双歧杆菌低变应原GOS组合物及涉及来自德氏乳酸杆菌保加利亚亚种菌株的β-半乳糖苷酶的其提供方法

本发明涉及用于营养组合物的低聚糖领域、特别地涉及具有益生元特性的低聚糖。具有益生元特性的产品可以促进人类和/或动物胃肠道中的健康菌群。典型地，所述产品诱导增强的免疫功能和改善的矿物质(像钙、铁和镁)的吸收，这对于更年期女性、老年人和患有肠道功能紊乱的患者有益。

人类胃肠道(GIT)寄居有500-1000个栖息于结肠中的不同种系型的大细菌群体。其中，双歧杆菌物种是婴儿GIT中的主要微生物，对其宿主产生有益作用，尤其如免疫刺激、人类病原体抑制、维生素产生和抗癌活性(Harmsen,H.J.等人2000J PediatrGastroenterol Nutr[小儿胃肠病学与营养杂志]30:61-7；Casci,T.等人2007Human Gutmicroflora in Health and Disease:Focus on Prebiotics[健康与疾病中的人类肠道微生物区系：关注益生元],在Functional food and Biotechnology[功能性食品和生物技术](编辑Taylor和Francis)中,第401-434页)。具有“双歧杆菌(bifidogenic)”作用的产品特别增强肠道中双歧杆菌的生长。在婴儿中，双歧杆菌的富集使其与母乳喂养的婴儿的菌群更加相似，和/或可用于预防和/或治疗胃肠道中天然存在的菌群的任何紊乱。这些作用对临床患者和新生儿尤其有益。

众所周知的事实是，人乳除了提供婴孩茁壮成长所必需的营养素和能量外还含有不易消化的低聚糖(人乳低聚糖；HMO)。HMO促进小肠中微生物群(像双歧杆菌和乳酸杆菌)的定殖，从而建立肠道微生物区系，具有很多健康益处，包括对腹泻和感染的增加的抵抗力、使免疫系统成熟和刺激免疫系统活性。

还已知的是配方食品喂养的婴儿的肠道微生物区系与母乳喂养的婴儿的肠道微生物区系不同。通常，母乳喂养的婴儿的微生物群主要包含双歧杆菌，而配方食品喂养的婴儿的微生物群更多样化，其中双歧杆菌通常是主要物种，但也包含大量其他有益性较低的物种。据推测，这是由于婴儿配方食品中缺乏某些不易消化的HMO(其充当益生元并且因此有助于双歧杆菌微生物群)。

为了更好的双歧杆菌功效，大多数目前婴儿配方食品都含有低聚半乳糖(GOS)。GOS是碳水化合物组分，其是人类不易消化的，但已示出对双歧杆菌和乳酸杆菌具有促生长作用，因为所述双歧杆菌和乳酸杆菌能够发酵GOS。此外，已经作为针对IBD和IBS的潜在抗炎剂研究了GOS。在一些配方食品中，GOS与活肠道细菌结合以获得更好的双歧杆菌性(bifidogenicity)(合生素)，参见例如WO 00/33854。在过去的十年中，GOS在人类食物产品中的应用已经日渐增加，所述食物产品包括乳制品、糖替代品和其他营养或营养食品补充剂。

典型地，GOS的基本结构在还原端包括葡萄糖残基，所述残基典型地被最高达七个半乳糖残基延长(最高达8的聚合度(DP))。

在本领域中已经提出6'-半乳糖基-乳糖(6'-GL)是更重要的HMO之一。参见Newburg等人((2016),J.Nutri.[营养学杂志]146,358-367)，他们观察到初乳半乳糖基乳糖中表达的三种半乳糖基乳糖(3'-GL、4'-GL和6'-GL)减弱了人类肠道上皮细胞和人类未成熟肠道中的NF-κB炎症信号。这意味着半乳糖基乳糖可以用作人类初乳和早期乳中的强生理抗炎剂，有助于先天性免疫调节。

可以通过已知的化学方法生产GOS，但是合成它们的优选方法是酶方法。商业GOS制剂通常经由转半乳糖基化反应通过以下方式来生产：用来自不同来源(如真菌、酵母菌和/或细菌)的β-半乳糖苷酶(EC.3.2.1.23)对乳糖进行酶处理，产生具有不同链长的低聚物的混合物，导致形成包含约100种具有不同DP和键联的不同类型结构的混合物。β-半乳糖苷酶在许多微生物中产生，所述微生物如环状芽孢杆菌、米曲霉、马克斯克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、奇异掷孢酵母(Sporobolomyces singularis)和发酵乳酸杆菌。GOS的结构多样性取决于转半乳糖基化反应中使用的酶，以及反应条件，如pH、温度和酶剂量(Dumortier,V.等人，1990,Carbohydr Res[碳水化合物研究]201:115-23)。

β-半乳糖苷酶在其三维结构上不同，导致糖苷键的立体选择性和区域选择性。例如，典型地真菌物种(如曲霉菌)主要产生β1-6键(因此主要产生6'-GOS，其中3'-GOS和4'-GOS为次要的GOS组分)，而细菌(如芽孢杆菌)主要产生β1-4键(主要产生4'-GOS)。此外，由环状芽孢杆菌产生的β-半乳糖苷酶具有特别强的转半乳糖基化活性，并且因此，通过来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶制备的GOS在世界范围内商业化。自从其投放市场(1999年)以来，约1亿婴儿食用了包含通过环状芽孢杆菌制备的GOS的婴儿配方食品。它已被证明是安全成分，具有FDA承认的GRAS状态。此外，针对婴孩粪便微生物群组成的定群研究已经示出，喂食含GOS的IF的婴儿的粪便类似于母乳喂养的婴孩的粪便(Knol等人J Ped GastrNut[小儿胃肠病学与营养杂志]2005,40:36-42)。

然而，在过去的几年中，东南亚报告了少量的非常罕见的GOS相关过敏病例。研究已经示出，GOS中存在的某些低聚糖结构可在非常敏感的受试者中产生过敏反应(Chiang,W.C.等人(2012)J.Allergy Clin.Immunol.[过敏和临床免疫学杂志]130,1361-1367)。Kaneko等人(Biosc.Biotechnol.Biochem.[生物科学、生物技术和生物化学]2014,78,100-108)观察到通过用衍生自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶制剂处理乳糖产生的GOS可引起过敏反应，并且揭露过敏由两种四糖[Galβ1-4(Galβ1-4Galβ1-6)Glc、Galβ1-4Galβ1-4Galβ1-3Glc]引起。这些GOS过敏病例发生在已经具有特应性史的受试者中，意味着GOS过敏的主要诱因是别的东西。

本发明的诸位发明人旨在制造一种新颖的低聚糖组合物，其具有高GOS含量并且包含具有益生元和低变应原特性的希望的组合的GOS物种。特别地，他们寻求提供一种GOS制剂，所述GOS制剂具有增强的双歧杆菌特性(与在受试者中引起过敏反应的能力降低结合)，例如与通过环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶获得的GOS相比。

为此，他们开始筛选出许多产乳酸的细菌菌株，用于其在酶GOS制造中的应用。这导致鉴别出来自特定的德氏乳酸杆菌菌株的β-半乳糖苷酶，并提供一种包含GOS的新颖的低聚糖组合物，其特征尤其在于：(i)高GOS含量；(ii)高6'-GL含量；以及(iii)高含量的GOSDP6或更大。出人意料地，此组合物(在本文中也称为“L-GOS”)展现出强的双歧杆菌作用并且在BAT测定中没有可检测到的响应，这表明没有变应原性或非常低的变应原性。

因此，在一个实施例中，本发明提供了一种包含低聚半乳糖(GOS)的低聚糖组合物，其中：

(i)低聚半乳糖(GOS)含量为组合物总干物质的至少40重量％；

(ii)异乳糖含量为组合物总干物质的至少10重量％；

(iii)6'-半乳糖基-乳糖(6'-GL)含量为组合物中总GOS的至少30重量％；并且

(iv)总GOS的至少0.5重量％具有6或更大的聚合度(DP)。

如本文所用，术语“GOS”是指由1至7个半乳糖分子和1个葡萄糖分子作为还原端构成的不易消化的低聚糖。在一些情况下，可形成半乳二糖或支链GOS。然而，每当在本申请中提及相对于总GOS含量的给定低聚糖的含量、或基于干物质的GOS含量，均不将异乳糖包含在总GOS含量中。这是因为在历史上，在AOAC GOS确定(AOAC方法2001.02)中定义的定量HPLC测量中，异乳糖不能与乳糖区分开。因此，表述“按总GOS的重量计”或“基于干物质的GOS含量”是指包括6'-GL但不包括异乳糖的GOS-化合物。

其中，本发明的低聚糖组合物的特征在于当与通过转半乳糖基化获得的已知GOS组合物相比时，GOS含量较高。在一个实施例中，GOS含量为组合物总干物质的至少42重量％、优选至少44重量％、更优选至少46重量％并且最优选至少48重量％。在另一个实施例中，GOS含量为组合物总干物质的至少50重量％、优选至少55重量％、更优选至少60重量％。

如本文所提供的低聚糖组合物中的总GOS的至少0.5重量％具有6或更大的DP。这包括DP6、DP7、DP8和DP9中的一个或多个，优选至少DP6和/或DP7。如WO2008/041843中披露的，GOS五糖(本文也称为DP5)和GOS六糖(DP6)是有效的抗Ctx-B粘连剂(通过防止Ctx与其在靶细胞上的天然受体GM1结合)。因此，DP6的存在可有助于治疗或预防与霍乱毒素家族成员的粘附和/或摄取有关或由其引起的急性或慢性疾病、特别是腹泻疾病。此外，DP>5GOS组分的存在将主要由长双歧杆菌利用，所述长双歧杆菌是婴儿肠道微生物群中主要的双歧杆菌物种之一，因此不仅刺激了均衡的肠道双歧杆菌物种的生长(Barboza M等人,(2009)Applied and Environmental Microbiology[应用与环境微生物学]75:7319-7325)，而且使婴儿具有降低的流感和发烧的发生率(Namba等人(2010)Biosci Biotechnol Biochem.[生物科学、生物技术和生物化学]74:939-45)和较少的呼吸道感染(Puccio等人(2007)Nutrition[营养学]23:1-8)。

在一方面中，DP≥6含量为至少1重量％、优选至少1.5重量％。例如，DP6+DP7 GOS的含量是在0.8-3wt％的范围内，像1.0-2.5wt％或1.1-2.8wt％。还设想了具有更高DP6+DP7 GOS含量的组合物。例如，在纯化后，由于乳糖和单糖(像葡萄糖和半乳糖)的去除，GOS的重量百分比可能增加至1.5-2.0倍。因此，在一个实施例中，DP6+DP7 GOS的含量是在1.2-6wt％的范围内，像1.2-5wt％或1.4-4wt％。

异乳糖是类似于乳糖的二糖。它由通过乳糖的β1-6糖苷键而不是β1-4键联连接的单糖D-半乳糖和D-葡萄糖组成。它可能是由通过β-半乳糖苷酶的乳糖的偶然转糖基作用产生的。异乳糖是乳糖操纵子的诱导剂，所述诱导剂允许乳糖在大肠杆菌和许多其他肠细菌中运输和消化。当没有葡萄糖可用时，其存在对于诱导负责乳糖和GOS利用的β-半乳糖苷酶至关重要。因此，推测异乳糖是GOS的重要组分。本发明组合物的异乳糖含量为组合物总干物质的至少10重量％。在一个实施例中，异乳糖含量为组合物总干物质的至少12重量％、优选至少13重量％。典型地，异乳糖含量不超过GOS的20wt％，像最高达18、16或15wt％。

已知GOS三糖6'-半乳糖基乳糖具有刺激人类大肠中存在的双歧杆菌或乳酸杆菌生长的作用，并且因此被用于婴儿和老年人食品中，如用于改善肠运动或预防腹泻等的食品中。另外，已知半乳糖基乳糖具有通过促进大肠的行为来抑制皮肤衰老速率的作用，这被认为是通过改变大肠中的微生物区系(刺激肠有益细菌生长的作用)由平顺的肠活动诱导的，从而抑制皮肤衰老。本文提供的组合物的6'-半乳糖基-乳糖(6'-GL)含量为组合物中总GOS的至少30重量％。例如，其为至少32wt％、34wt％；36wt％，或至少38wt％。优选地，6'-GL含量为组合物中总GOS的至少40wt％、更优选至少42wt％、43wt％或44wt％。

如将理解的是，上文列举的特征(i)至(iv)的任何优选实施例可以彼此以任何组合进行组合。

在具体的实施例中，本发明提供了根据前述权利要求中任一项所述的低聚糖组合物，其中

(i)GOS含量为组合物总干物质的至少65重量％、优选至少70重量％；

(ii)异乳糖含量为组合物总干物质的至少12重量％；

(iii)6'-GL含量为组合物中总GOS的至少40重量％；并且

(iv)总GOS的至少1重量％是DP≥6。

本发明还涉及一种用于提供根据本发明的低聚糖组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)使乳糖进料与β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)接触；和(ii)允许低聚糖合成，其中所述β-半乳糖苷酶衍生自德氏乳酸杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubspecies bulgaricus)或德氏乳酸杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckiisubspecies lactis)。例如，所述方法包括使用β-半乳糖苷酶使乳清渗透物或乳糖经受酶转半乳糖基化。转半乳糖基化反应的条件是本领域已知的。例如，通过将选择的β-半乳糖苷酶添加到在50℃-60℃下的已预调节有所需pH的以干物质计至少40％(w/w)乳糖的乳糖悬浮液中来适当地进行GOS合成。所用的酶剂量在很大程度上取决于乳糖浓度、pH和温度。然而，所选择的酶剂量应足以在所选择的时间内澄清乳糖悬浮液。典型地，可以应用以下条件：

50％乳糖、pH 6.5、温度50℃、以及酶剂量3LU/克乳糖，反应时间至少48小时。

特别地，发现具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列(参见图7A)或与其具有至少90％同一性的序列的β-半乳糖苷酶能够提供本发明的低聚糖(特征为高GOS含量、强双歧杆菌特性和低变应原性)。这种酶在结构上不同于Vasiljevic等人(Lait 83(2003),453-467)使用的菌株中发现的那些酶，这可以解释以下事实：在其过程的任一个中均未检测到五糖或六糖的形成。

Vasiljevic等人使用的酶(DSM20081；异名：ATCC 11842)还被Nguyen等人使用(J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂志]2012,60,1713-1721)。同样在后一文献中，没有报道五糖或六糖的形成。

在一个实施例中，β-半乳糖苷酶具有与SEQ ID NO:1至少92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％相同的氨基酸序列。例如，所述酶示出与SEQ ID NO:1的至少99％、99.3％、99.5％、99.6％或99.8％的序列同一性。

只要维持β-半乳糖苷酶活性(活性可以在一定程度上变化)，氨基酸序列的差异是可接受的。只要满足条件，氨基酸序列的差异的位置就没有特别限定，并且差异可能出现在多个位置中。氨基酸序列的差异可能出现在多个位置中。优选地，通过在对于β-半乳糖苷酶活性不是必需的氨基酸残基中引起保守的氨基酸取代来获得等效蛋白质。术语“保守的氨基酸取代”意指氨基酸残基被具有侧链的具有相似特性的另一个氨基酸残基取代。

氨基酸残基根据其侧链分为几个家族，如碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)，β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。保守的氨基酸取代优选地是在一个家族中氨基酸残基之间的取代。在一个实施例中，等效酶具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，具有最高达6个、优选最高达5个、更优选最高达4个非保守的氨基酸取代。

具有上述氨基酸序列的用于本发明的酶易于通过基因工程技术制备。例如，通过编码本发明酶的DNA转化合适的宿主细胞(例如，大肠杆菌)。所述DNA可以具有与根据SEQID NO:2(参见图7B)的核酸分子相同或等同的核酸序列。本文中的“等同核酸序列”表示与根据SEQ ID NO:2的核酸序列部分不同的核酸序列，但是其中由所述序列编码的蛋白质的功能(本文中为β-半乳糖苷酶活性)基本上不受所述差异的影响。

蛋白质表达后，收集在转化体中表达的蛋白质，并且从而制备本发明的酶。根据预期用途适当处理收集的蛋白质。如此作为重组蛋白质获得的酶可以经受各种修饰。例如，可以通过使用载体产生重组蛋白质来获得由与任何肽或蛋白质连接的重组蛋白质构成的酶，已将编码所述酶的DNA与其他合适的DNA一起插入所述载体中。另外，可以进行用于引起糖链和/或脂质的加成或N末端或C末端加工的修饰。这些修饰允许例如提取重组蛋白质、简化纯化或增加生物学功能。

然而，在优选的实施例中，用于本发明方法的酶包含在内源性表达所述酶的微生物中。由于其节省了分离酶的工作，因此这允许更便宜和更容易的加工。微生物，例如德氏乳酸杆菌保加利亚亚种的菌株，可以为全细胞或其活性部分或组分使用，优选无细胞提取物。

能够产生用于提供本发明的低聚糖组合物的半乳糖苷酶活性的德氏乳酸杆菌保加利亚亚种的菌株已经以登录号DSM20080保藏。

由于上文概述的原因，口服根据本发明的低聚糖组合物可对人体或动物体具有各种有益作用。特别地，本发明的组合物可以在遍及整个小肠和大肠和/或其一个或多个部分(包括十二指肠、空肠、回肠和结肠)中提供其促进健康的作用。类似地，本发明的组合物还可以在遍及整个肠道和/或其部分(可以是相同或不同的部分)中提供其抗粘连和/或其双歧杆菌作用。

因此，本发明还提供了一种营养组合物，其包含如本文所披露的低聚糖组合物。如本文所用，“营养组合物”包括蛋白质、碳水化合物、脂质来源、一种或多种维生素、一种或多种矿物质等中的一种或多种。

因此，它也包括可能不具有蛋白质、脂质和/或碳水化合物来源的食品补充剂。如本文所用，营养组合物是指出于营养目的进入消化道的任何组合物或配制品，无论是固态、液态还是气态。因此，营养组合物可以是食品类或饮料类。

在一个实施例中，营养组合物包含蛋白质来源、脂质来源、碳水化合物来源、和根据本发明的低聚糖组合物。例如，营养组合物包含脂肪、蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质，所有这些以为目标或限定(人)群体提供唯一的营养来源的种类和量进行选择。营养组合物优选选自由以下组成的组：婴儿配方食品、较大婴儿配方食品(follow-up formula)、成长乳(growing-up milk)、乳制品、谷物产品和医学营养产品。可以作为经口(例如，饮料、食品或类似补充剂的形式)和通过插管二者摄取的肠内配方食品获得医学营养产品。

在一方面中，营养组合物是为0至6个月大、3至6个月大、6至9个月大或9至12个月大的婴儿配制的婴儿配方食品。用作基础配方食品的婴儿配方食品包括任何已知的即食婴儿配方食品或适合用于婴儿的任何营养配方食品，条件是此种配方食品是具有在本文限定的范围内的卡路里密度和重量摩尔渗透压浓度值的唯一营养来源。许多不同来源和类型的碳水化合物、脂肪、蛋白质、矿物质和维生素是已知的，并且可用于本文的基础配方食品中，条件是此类营养素与所选配制品中添加的成分相容，并且另外适合用于婴儿配方食品。适合用于本文基础配方食品的碳水化合物可以是简单或复杂的、含乳糖的或无乳糖的或其组合，其非限制性实例包括水解的、完整的、天然和/或化学修饰的玉米淀粉、麦芽糖糊精、葡萄糖聚合物、蔗糖、玉米糖浆、玉米糖浆固体、稻或马铃薯衍生的碳水化合物、葡萄糖、果糖、乳糖、高果糖玉米糖浆以及另外的难消化的低聚糖(如低聚果糖(FOS))及其组合。特别优选的是以下婴儿配方食品，所述婴儿配方食品包含唾液乳糖和本发明的包含GOS的低聚糖组合物的组合。

适合用于本文基础配方食品的蛋白质包括水解的、部分水解的和非水解的或完整的蛋白质或蛋白质来源，并且可以衍生自任何已知或另外合适的来源，如乳(例如酪蛋白、乳清、人乳蛋白质)，动物(例如肉、鱼)，谷物(例如稻、玉米)，植物(例如大豆)或其组合。在一个实施例中，本发明的组合物包含乳清组分，所述乳清组分包含乳清蛋白质a-乳白蛋白(a-LA)和酪蛋白巨肽(CMP)，其中a-LA与CMP的重量比是<2。

用于本文的蛋白质还可以包括已知或以其他方式适合用于婴儿配方食品的游离氨基酸，或全部或部分被其替代，其非限制性实例包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、肉碱、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、牛磺酸、酪氨酸、缬氨酸及其组合。这些氨基酸最典型地以其L-形式使用，尽管当营养上等效时也可以使用对应的D-异构体。外消旋或异构体混合物也可以使用。

根据本发明的组合物中的脂质来源可以是适合用于(儿童)营养产品中的任何类型的脂质或脂质的组合。合适的脂质来源的实例是甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯，磷脂，鞘脂，脂肪酸，及其酯或盐。脂质可以具有动物、植物、微生物或合成源。特别令人感兴趣的是多不饱和脂肪酸(PUFA)，如γ-亚麻酸(GLA)、二高γ-亚麻酸(DHGLA)、花生四烯酸(AA)、十八碳四烯酸(SA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)和共轭亚油酸(CLA)。CLA在保护免于儿童湿疹和呼吸道疾病上是重要的。这特别涉及CLA的顺式9、反式11和顺式12异构体。合适的植物脂质来源的实例包括葵花油、高油酸葵花油、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、大豆油等。动物源的合适脂质来源的实例包括乳脂，例如无水乳脂(AMF)、乳酪等。在优选的实施例中，使用乳脂和植物源的脂质的组合。

适合用于营养组合物的维生素和类似的其他成分包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、硫胺素、核黄素、吡哆醇、维生素B12、烟酸、叶酸、泛酸、生物素、维生素C、胆碱、肌醇、其盐和衍生物、及其组合。合适的矿物质包括钙、磷、镁、铁、锌、锰、铜、铬、碘、钠、钾、氯化物、及其组合。

鉴于本发明的低聚糖组合物的出人意料地低的变应原性，本发明还提供了一种营养组合物，其包含(i)本发明的低聚糖组合物和(ii)至少一种选自由以下组成的组的另外的成分：低变应原的或非变应原的蛋白质来源，优选非变应原的乳蛋白水解物，游离氨基酸，益生菌，脂质来源和碳水化合物，如乳糖、蔗糖、淀粉或麦芽糖糊精。

低变应原的或非变应原的蛋白质来源是本领域已知的，特别是用于婴儿配方食品中。在一个实施例中，至少一种另外的低变应原的或非变应原的成分选自非变应原的蛋白质水解物和基本上不含变应原的蛋白质的水解物、低变应原的蛋白质来源、和水解的乳清蛋白质。如本文所用的术语非变应原的水解物和基本上不含变应原的蛋白质的水解物是可互换的。它们是指可施用于对饮食蛋白质(更特别是牛乳蛋白质)具有不耐受的婴儿而不会引起过敏反应的蛋白质水解物。例如，US 5,039,532披露了水解的乳清蛋白质材料，未从其去除由α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白组成的变应原，并且其中包括水解的变应原的水解的蛋白质材料呈具有的分子量不超过10,000Da的水解残基形式，使得水解的材料基本上不含变应原的蛋白质和蛋白质源的变应原。在一个实施例中，包括具有最大3000Da的肽的低变应原的酪蛋白水解物。

在具体的实施例中，所述组合物用于施用于有发生过敏、尤其是牛乳蛋白质过敏(CMA)风险的受试者、特别是婴儿。已知有发生过敏风险的婴儿包括由至少父母之一患有或曾患有特应性病症(例如湿疹)和/或过敏症(最特别是CMA)的父母生的婴儿。

考虑到本文提供的低聚糖组合物的出乎意料的双歧杆菌特性，本发明还涉及根据本发明的低聚糖组合物或营养组合物在促进肠道微生物群平衡和健康的方法中的用途，所述方法包括向需要此种治疗的个体施用有效量的低聚糖组合物或营养组合物。因此，还提供了用于促进肠道微生物群平衡和健康的方法，所述方法包括向需要此种治疗的个体施用有效量的根据本发明的低聚糖组合物或营养组合物。例如，促进肠道微生物群和健康可以包括增强肠道中的双歧杆菌微生物。在一个实施例中，促进肠道微生物群平衡和健康包括改善患者对导致胃肠道病症的各种医学治疗的耐受性，此类治疗包括放射疗法、化学疗法、胃肠外科手术、麻醉、施用抗生素、镇痛药或腹泻治疗。

本发明还提供了根据本发明的低聚糖组合物或营养组合物作为益生元组合物、优选作为双歧杆菌组合物的用途。本发明的还另一个实施例涉及一种用于生产双歧杆菌婴儿食品或营养食品的方法，所述方法包括将根据本发明的低聚糖组合物添加至选自由以下组成的组的一种或多种组分中：脂肪、碳水化合物、矿物质、微量元素和维生素。

除了本发明的双歧杆菌低聚糖组合物以外，所述组合物还可包含另外的益生元以及益生元化合物、特别是纤维和蛋白质。纤维特别包括可溶和不可溶的不易消化的多糖，如(纤维素、半纤维素和其他类型的)非淀粉多糖，抗性淀粉，树胶等。特别优选的是，本发明的组合物包含其他不易消化的低聚糖，所述低聚糖通常是可溶的，如低聚果糖(FOS)、低聚木糖(XOS)和低聚甘露糖。这些其他低聚糖优选地从天然来源获得，通过直接提取，例如在菊粉(FOS)的情况下，或者通过合适的多糖或多糖混合物的水解，例如在菊粉和果聚糖(FOS)、以及木聚糖和其他半纤维素成分(XOS)的情况下。其他低聚糖的量相对于不易消化的低聚糖的总量可以例如从10％至400％变化。

在一个实施例中，所述组合物进一步包含一种或多种人乳低聚糖(HMO)。HMO是本领域技术人员众所周知的。在优选的实施例中，所述组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的HMO：2'-FL(2'-岩藻糖基乳糖)、3-FL(3-岩藻糖基乳糖)、3'-SL(3'-唾液乳糖)、6'-SL(6'-唾液乳糖)、LNT(乳-N-四糖)和LnNt(乳-N-新四糖)。

所述组合物还可有利地包含益生菌有机体，例如至少10

附图说明

图1：(小图A)参考GOS+6'-GL和(小图B)本发明的代表性L-GOS组合物的HPLC色谱图。对于峰鉴别，参见表1。

图2：通过菌株RFC-219、RFC-227、RFC-302的全细胞合成的GOS Dionex模式的比较。

图3：通过使用乳酸杆菌菌株RFC227的无细胞提取物和全细胞的GOS特征曲线(profile)的比较。

图4：使用本发明的L-GOS、糖对照或参考GOS1和2作为MRS培养基中唯一的碳来源的5种粪便双歧杆菌生长的比较。小图A：发酵7小时后。小图B：发酵24小时后。

图5：如通过嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c的表达测量的4名测试受试者(小图A-D)中的嗜碱性粒细胞活化(MFl＝平均荧光)。研究中包括不同浓度的测试组合物(L-GOS)和参考组合物(vGOS)。对于细节，参见实例5。

图6：如通过嗜碱性粒细胞活化标记物CD36的表达测量的4名测试受试者(小图A-D)中的嗜碱性粒细胞活化(MFl＝平均荧光)。研究中包括不同浓度的测试组合物(L-GOS)和参考组合物(vGOS)。对于细节，参见实例5。

图7：用于本发明的示例性β-半乳糖苷酶的(小图A)氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和(小图B)核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。

实验部分

实例1：从乳酸杆菌制备β-半乳糖苷酶

在MRS培养基中接种三种选择的内部乳酸杆菌测试菌株RFC 219、RFC 227和RFC302，并使其生长至约1.0的在600nm处的光密度(O.D.

通过在6000rpm和18℃下离心发酵液10分钟来收获全细胞。倾析发酵液后，通过将全细胞重复分散在软化水中并离心来进行两个洗涤步骤，目的是去除任何不溶的残留物。

将获得的湿全细胞以10％(w/w)的比率分散在pH 6.5的10mM柠檬酸钠缓冲液中。将全细胞分散液直接用于GOS合成(全细胞)，或者通过迷你珠磨式组织研磨器(min-beadbeater)(Biospec Product公司)使用0.1mm玻璃珠以最高速度破坏(无细胞提取物)。

由于均化过程期间的热量产生，因此均化过程需要在60秒后停止。随后，在重复第二轮均化过程之前，将全细胞样品通过浸入冰水浴中冷却至0℃。

通过离心去除第二轮均化后的细胞碎片，并且将无细胞提取物(上清液)直接用于GOS合成而无需任何进一步处理。

实例2：GOS酶合成

GOS合成在以下条件下进行：

将27克乳糖晶体(28.42克

在测定中，从乳糖浆液开始，在与上述相同的条件下但为上述规模的1/4的反应混合物中通过澄清时间预先确定所需的酶活性的量。随后，使用以下方程式估计酶制剂的活性，所述酶是基于参考酶Biolacta N5(Amano)制备的：

酶剂量(单位/克乳糖)＝36.77*(澄清时间(小时)^-0.549。

对于全细胞，对于RFC227，酶剂量计算为2.95LU/克乳糖，对于RFC219，酶剂量计算为3.3LU/克乳糖，并且对于RFC302，酶剂量计算为4.4LU/克乳糖。如本领域技术人员已知的，可以通过在反应的任何时刻添加更多的酶以便促进反应来缩短反应时间。

实例3：GOS组合物的表征

在分析型CarboPac PA-1柱上通过Dionex HPAEC-PAD色谱法(van Leeuwen等人,Carbohydrate Research[碳水化合物研究]2014,400:59-73)分析不同低聚糖的含量。通过峰百分比估计GOS含量。此方法的有效性通过商业

通过使具有6'-GL标准物的参考GOS达到峰值来鉴别6'-GL组分。如图1A所示，6'-GL为峰6。以相同的方式，L-GOS中的峰6也被鉴别为6'-GL(参见图1B)。

L-GOS中的6'-GL含量由总GOS(不包括异乳糖)的6'-GL的峰百分比计算，如表1所示。

表1L-GOS的组成及其6'-GL含量

为了确定GOS聚合度(DP)，在来自菲罗门公司(Phenomenex)的Rezex RSO柱上使用离子交换色谱法分离低聚糖，所述柱对低聚糖具有高分辨率直至约DP18(聚合度)。在柱上分离后，使用RI检测器测量不同的组分。此检测器能够基于折射率检测化合物。各个DP百分比是通过相应的峰百分比来计算的。表2示出了与参考组合物

表2L-GOS和

用3种全细胞获得的GOS特征曲线描绘在图2中，所述图示出用3种酶制剂中的每一种合成的GOS特征曲线实际上是相同的，表明与这3种乳酸杆菌菌株相关的β-半乳糖苷酶在功能上是相同的。

鉴于这种相似性，仅用菌株RFC219的全细胞和无细胞提取物进行后续实验(在与上述相同的条件下使用的3.3LU/克乳糖的酶剂量下，除了乳糖浓度为50％(w/w))。菌株RFC219是德氏乳酸杆菌保加利亚亚种。从RFC219获得的β-半乳糖苷酶具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在29h、36h、53h和65小时的反应时间取2.0ml样品的等分试样，并通过添加1.5％的1.5M HCl(v/v)使其失活。表3和图3中分析和总结了GOS组成和指纹特征曲线。不出所料，通过使用全细胞或分离的无细胞酶的GOS特征曲线完全匹配，表明酶动力学是相同的。

表3通过Dionex HPAEC-PAD的GOS含量和糖分析

GOS＝100-半乳糖％-葡萄糖％-异乳糖％-乳糖％-乳果糖％(AOAC方法)

实例4：GOS组合物的双歧杆菌作用

使用Rodriguez-Colinas等人的公开方法(2013,Appl.Microbiol.And Biotechn.[应用微生物学与生物技术]第97卷,第5743-5752页)来进行通过去除单糖的GOS部分纯化。

使用婴孩粪便以建立的体外模型对具有表2所示组成的部分纯化的GOS制剂(“L-GOS测试组合物”)测试其双歧杆菌作用。

表4：部分纯化的L-GOS的组成

使用TIM-2模型(结肠TNO体外模型(TIM-2)，Venema K.(2015),The TNO In VitroModel of the Colon(TIM-2)[结肠TNO体外模型(TIM-2)],在：Verhoeckx K.等人(编辑)，The Impact of Food Bioactives on Health[食品生物活性物质对健康的影响].Springer,Cham中)评估了GOS的双歧杆菌作用，所述模型能够模拟通过人类中回盲肠瓣的材料。通过食品注射器将微生物群进料到系统中，所述食品注射器包含模拟的回肠流出物培养基(SIEM)。

通过来自6名健康婴儿(1-6个月大，用瓶喂养并且在捐赠前至少一个月不使用抗生素)的粪便捐赠来建立用于本发明的此模型中使用的微生物群。此外，所有婴孩主要是用瓶喂养的。由于婴孩4的粪便不包含任何可检测到的双歧杆菌活性，因此将此样品从测定中撤出。

使用的标准培养基包含以下组分(g)：果胶(9.4)、木聚糖(9.4)、阿拉伯半乳聚糖(9.4)、支链淀粉(9.4)、酪蛋白(47.0)、淀粉(78.4)、吐温80(34.0)、细菌蛋白胨(47.0)和牛胆汁(0.8)。透析液包含(每升)：2.5g K

为了确定双歧杆菌作用，总碳水化合物被糖对照、本发明的L-GOS测试组合物或参考组合物GOS1和GOS2等效地取代。糖对照是相当于单糖的糖组合物(对应的纯化的GOS制剂中存在的半乳糖和葡萄糖加乳糖)的组合物。GOS1和GOS2分别是指用来自长双歧杆菌的β-半乳糖苷酶制备的GOS和商业产品

在7小时(图4A)和24小时(图4B)之后分析双歧杆菌的生长速率。

如图4所示，当与糖对照或参考组合物GOS1和2相比时，本发明的L-GOS组合物能够最有效地刺激5个婴孩的粪便的生长。

实例5：本发明的低聚糖组合物的低变应原性

此实例证明了在具有已知的低聚半乳糖过敏的四个人类受试者中本发明的低聚糖组合物的降低的变应原性。通过使用来自菌株RFC227无细胞提取物的β-半乳糖苷酶的转半乳糖基化获得的L-GOS，以及使用环状芽孢杆菌酶获得的商业GOS参考制剂(vGOS)包含在测试中。

如Soh等人(Allergy[过敏]2015,70,1020-3)所述，从先前针对新加坡特应性群体中GOS过敏患病率进行研究的队列中选择合适的受试者。

对患者血液样品进行了嗜碱性粒细胞活化测试(BAT)。为此，将肝素化的外周血等分试样(100μL)在37℃下预温育5分钟，并且然后用100μL的PBS(阴性对照)、抗IgE抗体(阳性对照，G7-18；加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,Calif))或稀释的GOS样品温育15分钟(37℃)。温育后，将细胞在PBS-EDTA(20mmol/L)中洗涤，并且然后用藻红蛋白标记的抗人IgE(Ige21；eBioscience公司,圣何塞,加利福尼亚州)、生物素标记的抗人CD203c(NP4D6；百进生技公司(BioLegend),圣何塞,加利福尼亚州)和荧光素异硫氰酸酯标记的抗人CD63(MEM-259，百进生技公司)mAb在48℃下温育20分钟。CD203c和CD63的表达都是嗜碱性粒细胞活化的标记物。

用1％BSA/PBS洗涤细胞后，添加别藻蓝素-偶联的链霉亲和素(BD生物科学公司)，并在48℃下温育15分钟。此后，用2mL的FACS裂解液(BD生物科学公司)使样品经受红细胞裂解。然后洗涤细胞，将其再悬浮于1％BSA/PBS中，并通过FACSCalibur(BD生物科学公司)进行分析。基于侧面散射特征和IgE表达(IgE高)检测嗜碱性粒细胞。

与参考GOS组合物相比，用本发明中使用的菌株的乳酸杆菌酶制备的L-GOS在BAT测试中不引起阳性反应，如通过活化标记物CD203c(图5)和CD63(图6)的表达非常低或几乎没有表达来证明。

实例6：乳酸杆菌酶基因和蛋白质序列的确定

尝试确定编码由三株德氏乳酸杆菌菌株产生的β-半乳糖苷酶的基因序列。

在如上所述在MRS液体培养基中培养细菌，以达到约1.0的OD。用此生物质直接进行DNA提取。所使用的DNA提取方案主要基于Zymo Research Bacterial公司/微型真菌DNA制备型试剂盒(Fungal DNA microPrep kit)D6007的使用。通过Illumina HiSeq2500分析获得的DNA样品。

FASTQ序列读段的质量分析

使用Illumina HiSeq2500系统生成双端(Paired-end)序列读段。使用bcl2fastq2版本2.18生成FASTQ序列文件。初始质量评估基于Illumina Chastity过滤合格的数据。随后，使用内部过滤方案除去包含PhiX对照信号的读段。另外，对包含(部分)接头的读段进行了剪裁(直到50bp的最小读段长度)。第二质量评估使用FASTQC质量控制工具版本0.11.5、基于其余读段进行。

从头组装

●组装

使用SPAdes版本3.10基因组组装工具包中的读段错误校正模块BayesHammer提高FASTQ序列的质量(Bankevich A等人(2012)J Comput Biol.[计算生物学杂志]19:455-477)使用SPAdes将高质量的读段组装为重叠群。用Pilon(Walker BJ等人(2014)PLOS ONE[公共科学图书馆]9(11):e112963)版本1.21校正了Illumina数据和重叠群序列之间的错配和核苷酸不一致。

●形成长读段

将重叠群连接并获得长读段(scaffold)，其中使用双端和/或配对(matepair)读段之间的插入片段大小估计取向、顺序和它们之间的距离。已使用SSPACE PremiumScaffolder版本2.3

(Boetzer等人2011)进行了分析。

●自动空位关闭

使用GapFiller版本1.10(Boetzer和Pirovano,2012)，以自动方式(部分)关闭长读段内的空位区域。所述方法利用了双端和/或配对读段之间的插入片段大小。

使用DNA注释工具对获得的基因组序列进行注释：“ClustalW”(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)，DNA到蛋白质的转化是在离线包(“sms2”，从http://www.bioinformatics.org/sms2/下载)中完成的。

获得的代表性β-半乳糖苷酶的氨基酸序列和核苷酸序列分别示于图7A和7B中。