基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法及其应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法及其应用。

背景技术

噬菌体是感染细菌等微生物的病毒的总称。噬菌体被发现伊始，就被成功地用于细菌感染性疾病的治疗。应用噬菌体预防和治疗细菌感染具有专一性、效率高和无明显副作用等优势。但是目前大规模推广应用的噬菌体产品依然很少，仍需要解决一系列技术问题，如细菌对噬菌体容易产生抗性、噬菌体覆盖℃不够和可能有毒力蛋白基因等。采用合成生物学方法和思路理性设计、合成人工噬菌体，有望解决上述噬菌体治疗中存在的问题。同时，如何高效快速的拯救噬菌体基因组也成为亟待解决的问题。

本申请的发明人在长期研发过程中，发现噬菌体基因组的常规拯救技术主要有电转化和化学转化，当噬菌体基因组比较大时(>40kb)，这两种拯救技术的转化效率低，不能有效用于噬菌体基因组的拯救。此外，L型细胞对革兰氏阳性菌噬菌体的拯救覆盖℃有限，且由于革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的转录和翻译机制之间存在巨大差异，革兰氏阴性菌的噬菌体无法用L型细胞进行拯救。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请提供一种基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法及其应用，噬菌体基因组能够在无细胞表达体系中表达、自组装，扩展了噬菌体基因组的拯救手段，使噬菌体基因组的拯救变得简单可行。

为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：提供一种基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法，该方法包括：建立无细胞表达体系，其中，无细胞表达体系至少包括：无细胞体系缓冲液、细胞抽提物以及Chi6试剂；将噬菌体基因组加入无细胞表达体系，以完成DNA复制、RNA转录和蛋白翻译，并自组装成具有活性的噬菌体颗粒。

其中，建立无细胞表达体系之前，该方法还包括：制备无细胞体系缓冲液；制备无细胞体系缓冲液，包括：配制第一液体；根据第一液体，配制第二液体，其中，第二液体至少包括：HEPES缓冲液、tRNA、辅酶A(CoA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide，NAD)、环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、亚叶酸(Folinic Acid)、亚精胺(Spermidine)、3-磷酸甘油酯(3-phosphoglyceride，3-PGA)、腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)、三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate，GTP)、三磷酸胞苷(Cytidine triphosphate，CTP)、三磷酸尿苷(Uridine triphosphate，UTP)；根据第二液体，配制第三液体，第三液体至少包括：HEPES缓冲液、tRNA、辅酶A(CoA)、NAD、环磷酸腺苷(cAMP)、亚叶酸(Folinic Acid)、亚精胺(Spermidine)、3-磷酸甘油酯(3-phosphoglyceride，3-PGA)、腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)、三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate，GTP)、三磷酸胞苷(Cytidine triphosphate，CTP)、三磷酸尿苷(Uridine triphosphate，UTP)、聚乙二醇、谷氨酸镁(Mg-glutamate)、谷氨酸钾(K-glutamate)、Tris、KOH、二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)；混合外切酶抑制剂Chi6正反链以及第三液体，PCR退火后，得到无细胞体系缓冲液。

其中，建立无细胞表达体系之前，该方法还包括：制备细胞抽提物；制备细胞抽提物，包括：孵育与收集菌体；根据菌体制备细胞抽提物。

其中，孵育与收集菌体，包括：将BL21 Rosetta2菌株涂布于Cm抗性平板，平板划线，孵育一段时间；挑取Cm抗性平板上的若干个单克隆至Cm+2 YT+P培养基，37℃，220rpm，孵育一段时间，得到菌液；按预设比例，将菌液转接至Cm+2 YT+P培养基中，37℃，220rpm，孵育一段时间；将S30B缓冲液置于冰上预冷，加入DTT，冰上处理一段时间；向若干个锥形瓶中加入Cm+2 YT+P培养基，将菌液转接至Cm+2 YT+P培养基中，37℃，220rpm，孵育至OD600在1.5-2.0之间，分装，离心收集菌体；向菌体中加入含DTT的S30B缓冲液，待菌体完全重悬，离心收集菌体；称量菌体的沉淀重量，并在液氮中保存，以终止细胞内反应。

其中，根据菌体制备细胞抽提物，包括：解冻菌体，加入S30A缓冲液；高压破碎，得到匀浆液；将匀浆液离心，以去除基因组DNA，分离获得第一上清液；孵育第一上清液，以使核糖体从RNA上结束分散出来，降解mRNA；将DTT加入到S30B缓冲液，混匀后加入孵育后的第一上清液中，离心，分离获得第二上清液；透析第二上清液，离心，液氮处理，保存。

其中，Chi6试剂的序列如下：

Chi6.fwd:TCACTTCACTGCTGGTGGCCACTGCTGGTGGCCACTGCTGGTGGCCACTGCTGGTGGCCACTGCTGGTGGCCACTGCTGGTGGCCA；

Chi6.rev:TGGCCACCAGCAGTGGCCACCAGCAGTGGCCACCAGCAGTGGCCACCAGCAGTGGCCACCAGCAGTGGCCACCAGCAGTGAAGTGA。

其中，建立无细胞表达体系，包括：混匀4倍浓度无细胞体系缓冲液、3倍浓度细胞抽提物以及Chi6试剂，于37℃孵育箱放置5分钟，以使Chi6充分结合且抑制细胞抽提物中的外切酶。

其中，噬菌体基因组至少包括：大肠杆菌T7噬菌体基因组和大肠杆菌T4噬菌体基因组。

其中，将噬菌体基因组加入无细胞表达体系之前，该方法还包括：获取噬菌体基因组；获取噬菌体基因组，包括：提供宿主菌、培养基、大肠杆菌T7/T4噬菌体液；取部分培养基温育后，将宿主菌接种至培养基中，孵育；向培养基中加入T7/T4噬菌体液，并加入剩余的培养基，孵育至液体澄清；分装，离心，分离获得第三上清液；混合第三上清液、NaCl以及PEG8000，孵育一段时间；取LB新鲜培养基，将孵育后的第三上清液与LB新鲜培养基混合，重悬，沉淀，清洗，得到重悬液体；在重悬液体中加入氯仿，离心分离得到第四上清液；向第四上清液中加入RNase和DNase，充分混匀，温育；冰上冷却后，加入预冷的噬菌体沉淀液，孵育，离心，去除上清液，重悬沉淀；加入蛋白酶K和SDS溶液，孵育后加入苯酚-氯仿混合溶液，轻柔混匀；离心，分离得到上层水相；向上层水相中加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，轻柔混匀；冰上放置，0℃离心，去除上清液；加入经过-20℃预冷的70％乙醇，0℃离心，去除上清液；用水溶解DNA沉淀，检测浓度后，-20℃保存。

为解决上述技术问题，本申请采用的另一个技术方案是：提供一种基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法在拯救大肠杆菌T7噬菌体和T4噬菌体基因组中的应用。

本申请的有益效果是：区别于现有技术的情况，本申请建立了无细胞表达体系，其中，无细胞表达体系至少包括：无细胞体系缓冲液、细胞抽提物以及Chi6试剂，其中，无细胞体系缓冲液中包含外源补充成份，将噬菌体基因组加入无细胞表达体系后，可表达相应的功能蛋白，并自组装成噬菌体颗粒。本申请的方法不需要噬菌体基因组突破细胞壁和细胞膜进入细胞内部的过程，克服了噬菌体基因组拯救的主要障碍，扩展了噬菌体基因组拯救的手段，使噬菌体基因组拯救变得简单可行。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。其中：

图1是本申请第一实施例提供的基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法的流程示意图；

图2是本申请第二实施例提供的基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法的流程示意图；

图3是本申请第三实施例提供的基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法的流程示意图；

图4是本申请第四实施例提供的基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法的流程示意图；

图5是本申请第五实施例提供的基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法的流程示意图；

图6是本申请的无细胞表达体系用于表达红色荧光蛋白(RFP)和绿色荧光蛋白(GFP)的表达结果；

图7是本申请的无细胞表达体系用于表达线性DNA的表达结果；

图8是本申请的无细胞表达体系用于T7噬菌体基因组的拯救结果；

图9是本申请的无细胞表达体系用于T4噬菌体基因组的拯救结果。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性的劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请的发明人在长期研发过程中，发现噬菌体基因组的拯救的主要障碍在于：细菌细胞壁和细胞膜的阻挡，目前常规的拯救手段(如电转化、化学转化或L-型细胞拯救技术)均为了让噬菌体基因组突破细胞壁和细胞膜，进入细胞内部，进而完成噬菌体基因组的基因表达、DNA复制和衣壳蛋白组装等，以繁殖出有活性的噬菌体颗粒。目前已发现的有尾科噬菌体基因组大小通常在16kb至735kb之间，且大部分大于40kb。常规的拯救手段(如电转化和化学转化)转化大于40kb的噬菌体基因组的效率低，不能有效用于噬菌体基因组的拯救。此外，L型细胞对革兰氏阳性菌噬菌体的拯救覆盖℃有限，且由于革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的转录和翻译机制之间存在巨大差异，革兰氏阴性菌的噬菌体无法用L型细胞进行拯救。

鉴于此，本申请提供一种基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法。如图1所示，该方法包括以下步骤：

S10：建立无细胞表达体系，其中，无细胞表达体系至少包括：无细胞体系缓冲液、细胞抽提物以及Chi6试剂。

S20：将噬菌体基因组加入无细胞表达体系，以完成DNA复制、RNA转录和蛋白翻译，并自组装成具有活性的噬菌体颗粒。

具体地，无细胞表达体系是一种高效、快速的体外合成蛋白手段，本实施例在细胞抽提物的基础上，加入含有外源补充成份的无细胞体系缓冲液以及Chi6试剂，其中，外源补充成份包括但不仅限于RNA聚合酶、氨基酸以及tRNA等，Chi6试剂可以使无细胞表达体系更高效率地表达噬菌体基因组，进而在体外实现噬菌体基因组DNA复制、RNA转录和蛋白翻译，且蛋白可自组装(self-assembly)成噬菌体颗粒。因此，不需要经过噬菌体基因组突破细胞壁和细胞膜进入细胞内部的过程，克服了噬菌体基因组拯救的主要障碍。

区别于现有技术的情况，本申请建立了无细胞表达体系，其中，无细胞表达体系至少包括：无细胞体系缓冲液、细胞抽提物以及Chi6试剂，其中，无细胞体系缓冲液中包含外源补充成份，将噬菌体基因组加入无细胞表达体系后，可表达相应的功能蛋白，并自组装成噬菌体颗粒。本申请的方法不需要噬菌体基因组突破细胞壁和细胞膜进入细胞内部的过程，克服了噬菌体基因组拯救的主要障碍，扩展了噬菌体基因组拯救的手段，使噬菌体基因组拯救变得简单可行。

在一实施例中，如图2所示，在步骤S10之前，该方法还包括以下步骤：

S30：制备无细胞体系缓冲液。

具体地，制备无细胞体系缓冲液具体包括以下步骤：

步骤1：根据下表1，分别配制多个试剂母液。

表1各试剂母液的浓度及称量

需要说明的是，表1中各个试剂作为外源补充成份。

步骤2：根据表2，将表1中的部分试剂母液配制成14倍浓度的能量生成母液。

表2

步骤3：根据表3，向14倍浓度的能量生成母液中添加表1中剩余的试剂母液，以配制成4倍浓度的无细胞体系缓冲液，并于-80℃下储存。

表3

步骤4：合成无细胞表达体系的外切酶抑制剂Chi6正反链(以下简称Chi6试剂)后，按10nM的最终浓度混合Chi6试剂和无细胞体系缓冲液，PCR退火，并于-20℃下储存。

在一实施例中，如图3所示，在步骤S10之前，该方法还包括以下步骤：

S40：制备细胞抽提物。

在一实施例中，如图4所示，步骤S40具体包括以下步骤：

S41：孵育与收集菌体。

S42：根据菌体制备细胞抽提物。

具体地，孵育与收集菌体具体包括以下步骤：

步骤1：取出-80℃保存的BL21 Rosetta2菌株，将BL21 Rosetta2菌株涂布于Cm抗性平板，平板划线，孵育过夜。

步骤2：挑取Cm抗性平板上的3-4个单克隆，接种至3mL的Cm+2YT+P培养基(37℃，预热30分钟)中，220rpm，37℃，孵育7.5小时。

步骤3：7.5小时后，取接种有BL21 Rosetta2菌株的Cm+2YT+P培养基100μL，与50mL的新鲜Cm+2YT+P培养基(37℃，预热30分钟)混匀，220rpm，37℃，孵育8小时。

步骤4：6小时后，将S30B缓冲液置于冰上预冷，DTT冰上溶化；7.5小时后，在13个1L的锥形瓶里加入300mL培养基(37℃，预热30分钟)；8小时后，接种2mL步骤3中的菌液到1L的锥形瓶，220rpm，37℃，孵育至OD600(稀释10倍检测OD)在1.5-2.0之间时，分装到200mL离心杯中，5000×g离心12分钟，并在4℃离心收菌。

步骤5：将2mL的1M浓度的DTT加入到1L的S30B缓冲液中。离心结束后，去除上清液。每个离心杯加入100mL的S30A缓冲液，使菌体完全重悬。于4℃下5000×g离心12分钟，去除上清液后，重复清洗一次。

步骤6：加入50mL的S30A缓冲液，重悬后，转移到预冷的50mL离心管中，于4℃下5000×g离心12分钟，用枪头完全吸干上清液，可再离心一次，并完全去除上清液，称量菌体的沉淀重量，将沉淀菌体在液氮中浸泡2分钟后，于-80℃保存1天，以终止细胞内反应。

其中，S30A缓冲液和S30B缓冲液的成分及其称量如表5所示。

表5

其中，S30A缓冲液的配制为:根据表5的成分及称量配制溶液后，用醋酸调节pH至7.7，高压灭菌，于4℃保存。在使用前，加入1M浓度的DTT，DTT的添加量为2mL/L；

S30B缓冲液的配制为:根据表5的成分及称量配制溶液后，用醋酸调节pH至8.2，高压灭菌，于4℃保存。在使用前，加入1M浓度的DTT，DTT的添加量为1mL/L。

具体地，根据菌体制备细胞抽提物具体包括以下步骤：

步骤1：将沉淀菌体解冻后，加入S30A缓冲液，其中，每1g沉淀菌体添加1mL S30A缓冲液，充分混匀。

步骤2：高压破碎上述菌体，900bar破碎5分钟，得到匀浆液。

步骤3：取出匀浆液置于50mL离心管中，于4℃下30000×g离心30分钟，以去除基因组DNA；取上清液置于50mL离心管，并于4℃下30000×g离心30分钟，分离得到上清液，并置于专用离心管(RNase和DNase free)中。

步骤4：于37℃孵育80分钟(黑暗环境，220rpm下摇动)，以使核糖体从RNA上结束分散出来，降解mRNA，孵育后，溶液变混浊。准备透析用品，将1mL的1M浓度的DTT加入到1L的S30B缓冲液中，混匀后，加到烧杯中，加入转子。

步骤5：于4℃下12000×g离心10分钟，取上清液置于透析袋中，于4℃下透析80分钟。

步骤6：取上清液至1.5mL离心管中，于4℃下12000×g离心10分钟。

步骤7：将步骤6中的上清液用液氮处理2分钟后，于-80℃保存。

其中，采用Brad for dassay检测步骤7的上清液的蛋白浓度，必须大于27mg/mL。

在一实施例中，上述Chi6试剂的序列如下：

Chi6.fwd:TCACTTCACTGCTGGTGGCCACTGCTGGTGGCCACTGCTGGTGGCCACTGCTGGTGGCCACTGCTGGTGGCCACTGCTGGTGGCCA；

Chi6.rev:TGGCCACCAGCAGTGGCCACCAGCAGTGGCCACCAGCAGTGGCCACCAGCAGTGGCCACCAGCAGTGGCCACCAGCAGTGAAGTGA。

在一实施例中，噬菌体基因组至少包括：大肠杆菌T7噬菌体基因组和大肠杆菌T4噬菌体基因组。

在一实施例中，如图5所示，在步骤S10之前，该方法还包括以下步骤：

S50：获取噬菌体基因组。

具体地，获取噬菌体基因组具体包括以下步骤：

步骤1：准备15mL宿主菌、1.6L培养基、15mL大肠杆菌T4/T7噬菌体液。

步骤2：取1.2L培养基温育至37℃，分4个瓶，按1％接菌，每瓶300mL培养基+3mL宿主菌，于37℃下孵育3小时。

步骤3：取剩余的0.4L培养基温育至37℃，在步骤2培养好的菌液中，按1％接种，每瓶各加入3mL大肠杆菌T4/T7噬菌体液和已预热的100mL新鲜培养基，摇匀后，重新分5个瓶，于37℃下孵育2-3小时，至菌液澄清。

步骤4：将菌液依次分装至50mL离心管中，于12℃下9000×g离心5分钟，得到两份(各为800mL)上清液。

步骤5：准备2个洁净瓶，各称量23.36g的NaCl和80g的PEG8000。

步骤6：将离心后两份800mL上清液与NaCl、PEG8000混匀，放入摇床轻轻摇动至完全溶解后，分装至50mL离心管中，于4℃孵育过夜或6到8小时。

步骤7：在该50mL离心管中分别加入40mL LB新鲜培养基，于4℃下12000g×g离心10分钟，分离上清液和沉淀，并用10mL LB新鲜培养基重悬离心管内的沉淀，再用10mL LB新鲜培养基清洗一次沉淀，分离沉淀及重悬液体。

步骤8：分别在两份重悬液体(约为40mL)中，各加入10mL氯仿，充分混匀，呈乳白色，静置10分钟分层后，10000×g离心10分钟，用取上清液至新的50mL离心管，需要说明的是，不要取到氯仿层及沉淀。

步骤9：每个离心管中分别加入160μL RNase和160μL DNase，充分混匀后，37℃温育30分钟。

步骤10：将步骤9的离心管置于冰上冷却10分钟，然后每个离心管中分别加入8mL预冷的噬菌体沉淀液，轻柔颠倒混匀后，置于冰上冷却1小时以上。

步骤11：于4℃下12000g×g离心15分钟，去除上清液后，用400μLtris(pH＝7.8)重悬沉淀。

步骤12：加入250μg/mL蛋白酶K以及50μL的10％SDS溶液，于37℃下孵育30分钟后，加入等体积的苯酚-氯仿混合溶液(苯酚：氯仿＝1：1)，轻柔混匀，呈现乳状液形式；

步骤13：12000r离心10分钟，将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的氯仿，轻柔混匀，12000r离心10分钟，将上层水相转移至新的离心管中。

步骤14：加入2倍体积的-20℃预冷无水乙醇，轻柔混匀，置于冰上冷却30分钟。

步骤15：于0℃下14000r离心10分钟，去除上清液；

步骤16：加入400μL经过-20℃预冷在70％乙醇，于0℃14000r离心10分钟，去除上清液。

步骤17：敞口，室温，静置5分钟后，用50μL水溶解DNA沉淀，检测浓度后，于-20℃保存。

在一实施例中，步骤S10具体包括：

根据表6建立10μL的无细胞表达体系，于37℃孵育箱放置5分钟，以使Chi6充分结合且抑制细胞抽提物中的外切酶。

之后根据表6的比例加入步骤S50获取的噬菌体基因组，以完成DNA复制、RNA转录和蛋白翻译，并自组装成具有活性的噬菌体颗粒。

表6

在步骤S20之后，在无细胞表达体系中加入红色荧光蛋白(RFP)质粒和绿色荧光蛋白(GFP)质粒，以测试无细胞表达体系的蛋白表达功能。30℃反应8小时后，通过荧光透射仪，可以直接观察到结果。其中，在无细胞表达体系中添加抗生素利福平抑制体系的RNA聚合酶，作为阴性对照。如图6所示，用PBS分别将反应体系稀释5倍后，仍可见明显的表达荧光。

如图7所示，由于噬菌体基因组线性化比例高，所以新制备的无细胞表达体系直接用于噬菌体拯救效率很低，而在无细胞表达体系中添加Chi6试剂以抵制体系外切酶活性，使无细胞表达体系能直接用于PCR产物，或性线DNA表达，但是表达线性化片段比质粒效果差。

如图8所示，用无细胞表达体系拯救T7噬菌体基因组，表达浓度为10

如图9所示，用无细胞表达体系拯救T4噬菌体基因组，在无细胞表达体系中加入完整的野生型T4噬菌体基因组(169kb)，30℃反应8小时后，点板观察结果：用不同的噬菌体基因组质量进行测试(0.25μg至2μg)，最低0.25μg即可成功拯救，DNA质量在1至1.5μg时，表达量最高，为10

本申请还提供一种基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法在拯救大肠杆菌T7噬菌体和T4噬菌体基因组中的应用。

可以理解的是，本申请基于无细胞表达体系的噬菌体基因组拯救方法还可以应用于其它噬菌体基因组的拯救，将相应的其它菌制备成相应的无细胞表达体系。

以上所述仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。