收取150μl细胞培养上清待测。采用qRT-PCR 测定上清中病毒的拷贝数，评价药物的抗SARS-CoV-2活毒的能力。

5)病毒RNA提取具体操作方法参照Takara MiniBEST Viral RNA/DNA ExtractionKit (Code No.9766)：

a)病毒的裂解：在150μl细胞培养上清中，加入50μl PBS(PH7.4)溶液补足至200μl。 随后加入200μl的Buffer VGB、20μl的Proteinase K和1.0μl的Carrier RNA，充分混匀，于 56℃水浴温浴10分钟充分裂解。向裂解液中加入200μl无水乙醇，充分吸打混匀。

b)将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离 心2分钟，弃滤液。

c)将500μl的Buffer RWA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

d)将700μl的Buffer RWB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。(Buffer RWB中已经加入了指定体积的100％乙醇)。沿Spin Column管壁四周加入BufferRWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

e)重复操作步骤d。

f)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。

g)将Spin Column安置于新的1.5ml RNase free collection tube上，在SpinColumn膜的 中央处加入30μl的RNase free dH

6)病毒RNA逆转录具体操作方法(参照Takara PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser，Code No.RR047A)：

a)去除基因组DNA反应：按如下成分于冰上配制反应混合液

将样品置于42℃反应2min。

b)逆转录反应体系：冰上配置

将样品置于37℃温育15min，然后置于85℃加热5sec。

7)采用qPCR检测病毒拷贝数：参照Takara TB

引物序列如下：

RBD上游引物(Forward Primer)：CAATGGTTTAACAGGCACAGG(SEQ ID NO：1)

RBD下游引物(Reverse Primer)：CTCAAGTGTCTGTGGATCACG(SEQ ID NO：2)

根据两步法PCR扩增标准程序，在ABI7500定量PCR仪上完成检测：

Stage 1：预变性、Reps：1个循环、95℃,30s；

Stage 2：PCR反应、Reps：40个循环、95℃,5s；

退火：60℃,30～34秒。

2、结果：如图1所示；

根据标准曲线，计算出每个样品的拷贝数。以DMSO组拷贝数作为参照，计算药物处理 组抑制率。再根据不同浓度药物处理组抑制率，运用Prism8.0软件，拟合出药物抑制率曲线， 并计算出丹酚酸B(Sal-B)抗SARS-CoV-2活性的半数有效浓度EC

实施例2丹酚酸B对SARS-CoV-2-S蛋白假病毒进入的抑制活性检测：

1、方法：

1)SARS-CoV-2-S蛋白(pNL4-3.Luc.R-E-pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke)假病毒包装：

对数生长期的HEK-293T细胞4*10^5个/ml，2ml每孔均匀接种于6孔板中。37℃、5％CO

pNL4-3.Luc.R-E- 1000ng

pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke 500ng

PolyJet 6μl

具体配制方法如下：pNL4-3.Luc.R-E-质粒与pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke质粒同时加入 到100μl空白DMEM培养基中混匀，PolyJet采用100μl空白DMEM培养基稀释混匀。将PolyJet稀释液加入质粒稀释液中并混匀，室温孵育15分钟，均匀的添加至HEK-293T细胞中，37℃培养48小时后收集上清病毒液，4000rpm离心10分钟，0.45μm无菌滤头过滤，即 得到SARS-CoV-2假病毒。

2)假病毒抑制实验：

药物与假病毒作用：取对数生长期过表达SARS-CoV-2受体ACE2的293T细胞(293T/ACE2)，按1*10

丹酚酸B初始浓度设置为20μM，给药前采用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基2倍倍比稀释8个浓度梯度(20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μM)，每孔60μl， 每个浓度3个复孔，设置DMSO溶剂对照组。将60μl假病毒加入稀释后的药物中，混匀室 温作用30分钟，取100μl/孔添加至ACE2/293T细胞中，37℃培养48小时。

检测：去除培养基，200μl/孔无菌PBS(PH7.4)洗涤细胞一次，每孔加入40μl 1X细胞 裂解液，室温震荡裂解15分钟。转移30μl/孔的裂解上清到96孔白色酶标板中，按照单荧光 素酶检测试剂盒说明书加等体积稀释后的荧光素酶底物，立即进行酶标仪检测荧光值，根据 荧光值大小，判断丹参素抑制病毒吸附进入的活性。根据荧光值与药物浓度的对应关系计算 抑制率，绘制曲线并计算丹酚酸B的半数抑制浓度IC

2、结果：如图2所示；

以DMSO溶剂组为对照，根据荧光值计算药物处理组的抑制率。再根据不同浓度药物处 理组抑制率，运用Prism8.0软件，拟合出药物抑制率曲线，并计算出丹酚酸B(Sal-B)抑制 SARS-CoV-2S蛋白假病毒进入靶细胞的半数抑制浓度IC

实施例3.丹酚酸B抑制SARS-CoV-2HR1P、HR2P形成六螺旋(6-HB)：干扰α-螺旋构象。

SARS-CoV-2感染过程中，SARS-CoV-2S蛋白S2亚基的HR1、HR2可自发聚合形成具有α-螺旋构象的六螺旋(6-HB)结构，从而促进病毒与靶细胞的膜融合，进一步促进病毒进入细胞。我们体外合成位于6-HB核心区域的HR1P、HR2P多肽，观察丹酚酸B是否作用于 6-HB。

SARS-CoV-2HR1P：ANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQ (SEQ ID NO：3)

SARS-CoV-2-HR2P：DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL(SEQ ID NO： 4)

圆二色谱(Circular Dichroism,CD)利用不对称分子对左、右圆偏振光吸光率的不同来分 析蛋白质二级构象(α-螺旋、β-折叠或无规则卷曲)，α-螺旋的CD波谱值在208nm和222nm 处有两个负峰，100％的α-螺旋在CD波谱222nm处显示-33000的吸收峰，所以一个蛋白分 子中α-螺旋结构的占比可通过Xα＝(-[θ]

1、方法：

1)样品准备：

HR1P及HR2P多肽采用50mM、PH 7.2的PBS溶液配制成10μM工作液。

体系配置：0.15μl标准浓度5mM的丹酚酸B加入150μl HR1P(10μM)，混匀，对照组采用150μl HR1P(10μM)与0.15μl DMSO混合，室温作用30分钟，加入150μl的HR2P(10μM)，室温继续孵育30分钟。

2)圆二光谱仪参数设置(静态图谱)：

检测温度:4℃、扫描波长范围:190-260nm、带宽:2nm、步进:1nm、每点时间:0.5秒。

3)样品检测：

将样品加入1mm光程比色皿，进行CD波长扫描，保存CD信号[θ]值，绘制CD曲线， 并根据[θ]

2、结果：如图3所示；

SARS-CoV-2HR1P与HR2P结合后形成α-螺旋，其CD波谱值(纵坐标)在208nm和222nm处有两个负峰。10μM的HR1P与HR2P结合α-螺旋百分比为60.67％，给予5μM的丹 酚酸B(Sal-B)后，HR1P、HR2P结合α-螺旋百分比降至22.24％。

实施例4丹酚酸B的细胞毒性检测

1、方法：

1)细胞接种：

处于对数生长期的Vero-E6、293T/ACE2细胞，调整细胞密度至1*10^4个/孔，分别以 100μL/孔接种于96孔板，37℃细胞培养箱中培养过夜。

2)药物浓度设计：

给药前用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基2倍倍比稀释8个浓度梯度。

Vero-E6细胞：初始浓度设置为200μM(200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625μM)， 取每孔100μL稀释后的药物分别加入1)中96孔板中的Vero-E6细胞中，每孔终体积200μL。 每个药物浓度设置3个复孔。以DMSO溶剂处理组为空白对照。

293T-ACE2细胞：初始浓度设置为100μM(100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625，0.78125μM)，取每孔100μL稀释后的药物分别加入1)中96孔板中的、293T-ACE2细胞中， 每孔终体积200μL。每个药物浓度设置3个复孔。以DMSO溶剂处理组为空白对照。

3)检测吸光度：

孵箱中培养48h后，每孔加入10μL CCK-8工作液，培养箱继续孵育3小时。酶标仪测定450nm处吸光度。

4)根据测得的OD值，分别计算与对照组相比，在各个浓度的药物的作用下，Vero-E6、 293T-ACE2细胞的存活率。

2、结果：如图4、5所示；

丹酚酸B(Sal-B)在200μM及有效浓度范围内对Vero-E6细胞无明显毒性作用。丹酚酸B (Sal-B)在100μM及有效浓度范围内对293T/ACE2细胞(图5)无明显毒性作用。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过 阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵 盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

中国科学院武汉病毒研究所

<120> 丹酚酸B或其药物可接受盐在制备抗SARS-CoV-2的药物中的应用

<130> CP120010256C

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caatggttta acaggcacag g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcaagtgtc tgtggatcac g 21

<210> 3

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser

1 5 10 15

Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn

20 25 30

Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln

35 40

<210> 4

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile

1 5 10 15

Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp

20 25 30

Leu Gln Glu Leu

35