一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡及其制备方法

技术领域

本申请涉及血型定型领域，特别涉及一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡及其制备方法。

背景技术

ABO 血型系统和Rh血型系统是人类最为重要的两个血型系统，高度的免疫原性使二者具有重要的临床意义，在急诊抢救、手术治疗、贫血治疗、输血前检查等过程中都是不可缺少的，试验结果的正确与否直接关系到病人的生命安危。

根据红细胞膜表面有无A抗原和（或）B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型四种。Rh血型系统在输血医学中的重要性仅次于ABO血型系统，Rh系统主要的抗原有D、C、c、E、e抗原，因为D抗原的免疫原性远远强于其他Rh抗原，所以临床中通常根据D抗原的有无将人群的Rh血型分为“Rh阴性”与“Rh阳性”两类。

2000 年卫生部颁发的《临床输血技术规范》（卫医法[2000]184号）第四章第十五条明确规定：“输血科（血库）要逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO 血型(正反定型)。并常规检查患者的Rh血型，正确无误时可进行交叉配血。但现有的血型检测卡仅可对ABO血型进行正向或反向检测，或仅对Rh系统中的D抗原进行检测，降低了血型检测的准确性，不能满足临床检测的要求。

发明内容

针对现有技术中的血型检测卡一次检测不能同时确定ABO 血型和Rh血型的问题，本申请的目的是提供一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡及其制备方法。

第一方面，本申请提供一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡，通过以下技术方案得以实现：

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡，包括八个微柱凝胶管以及一支A型红细胞试剂和一支B型红细胞试剂；八个所述凝胶管包括一管含有IgM 性质的单克隆抗A 抗体的凝胶管、一管含有IgM 性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM 性质的单克隆抗D抗体的凝胶管、一管含有IgM 性质的单克隆抗C抗体的凝胶管、一管含有IgM 性质的单克隆抗E抗体的凝胶管、两管用于反定型的凝胶管和一管空白凝胶管。

通过采用上述技术方案，本申请血型检测卡可以同时对ABO 血型和Rh血型进行检测，一次检测便可确定被检者两种血型系统的血型，方便，快速。而且，在ABO 血型系统中，本申请血型检测卡可以同时进行正定型和反定型检测，正反定型的结果相互印证后，最终确定的被检者的血型准确可靠，降低了交叉配血过程中风险的发生率。另外，本申请血型检测卡中还设有空白对照，空白对照的设置可以有效指示每个血型检测卡检测结果是否有效，排除了因试剂污染或操作错误等因素产生的错误结果，提高了实验结果的准确性、可靠性。

可选的，所述红细胞试剂包括红细胞和细胞保存剂，所述细胞保存剂包括以下组分：

电解质盐 2-3g /L；

果糖 8-12g/L；

乳糖酸 1-4 g/L；

EDTA-Na

氨基酸 6-12g/L；

表没食子儿茶素 0.5-1g/L；

叔丁基氢醌 1-1.5 g/L；

纳他霉素 15-18mg/L；

甲氧苄啶 7-9 mg/L；

抗霉素A1 1-2 mg/L；

ATP 0.1-0.15g/L。

通过采用上述技术方案，本申请细胞保存剂中除包括细胞保存最基本的电解质盐、糖类以及氨基酸外，还包括渗透压稳定剂、抗凝剂、抗氧化剂、抗菌剂、呼吸抑制剂和能量物质，本申请细胞保存剂可以有效延长细胞的保存时间，且长时间保存的细胞仍具有较高的细胞活力。其中，渗透压稳定剂能够维持保存剂的渗透压，使红细胞在适宜的环境下保存，降低了红细胞溶血的概率；抗凝剂可以防止红细胞在检测新鲜血清时发生溶血，从而使检测结果更加容易判读；抗氧化剂可以维持红细胞膜的稳定性，延缓红细胞溶血的发生速率；抗菌剂能够有效防止细菌的污染，使试剂保持长时间的无菌状态，避免细菌污染对检测结果的干扰；呼吸抑制剂能够在一定程度上降低红细胞的呼吸作用，延长了红细胞的保存时间；能量物质的加入能够使红细胞在保存过程中保持鲜红的颜色。综上所述，通过加入上述成分的细胞保存剂可以降低红细胞溶血的速率，有效的延长红细胞的保存时间，从而延长血型检测卡的使用时间。

可选的，所述细胞保存剂包括以下组分：

电解质盐 2.2-2.7g /L；

果糖 9-11g/L；

乳糖酸 2-3 g/L；

EDTA-Na

氨基酸 8-10g/L；

表没食子儿茶素 0.6-0.9g/L；

叔丁基氢醌 1.2-1.4 g/L；

纳他霉素 16-17mg/L；

甲氧苄啶 7.5-8.5 mg/L；

抗霉素A1 1.3-1.7 mg/L；

ATP 0.12-0.14g/L。

可选的，所述电解质盐选用氯化钠和氯化钾，所述氯化钠和氯化钾的质量浓度比为(1-2):1。

通过采用上述技术方案，本申请的电解质盐选用氯化钠和氯化钾，更加贴近红细胞在人体内的生存环境，为红细胞提供了良好的保存环境。

可选的，所述氨基酸选用甘氨酸、色氨酸和缬氨酸，所述甘氨酸、色氨酸和缬氨酸的质量浓度比为(3-4):(2-3):1。

通过采用上述技术方案，本申请的氨基酸选用甘氨酸、色氨酸和缬氨酸的混合物，三种氨基酸的加入可以延缓红细胞溶血速率，提高红细胞的稳定性。

第二方面，本申请提供一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，通过以下技术方案得以实现：

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，包括以下步骤：

S1.细胞保存剂的配制：称取规定量的电解质盐、果糖、乳糖酸、EDTA-Na

S2.凝胶制备：聚丙烯酰胺葡聚糖粉末采用4-6倍体积的生理盐水浸泡24-48h，然后洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒，收集颗粒大小均匀且完整呈球形凝胶颗粒，得到葡聚糖凝胶；

S3.抗体稀释：采用生理盐水对IgM性质的单克隆抗A抗体、IgM性质的单克隆抗B抗体、IgM性质的单克隆抗D抗体、IgM性质的单克隆抗C抗体、IgM性质的单克隆抗E抗体分别进行溶解，使IgM性质的单克隆抗A抗体的效价≥128、IgM 性质的单克隆抗B抗体的效价≥128、IgM性质的单克隆抗D抗体的效价≥64、IgM 性质的单克隆抗C抗体的效价≥64、IgM性质的单克隆抗E抗体的效价≥64；

S4.凝胶的配制：将步骤S3稀释后的五种抗体分别与步骤S2制备的葡聚糖凝胶按体积比为(1-5):1的比例混合，分别制备得到含IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶；

S5.红细胞试剂制备：将A型、B型红细胞分别采用步骤S1制备的细胞保存剂进行稀释，A型、B型两种红细胞的浓度均为3-5%；

S6.分装、包装：将步骤S4制备的五种带有抗体的凝胶和步骤S2制备的凝胶分别加入到不同微柱管中，并单独包装步骤S5制备的A型红细胞试剂、B型红细胞试剂，形成八个微柱凝胶管的ABO血型正反定型及Rh血型检测卡。

通过采用上述技术方案，本申请首先将聚丙烯酰胺葡聚糖进行溶胀，然后将稀释的抗体与溶胀的聚丙烯酰胺葡聚糖进行混合获得含有抗体的凝胶，将含有抗体的凝胶以及空白凝胶加入到凝胶管进行封口。同时将红细胞与预先配置的细胞保存剂进行混合得到红细胞试剂，红细胞试剂单独包装，在进行样本检测时，再将红细胞试剂与空白凝胶进行混合。

另外，本申请的红细胞在与细胞保存剂混合之前需要进行筛选和处理，选择HBsAg阴性、HCV Ab阴性、HIV Ab阴性、梅毒阴性、无溶血现象的红细胞，再用抗A和抗B抗体准确鉴定血型，然后进行过滤和洗涤去除已经发生凝集的红细胞、蛋白和白细胞。经过筛选和处理的红细胞去除了原本凝集的红细胞、蛋白和白细胞，降低了以上三者对检测结果的干扰，提高了检测结果的准确性。

本申请血型检测卡的制备方法简单，适合大规模生产，且制备获得的血型检测卡特异性高，检测效果准确，符合临床快速检测的要求，另外，本申请血型检测卡还具有较长的使用时效，提高了产品的市场竞争力。

可选的，步骤S1中，细胞保存剂的pH为6.5-6.8。

通过采用上述技术方案，本申请将保存剂的pH调节至6.5-6.8，使保存剂的环境更加贴近生理条件，延长了红细胞的保存时间，维持了红细胞较高的活性。

可选的，步骤S2中，聚丙烯酰胺葡聚糖的粒径为20-50nm。

通过采用上述技术方案，本申请的聚丙烯酰胺葡聚糖的粒径限制在20-50nm，可以更好的截留凝集的红细胞，从而使检测结果更加容易判读。

可选的，步骤S2中，浸泡后的聚丙烯酰胺葡聚糖采用生理盐水洗涤1-2次，再采用蒸馏水洗涤2-3次。

通过采用上述技术方案，本申请将溶胀的聚丙烯酰胺葡聚糖首先采用生理盐水清洗，再采用蒸馏水清洗，可以有效去除凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒，从而更好的截留凝集的红细胞。

可选的，步骤S6中，每个微柱管分装20-25μL凝胶。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请的血型检测卡能够同时检测ABO 血型和Rh血型，且ABO 血型系统能够同时进行正定型和反定型检测，提高了检测结果的准确性、特异性和稳定性，降低了交叉配血过程中发生溶血风险的概率；

2、本申请的血型检测卡配有红细胞试剂，红细胞试剂中的细胞保存剂可以提高红细胞的稳定性，延缓红细胞溶血的速度，延长了红细胞的保存时间，从而延长了本申请血型检测卡的使用有效期；

3、本申请的血型检测卡的制备方法简单，适合大规模生产。

具体实施方式

以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。

制备例1

细胞保存剂配制

称取氯化钠1g、氯化钾1g、果糖12g、乳糖酸1g、EDTA-Na

制备例2

细胞保存剂配制

称取氯化钠2g、氯化钾1g、果糖8g、乳糖酸4g、EDTA-Na

制备例3

细胞保存剂配制

称取氯化钠1.1g、氯化钾1.1g、果糖11g、乳糖酸2g、EDTA-Na

制备例4

细胞保存剂配制

称取氯化钠1.8g、氯化钾0.9g、果糖9g、乳糖酸3g、EDTA-Na

实施例1

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，包括以下步骤：

S1.凝胶制备：聚丙烯酰胺葡聚糖粉末采用4倍体积的生理盐水浸泡48h，用生理盐水洗涤1次，再采用蒸馏水洗涤2次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀且完整呈球形凝胶颗粒；聚丙烯酰胺葡聚糖的粒径为20-50nm；

S2.抗体稀释：采用生理盐水对IgM性质的单克隆抗A抗体、IgM性质的单克隆抗B抗体、IgM性质的单克隆抗D抗体、IgM性质的单克隆抗C抗体、IgM性质的单克隆抗E抗体分别进行溶解，使IgM性质的单克隆抗A抗体的效价≥128、IgM 性质的单克隆抗B抗体的效价≥128、IgM性质的单克隆抗D抗体的效价≥64、IgM 性质的单克隆抗C抗体的效价≥64、IgM性质的单克隆抗E抗体的效价≥64；

S3.凝胶的配制：将步骤S2稀释后的五种抗体分别与步骤S1制备的葡聚糖凝胶按体积比为1:1的比例混合，分别制备得到含IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶；

S4.红细胞试剂的制备：将A型、B型红细胞分别采用制备例1制备的细胞保存剂进行稀释，使A型、B型两种红细胞的浓度均为3%；

S5.分装：将步骤S3制备的五种带有抗体的凝胶分别加入前5个微柱凝胶管中，将步骤S1制备的凝胶加入第6-8号微柱凝胶管中，每管分装25μL，同时单独包装步骤S4制备的A型红细胞试剂、B型红细胞试剂，获得八个微柱凝胶管的ABO血型正反定型及Rh血型检测卡；

S6.封口：采用铝箔复合封口膜对本实施例制备的ABO血型正反定型及Rh血型检测卡进行热封封口。

实施例2

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，包括以下步骤：

S1.凝胶制备：聚丙烯酰胺葡聚糖粉末采用6倍体积的生理盐水浸泡24h，生理盐水洗涤2次，再采用蒸馏水洗涤3次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形凝胶颗粒；聚丙烯酰胺葡聚糖的粒径为20-50nm；

S2.抗体稀释：采用生理盐水对IgM性质的单克隆抗A抗体、IgM性质的单克隆抗B抗体、IgM性质的单克隆抗D抗体、IgM性质的单克隆抗C抗体、IgM性质的单克隆抗E抗体分别进行溶解，使IgM性质的单克隆抗A抗体的效价≥128、IgM 性质的单克隆抗B抗体的效价≥128、IgM性质的单克隆抗D抗体的效价≥64、IgM 性质的单克隆抗C抗体的效价≥64、IgM性质的单克隆抗E抗体的效价≥64；

S3.凝胶的配制：将步骤S2稀释后的五种抗体分别与步骤S1制备的葡聚糖凝胶按体积比为5:1的比例混合，分别制备得到含IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶；

S4.红细胞试剂的制备：将A型、B型红细胞分别采用制备例1制备的细胞保存剂进行稀释，使A型、B型两种红细胞的浓度均为5%；

S5.分装：将步骤S3制备的五种带有抗体的凝胶分别加入前5个微柱凝胶管中，将步骤S1制备的凝胶加入第6-8号微柱凝胶管中，每管分装20μL，同时单独包装步骤S4制备的A型红细胞试剂、B型红细胞试剂，获得八个微柱凝胶管的ABO血型正反定型及Rh血型检测卡；

S6.封口：采用铝箔复合封口膜对本实施例制备的ABO血型正反定型及Rh血型检测卡进行热封封口。

实施例3

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，包括以下步骤：

S1.凝胶制备：聚丙烯酰胺葡聚糖粉末采用5倍体积的生理盐水浸泡36h，生理盐水洗涤2次，再采用蒸馏水洗涤2次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形凝胶颗粒；聚丙烯酰胺葡聚糖的粒径为20-50nm；

S2.抗体稀释：采用生理盐水对IgM性质的单克隆抗A抗体、IgM性质的单克隆抗B抗体、IgM性质的单克隆抗D抗体、IgM性质的单克隆抗C抗体、IgM性质的单克隆抗E抗体分别进行溶解，使IgM性质的单克隆抗A抗体的效价≥128、IgM 性质的单克隆抗B抗体的效价≥128、IgM性质的单克隆抗D抗体的效价≥64、IgM 性质的单克隆抗C抗体的效价≥64、IgM性质的单克隆抗E抗体的效价≥64；

S3.凝胶的配制：将步骤S2稀释后的五种抗体分别与步骤S1制备的葡聚糖凝胶按体积比为3:1的比例混合，分别制备得到含IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗C抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗E抗体的凝胶；

S4.红细胞试剂的制备：将A型、B型红细胞分别采用制备例2制备的细胞保存剂进行稀释，使A型、B型两种红细胞的浓度均为4%；

S5.分装：将步骤S3制备的五种带有抗体的凝胶分别加入前5个微柱凝胶管中，将步骤S1制备的凝胶加入第6-8号微柱凝胶管中，每管分装22μL，同时单独包装步骤S4制备的A型红细胞试剂、B型红细胞试剂，获得八个微柱凝胶管的ABO血型正反定型及Rh血型检测卡；

S6.封口：采用铝箔复合封口膜对本实施例制备的ABO血型正反定型及Rh血型检测卡进行热封封口。

实施例4

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，与实施例2的区别在于，步骤S4采用制备例2制备的细胞保存剂。

实施例5

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤S4采用制备例3制备的细胞保存剂。

实施例6

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，与实施例2的区别在于，步骤S4采用制备例3制备的细胞保存剂。

实施例7

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤S4采用制备例4制备的细胞保存剂。

实施例8

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，与实施例2的区别在于，步骤S4采用制备例4制备的细胞保存剂。

对比例1

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，与实施例2的区别在于：步骤S4采用生理盐水稀释红细胞。

对比例2

一种ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的制备方法，与实施例3的区别在于：步骤S4采用市售细胞保存液稀释红细胞，所述细胞保存液包括以下组分柠檬酸三钠10g/L，磷酸二氢钾0.25g/L、磷酸氢二钠0.45g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖12.5g/L、腺嘌呤0.25g/L、氯霉素0.4g/L。

本申请实施例1-8及对比例1-2制备获得的ABO血型正反定型及Rh血型检测卡的使用方法如下：

1. ABO血型正反定型及Rh血型检测卡有八个凝胶管，其中第一管为抗A凝胶，第二管为抗B凝胶，第三管为抗D凝胶，第四管为抗C凝胶，第五管为抗E凝胶，第六至第八管为空白凝胶；

2.用生理盐水将待检者红细胞配置成0.5-0.8%浓度，分别加入第一至第六管中，每管50μL；

3.将A型、B型红细胞试剂用生理盐水配置成0.5-0.8%浓度，分别加入第七管、第八管中，每管50μL；

4.将待检者血浆分别加入第六至第八管中，每管25μL；

5.混匀后用微柱凝胶卡专用离心机离心，900rpm离心2min，1500rpm离心3min，取出后肉眼判断结果。

6.结果判读：红细胞沉于微柱凝胶的底部为阴性结果，红细胞浮在凝胶表面或胶中为阳性结果，具体判读标准参见表1，判定结果参见表2和3。

注：“+”为阳性，“0”为阴性；若Ctr管出现阳性、溶血或双群结果，该实验结果无效，需要进一步查明原因。

注：“+”为阳性，“0”为阴性；若Ctr管出现阳性、溶血或双群结果，该实验结果无效，需要进一步查明原因。

性能检测实验

采用本申请实施例1-8和对比例1-2制备获得的血型检测卡以及生产一年后的血型检测卡对确定血型的200例A型血志愿者、200例B型血志愿者、200例AB型血志愿者、300例O型血志愿者、100例RhD阳性志愿者、50例RhD阴性志愿者、50例RhC阳性志愿者、50例RhC阴性志愿者、50例RhE阳性志愿者、50例RhE阴性志愿者进行血型检测，实验结果见表4、5。

从表4-5可以看出，本申请实施例1-8制备的血型检测卡不仅可以检测ABO血型，还能够检测Rh血型，检测结果与预定的结果相同，检测结果准确、可靠。另外，采用生产1年后的血型检测卡对确定血型的样本进行检测时，由于对比例1、2的细胞保存剂不能长久的保持红细胞的活性，红细胞发生溶血反应，无法进行反定型检测，所以最终无法确定样本的ABO血型，而本申请实施例1-8制备的血型检测卡中的细胞保存剂能够长久保存红细胞活性，生产1年后的血型检测卡依旧具有较高的准确性。

本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。