公开/公告号CN112618548A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-04-09
原文格式PDF
申请/专利权人 上海交通大学医学院附属瑞金医院;上海市内分泌代谢病研究所;
申请/专利号CN202011536825.7
申请日2020-12-23
分类号A61K31/498(20060101);A61P5/16(20060101);A61P37/02(20060101);
代理机构31233 上海泰能知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人宋旭;宋缨
地址 200025 上海市黄浦区瑞金二路197号
入库时间 2023-06-19 10:35:20
技术领域
本发明属于SRT1720用途领域，特别涉及一种SRT1720在制备治疗Graves’病甲亢炎症中的应用。
背景技术
格雷夫斯病(Graves’disease，GD)是在非缺碘地区引起甲状腺功能亢进最常见的原因，该病患者会产生针对甲状腺的自身免疫反应，包括淋巴细胞浸润以及产生特异性甲状腺球蛋白，甲状腺过氧化物酶和促甲状腺激素受体(TSHR)的自身抗体。除了受遗传和环境因素影响外，免疫紊乱也参与了Graves’病甲亢的发展。已有观点提出抗原提呈细胞，自身反应性T 细胞和甲状腺滤泡细胞间的相互作用引起了针对甲状腺自身抗原的免疫反应。尽管针对自身抗原的抗体产生打破了免疫耐受和机体适应性免疫系统的紊乱都已经被揭示，但Graves’病甲亢发生的根本机制目前仍不明确。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种SRT1720在制备治疗Graves’病甲亢患者炎症中的应用。
所述SRT1720的化学结构式为
所述SRT1720以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。
所述选自片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
本发明对SRT1720发掘了新的医疗用途；
本发明中SRT1720可治疗Graves’病甲亢患者外周血单个核细胞中的炎症，具有显著的效果。
附图说明
图1为SRT1720减轻了Graves’病甲亢患者外周血单个核细胞中的炎症反应图；其中(A) 荧光素酶报告基因检测NF-κB启动子活性，(B-K)外周血单个核细胞加入SRT1720(2μM) -SIRT1激动剂24小时，(B)Western Blotting检测P65乙酰化水平，(C)外周血单个核细胞 P65免疫荧光染色P65(红色)细胞核(蓝色)，(D-G)在最后孵育的5小时，外周血单个核细胞内加入脂多糖(50ng/mL),荧光定量PCR检测TNF-α(D)，IL-6(E)，IL-8(F)和 MCP1(G)mRNA表达水平，(H-K)使用ELISA法定量细胞上清内的TNF-α(H)，IL-6 (I)，IL-8(J)和MCP1(K)蛋白水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
采用SRT1720处理外周血单个核细胞，然后进行测试：
1、使用DMSO溶解SRT1720，使用移液器混匀，注意力度轻柔,随后使用Millipore一次性针头滤器0.22μm过滤溶解有SRT1720的DMSO和用于做对照的DMSO。
2、外周血单个核细胞按照1*10
荧光素酶酶活性检测：
1、在24孔板内按照约50％的密度提前一天将细胞接种，每孔加入不含抗生素培液400ul，该培液含有10％的FBS；
2、用50ulOpti-MEM稀释质粒NF-κΒ(0.4ug/孔)，Sv40质粒(0.01ug/孔)，注意混匀是力度要轻柔，准备另外一个EP管，按照每孔50μl Opti-MEM和1ulLipofectamine 2000的量混匀液体，超净台内孵育5min；
3、步骤2中的2种培液使用移液器混匀，注意力度轻柔，超净台内孵育20min，在孵育的时候，在24孔板内按照400ul每孔的量加入培液，20分钟后，每孔加入100ul混合液，同时使用DMSO溶解的SRT1720和对照DMSO，SRT1720终浓度为2μM，加入轻柔前后摇晃细胞培养板，放入37℃细胞培养箱；24h后收集转染了质粒的细胞，用于荧光素酶活性检测，参照Promega公司的双荧光素酶说明书步骤说明进行检测。
免疫荧光染色具体为：
1、取出未使用过的载玻片，按照说明书将甩片装置放置于细胞甩片仪内应放位置。
2、将SRT1720处理外周血单个核细胞和DMSO处理的外周血单个核细胞，调整细胞数目至10
3、25℃，离心机速度设定为800rpm，以这样的速度离心5min,离心过程中采用“低速”模式参与加速和减速过程；
4、结束后，在干燥通风处晾干载玻片。
5、提前在4℃冰箱内放入4％多聚甲醛，用组化笔圈出步骤4中晾干的载玻
片上细胞所在位置，孵育15min。
6、清洗三次载玻片，使用PBS清洗，室温环境下每次5min，摇床轻摇。
7、浸入0.2％PBST内10min,室温摇床轻摇。
8、PBS洗一次，5min，室温摇床轻摇。
9、用抗体稀释液封闭截面1小时。
10、用抗体稀释液按相应比例稀释后的一抗(SIRT1 1:100)在4℃中孵育
过夜。
11、4℃取出，放于室温复温30min。
12、PBS洗三次，每次10min，室温摇床轻摇。
13、加入驴抗兔荧光二抗(PBS中1:500稀释)，室温下湿盒孵育1小时。
14、PBS洗三次，每次10分钟，室温摇床轻摇。
15、加入含DAPI的防淬灭封片剂封片。
16、共聚焦显微镜拍照。
荧光实时定量PCR
荧光实时定量PCR反应系统：
反应选用试剂 体积(μl)
SYBR Premix Ex TaqTM(2×)5
cDNA 模板 2
上游引物(10μM)0.5
不含RNA酶的水 2
下游引物(10μM)0.5
条件：
第一步：95℃10s
第二步：设定温度95℃，时间5s，设定温度60℃时间31s，重复40个循环
最后一步：测定解离曲线。
结果：
荧光素酶报告基因实验结果证实，SRT1720处理过的HEK-293细胞NF-κΒ转录活性降低(图1A)。同时，蛋白印迹分析证实了SRT1720处理的Graves’病甲亢患者外周血单个核细胞乙酰化p65蛋白水平降低(图1B)，免疫荧光实验结果表明加入SRT1720后，p65从细胞核进入细胞质中，提示NF-κΒ通路活性降低(图1C)。而且，SRT1720处理导致NF-κΒ靶向的促炎基因：无论脂多糖添加与否,TNF-α(图1D)，IL-6(图1E)，IL-8(图1F)和 MCP1(图1G)的mRNA表达水平降低。此外，用SRT1720处理外周血单个核细胞后，Graves’病甲亢患者体外培养的单个核细胞上清中的TNF-α(图1H)，IL-6(图1I)，IL-8(图1J)和 MCP1(图1K)蛋白水平显著降低。综上所述，本发明的结果表明SRT1720激活SIRT1活性有利于缓解Graves’病甲亢患者炎症反应。
机译： 抑制下列一种或多种状况发生的方法：单核细胞/巨噬细胞增殖;或平滑肌细胞的增殖;或cd36受体的表达;或低密度脂蛋白-氧化低密度脂蛋白的吸收，缓解或治疗动脉粥样硬化症状的方法;糖尿病;阿尔茨海默氏病，抑制血管系统中斑块形成的方法，缓解与以下一种或多种状况有关的炎症的方法：单核细胞的增殖，平滑肌细胞的增殖，氧化的ldl或去污受体，药物组合物，有效量的一种或多种衍生物或一种或多种电子转移剂的磷酸盐与合适的媒介物或稀释剂一起使用，有效量的一种或多种α-生育酚磷酸酯衍生物一起使用用适当的媒介物或稀释剂
机译： 用于检测个体中阿尔茨海默氏病和线粒体起源的存在的方法以及导致阿尔茨海默氏病抑制基因和一种或多种编码突变型细胞色素C氧化酶的核酸的转录或翻译的遗传突变，以选择性地将共轭分子引入线粒体建立一种细胞系，以评估该化合物在疾病诊断，疾病治疗以及糖尿病的诊断或治疗中的潜在效用，从而制备出纤巧的动物并确定是否存在人源性线粒体疾病核苷酸序列探针试剂盒治疗组合物核酶细胞系和动物杂种
机译： MICRORNA-210抑制剂在制备治疗炎症性皮肤病的药物中的应用
