公开/公告号CN112684019A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-04-20
原文格式PDF
申请/专利权人 首都医科大学附属北京朝阳医院;中国医学科学院药物研究所;
申请/专利号CN202011341446.2
申请日2020-11-25
分类号G01N30/02(20060101);G01N30/86(20060101);
代理机构11369 北京远大卓悦知识产权代理有限公司;
代理人卞静静
地址 100020 北京市朝阳区工体南路8号
入库时间 2023-06-19 10:41:48
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域。更具体地说，本发明涉及一种哮喘急性加重代谢标志物、检测试剂及试剂盒。
背景技术
支气管哮喘，简称哮喘，是目前威胁全球公共健康最主要的慢性肺部疾病之一。据统计，全球哮喘患者人数已逾3亿，预计到2025年，哮喘患者人数将达4亿。全球哮喘防治创议(Global initiative for asthma，GINA)报道，全球范围内，每年有超过30万人死于哮喘，其中急性加重是导致哮喘病死率和住院率升高的主要原因之一。通过合理必要的规避措施和药物治疗来减少哮喘的急性发作，能够达到预防、控制哮喘的目的。因此，寻找哮喘患者发生急性加重的生物标志物以早期预测发病风险，改变该人群的治疗和预防方案，减少急性加重的发生至关重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种哮喘急性加重代谢标志物、检测试剂及试剂盒，能够用于哮喘急性加重的诊断，提升了诊断的便利性和标准化程度。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，根据本发明的一个方面，本发明提供了哮喘急性加重代谢标志物，包括：
神经酰胺22:0、神经酰胺24:0、磷酸化神经酰胺14:1以及二氢神经酰胺24:0。
根据本发明的另一个方面，还提供了检测试剂，包括用于检测所述的哮喘急性加重代谢标志物的试剂。
进一步地，所述的检测试剂，包括适用于液质联用技术的标准曲线储备液和内标储备液。
进一步地，所述的检测试剂，所述标准曲线储备液包括神经酰胺16:0溶液、神经酰胺18:0溶液、神经酰胺20:0溶液、神经酰胺22:0溶液、神经酰胺24:1溶液以及神经酰胺24:0溶液。
进一步地，所述的检测试剂，所述内标储备液包括神经酰胺17:0溶液。
进一步地，所述的检测试剂，还包括空白基质。
进一步地，所述的检测试剂，所述空白基质为牛血清蛋白溶液。
根据本发明的又一个方面，还提供了试剂盒，包括所述的检测试剂。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明的代谢标志物存在于血清中，方便进行分析测定。本发明的检测试剂和试剂盒能够用于哮喘急性加重的诊断，提升了哮喘急性加重诊断的便利性和标准化程度，为防治哮喘急性加重提供参考。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1-6为本发明各鞘酯代谢物标准曲线；图1为神经酰胺16:0(Cer 16:0)标准曲线(权重系数：1/x，r
图7为哮喘稳定期vs哮喘急性加重期组间具有显著性差异的鞘酯代谢物(红框为潜在生物标志物)；A，标准曲线定量鞘酯；B，其他按照Cer 18:0标准曲线进行定量的鞘酯。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本申请的实施例提供了哮喘急性加重代谢标志物，包括：神经酰胺22:0、神经酰胺24:0、磷酸化神经酰胺14:1以及二氢神经酰胺24:0，即为Cer 22:0、Cer 24:0、Cer 14:1:1P、dhCer 24:0。还可包括二氢神经酰胺20:0、磷酸化神经酰胺16:1、神经酰胺26:1中的一种或多种，即为dhCer 20:0、Cer 16:1:1P、Cer 26:1。
本申请的实施例还提供了检测试剂，包括用于检测所述的哮喘急性加重代谢标志物的试剂，能够检测代谢标志物的任意试剂均可。
在另一些实施例中，包括适用于液质联用技术的标准曲线储备液和内标储备液，能够使用液质联用技术进行代谢标志物的标准曲线储备液和内标储备液即可，液质联用技术可以是高效液相色谱仪以及三重四级杆质谱仪。
在另一些实施例中，所述标准曲线储备液包括神经酰胺16:0溶液、神经酰胺18:0溶液、神经酰胺20:0溶液、神经酰胺22:0溶液、神经酰胺24:1溶液以及神经酰胺24:0溶液。Cer 16:0，Cer 18:0，Cer 20:0，Cer 22:0，Cer 24:1，Cer 24:0通过标准曲线法进行定量分析，其他鞘酯类代谢物代入Cer 18:0标准曲线进行定量分析。
在另一些实施例中，所述内标储备液包括神经酰胺17:0溶液。
在另一些实施例中，还包括空白基质。
在另一些实施例中，所述空白基质为牛血清蛋白溶液。
本申请的实施例还提供了试剂盒，其特征在于，包括以上实施例中的所述的检测试剂。以下以一个具体实施例具体说明：
1.目的
建立基于液质联用技术的鞘酯组学分析方法，分析哮喘急性加重相关和哮喘急性加重患者的血清样本，根据统计学分析和代谢组学潜在生物标志物筛选标准找寻疾病相关潜在生物标志物。
2.样本：哮喘稳定期和哮喘急性加重期样本等；各组样本数量见表1。
表1样本分组信息
3.实验仪器和材料
高效液相色谱仪(Agilent 1290 RRLC system,Agilent Technologies,Inc.Santa Clara,CA)，配有高压泵、自动进样器、脱气机、柱温箱；三重四极杆质谱仪(Agilent 6490 Triple Quad mass spectrometer,Agilent Technologies,Inc.SantaClara,CA)，配备有电喷雾离子源(Electro spray ion ization,ESI)；Masshunter 3.0数据处理系统。ORTEX-2GENE涡旋混合器，Scientific Industry公司产品；METLER TOLEDOAG135型电子天平，瑞士梅特勒公司。
鞘酯标准品(Cer 16:0，Cer 18:0，Cer 20:0，Cer 22:0，Cer 24:1，Cer 24:0，Cer17:0)，美国Avanti公司；去离子水，杭州娃哈哈集团公司；甲醇，质谱级，Fisher公司；甲基叔丁基醚，色谱级，Fisher公司；氯仿，色谱级，北京通广精细化工公司；甲酸铵，质谱级，Sigma公司；甲酸，质谱级，Sigma公司。
4.实验方法：
4.1分析方法
4.1.1色谱条件
色谱柱：Peeke SPECTRA C8SR(150mm×3.0mm，3μm)；流动相A：水(含0.1％甲酸，1mmol/L甲酸铵)，流动相B：甲醇(含0.1％甲酸，1mmol/L甲酸铵)；流速：0.5mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL，梯度洗脱条件：0-10min 80％-100％B；10-18min 100％B；预平衡：6min。
4.1.2质谱条件
AJS ESI源正离子模式检测：干燥气温度：280℃；干燥气流速：14L/min；雾化气流速：30psi；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：4000V；辅助喷嘴电压：1500V。
采用分段多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)可对54个鞘酯代谢物进行定量分析，各鞘酯代谢物保留时间、定量离子对和相关质谱参数等见表2。
表2各鞘酯代谢物分段、保留时间、定量离子对和相关质谱参数
4.2检测试剂
4.2.1储备液的配制
分别精密称取Cer 16:0，Cer 18:0，Cer 20:0，Cer 22:0，Cer 24:1，Cer 24:0约5mg，置于5mL容量瓶中，使用氯仿：甲醇(1:1，v/v)溶解并稀释至刻度，分别配成浓度为1mg/mL的标曲储备液。
4.2.2内标储备液的配制
精密称量Cer 17:0约5mg，置于5mL容量瓶中，用氯仿：甲醇(1:1，v/v)溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的内标储备液。
4.2.3标准曲线工作液的配制
使用各标准品曲储备液(1mg/mL)配制标准曲线样品工作液，通过甲醇溶液逐级稀释，最终配制成20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000和20000ng/mL的各浓度标准曲线工作液(W1-W10，100倍于血清中实际浓度)。
4.2.4内标工作溶液的配制
10μg/mL内标工作液：准确吸取10μL 1mg/mL储备液，加990μL甲醇溶液，混匀后得到10μg/mL内标工作液。取500μL内标工作液(10μg/mL)，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释并定容，混匀后得到1000ng/mL内标工作液(10倍于血清中浓度)。
4.3空白基质的制备
准确称取牛血清白蛋白100mg于10mL容量瓶中，用生理盐水溶解并定容至刻度即得空白基质。
4.4基质标准曲线样品配制
使用移液枪移取各浓度标准曲线工作液W1-W10各10μL，分别加入到990μL空白基质中，混匀后得到1mL的基质标准曲线样品S1-S10(0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100和200ng/mL)，分装并编号，在-80℃条件下保存，待用。
4.5样品前处理
精密吸取100μL人血清样品(或基质标准曲线样品)，加入10μL内标溶液，涡旋混匀。加入1.5mL甲醇和5mL甲基叔丁基醚，大功率涡旋15min，加入1.5mL去离子水后相分离，4500rpm离心10min，吸取上层有机相置于另一玻璃管中，氮气吹干后用100μL流动相B复溶。
4.6质控样品制备
吸取部分血清送样样品混合后按照样品前处理方法进行制备后分析，质控样品数量大于总分析样品数量的5％，计算质控样品中各鞘酯代谢物峰面积RSD值进行质控。
4.7数据分析
应用安捷伦MassHunter定量分析软件对54种鞘酯代谢物进行定量分析，其中Cer16:0，Cer 18:0，Cer 20:0，Cer 22:0，Cer 24:1，Cer 24:0通过标准曲线法(权重系数：1/x)进行定量分析，其他鞘酯类代谢物代入Cer 18:0标准曲线进行定量分析。应用SPSS 19.0统计分析软件中独立样本t检验进行组间显著性差异比较(p＜0.05)，应用SIMCA P 14.0代谢组学分析软件进行潜在生物标志物提取(VIP值大于1；Jack-knife值大于0；S-plot中的Pcorr的绝对值大于0.58)。
5.实验结果：
5.1各鞘酯代谢物标准曲线和线性范围
取各鞘酯代谢物系列浓度的基质标准曲线样品，从低浓度到高浓度连续进样，以基质中被测物浓度(X)为横坐标，被测物与内标物的峰面积之比(Y)为纵坐标，用MassHunter Workstation Software Quantitative Analysis(Version B.03.02)进行标准曲线的计算，得到基质标准曲线线性方程和线性相关系数值r
5.2质控样本分析
人血清样品数量为20个，本实验共分析6针质控样本(占样本总数大于5％)，计算质控样本中定量分析的各鞘酯代谢物峰面积RSD均小于30％，符合代谢组学分析要求，各鞘酯代谢物质控样本峰面积RSD值见表3。
表3质控样本各鞘酯代谢物峰面积RSD
注：Hex为己糖基神经酰胺，P为磷酸化神经酰胺，HexSph为己糖基鞘氨醇(hexosylsphingosine)
5.3哮喘相关人血清样品分析
分别对哮喘稳定期和哮喘急性加重期样品进行定量分析，并进行了组间比较，通过独立样本t检验判断各鞘酯代谢物组间差异性，并通过SIMCA P软件正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA)找寻组间潜在生物标志物。各组间t检验具有显著性差异的(p＜0.05)的鞘酯代谢物见表4，符合潜在生物标志物筛选标准的鞘酯代谢物见表5，各组间具有显著性差异鞘酯含量柱状图见图7。
表4哮喘相关人血清各组间具有显著性差异的鞘酯代谢物
表5哮喘相关人血清各组间潜在生物标志物
6.总结：
基于液质联用技术的鞘酯组学研究，通过生物统计学分析和潜在生物标志物筛选，找寻得到了哮喘稳定期vs哮喘急性加重期组间代谢标志物。这7种神经酰胺类代谢物具有组间显著性差异(t检验，p＜0.05)，其中4种神经酰胺类代谢物(神经酰胺22:0、神经酰胺24:0、磷酸化神经酰胺14:1和二氢神经酰胺24:0)符合潜在生物标志物筛选标准，且哮喘急性加重期组的这4种潜在生物标志物含量均显著上调，具有区分哮喘稳定期与哮喘急性加重期的价值，可用于临床哮喘急性加重的早期筛查与诊断。还根据代谢标志物提供了检测试剂。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明哮喘急性加重代谢标志物、检测试剂及试剂盒的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
机译： 诊断和区分阿司匹林加重的呼吸系统疾病和阿司匹林耐受性哮喘的H标志物和试剂盒
机译： 识别哮喘患者的方法，监测哮喘患者的方法，总骨膜素检测试剂盒的使用，总骨膜素测量试剂盒的使用，抗il-13抗体的使用，治疗量的来布列单抗治疗的使用，th2途径的使用抑制剂，不良事件评估方法，抗骨膜素抗体和总骨膜素测试
机译： 识别哮喘患者的方法，监视哮喘患者的方法，总骨膜素检测试剂盒的使用，总骨膜素测量试剂盒的使用，抗il-13抗体的使用，治疗量的来布列单抗的治疗，th2途径的使用抑制剂，不良事件评估方法，抗骨膜素抗体和总骨膜素测试
