Gpm6b调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的是Gpm6b调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用。

背景技术

截至2018年年底，全世界已有轻度听力受损者近6亿，中度以上2.5亿。2018年我国有听力障碍残疾人九千多万，居各类残疾之首；耳鸣发病率有15％-20％，而综合治疗率不到20％。目前，感音神经性聋占耳聋患者63％。损害毛细胞造成听力障碍的因素主要有衰老、噪音、环境化学毒素、氨基糖苷和先天遗传。同时，哺乳动物耳蜗的再生能力仅在胚胎发育和新生儿早期阶段，成年的哺乳动物毛细胞缺乏自发的形成新的成熟毛细胞的能力，因而损伤后造成了永久性听力障碍。目前临床上常用的助听器和人工耳蜗移植治疗岁在一定程度上改善了患者的听力，但治标不治本。因此，最理想的治疗方法是通过干细胞替代治疗，再生毛细胞和螺旋神经元，促进螺旋神经元神经突的生长，从根本上修复耳蜗结构和功能，恢复听觉功能。如何修复和再生损失或丢失的螺旋神经元，如何使损伤后的毛细胞再生，是目前听觉领域研究的热点。

造成感音神经性耳聋的主要原因有耳蜗毛细胞的损伤以及毛细胞损伤后螺旋神经元的神经突退化或螺旋神经元死亡。而螺旋神经元的不可逆损伤是感音神经性耳聋的主要病因。内耳包括耳蜗和前庭，耳蜗感受声音，毛细胞感受到压力后产生动作电位，传递至神经，到螺旋神经节神经细胞，继而传递到听觉皮层。而内耳干细胞可自生并多次继代培养，可表达分化为毛细胞所需的关键转录调节因子以及毛细胞结构蛋白。

神经元膜糖蛋白基因(Gpm6b)编码一种四跨膜蛋白，属于蛋白脂类蛋白家族，广泛表达于神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。Gpm6b是一个在成骨细胞分化过程中强烈上调的基因，在维生素D和激活素A的作用下分别升高和降低。既往研究表明，Gpm6b在神经分化、髓鞘形成和成骨细胞分化中发挥作用。

同时，非哺乳动物脊椎动物可从成年干细胞或前体细胞中再生出新的毛细胞，但哺乳类耳蜗不能自发地产生新的成熟毛细胞，新生小鼠耳蜗损伤后可再生新的毛细胞，但成年哺乳动物毛细胞缺乏再生能力。

发明内容

为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供Gpm6b调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用，解决了部分动物毛细胞缺乏再生能力的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

Gpm6b调控内耳干细胞增殖分化方法，包括以下步骤：

一、OC-1细胞培养

将小玻片放入24孔皿中，加1ml ddH

二、siRNA敲低Gpm6b基因

采用N1301、N885、N1082三种不同的siRNA敲减OC-1细胞中的Gpm6b基因；

三、Lgr5+祖细胞的分离培养及Gpm6b基因敲低

消化成单细胞后，采用流式细胞分选技术进行分选，经培养后再Gpm6b基因敲低；

四、Gpm6b基因敲低对Lgr5+祖细胞增殖/分化的影响

采用细胞成球实验、EdU染色实验和免疫荧光实验研究Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞增殖/分化的影响，再评估Lgr5+细胞增殖、分化为毛细胞的能力；

五、数据分析

采用GraphPad Prism 6进行数据统计分析。

进一步地，所述步骤一中的DMEM基本培养基为：DMEM 45ml、FBS 5ml、Amp 50ul。

进一步地，所述步骤三中消化成单细胞的方法为：取新生Lgr5-EGFP小鼠耳蜗放入装有50ul 1×PBS的1.5ml EP管中，用50ul 0.25％胰酶在37℃下培养8-12min后消化成单细胞。

进一步地，所述步骤四中的细胞成球实验通过活细胞工作站观察并量化球形的数量和直径来评估Lgr5+细胞的增殖能力。

进一步地，所述步骤四中的免疫荧光实验通过EdU、DAPI、Myo7a染色，然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察。

进一步地，所述步骤五中的数据分析在两组比较时，使用双侧、未配对的t检验来确定统计显著性。

Gpm6b在毛细胞再生中的应用，包括如上所述的Gpm6b基因，将Gpm6b基因应用在毛细胞再生中。

本发明的有益效果：

本发明通过研究Foxg1与Rps14对内耳干细胞的调控机制，体外找到促进内耳干细胞再生成为有功能的内耳毛细胞的方法，从而使得内耳结构和功能的重建成为可能。

敲低Gpm6b基因后对于Lgr5+细胞成球有抑制作用(p<0.05)，即Gpm6b敲低抑制Lgr5+细胞增殖，而Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞分化再生毛细胞无调控作用。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明N1301、N885、N1082三种siRNA在OC-1细胞中对Gpm6b基因的敲减效率示意图；

图2是本发明Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞增殖的作用示意图；

图3是本发明Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞再生毛细胞的作用示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明在于提供Gpm6b基因调控内耳干细胞增殖分化的方法及Gpm6b基因在毛细胞再生中的应用，Gpm6b基因调控内耳干细胞增殖分化方法包括以下步骤：

一、OC-1细胞培养

将小玻片放入24孔皿中，加1ml ddH

二、siRNA敲低Gpm6b基因

本项目采用N1301、N885、N1082三种不同的siRNA敲减OC-1细胞中的Gpm6b基因。设计编码无义序列的shRNA作为阴性对照，用与GFP结合的无义siRNA评估转染效率。简单地说，细胞以1*105个细胞/ml的密度接种于6孔板或96孔板中，以确保在播种后24小时达到80％的融合培养。按试剂盒说明进行转染，8h后用含胎牛血清的DMEM试剂培养，33℃、5％CO

RT-qPCR：使用TRIzol试剂按照制造商方案从小鼠耳蜗和HEI-OC1细胞中提取总RNA。利用随机六聚体和上标逆转录酶将总RNA(1°g)逆转录为cDNA。使用SYBR greenMaster Mix试剂盒和EppendorfAG 22331PCR仪进行qRT-PCR检测多个基因的表达。PCR条件预变性一步在95℃4min，40个周期95℃的变性30s，退火60℃45s和扩展在72℃1min，和最后一个在72℃扩展10min。基因表达水平在每个样本归一化各自的表达水平，和每个PCR的特异性反应证实了融化曲线分析。

三、Lgr5+祖细胞的分离培养及Gpm6b基因敲低

耳蜗解剖。将Lgr5+小鼠斩首，采集基底膜，放入装有50ul 1×HBSS的1.5mlEP管中，用50ul 0.25％胰酶在37℃下培养8-12min后消化成单细胞。采用流式细胞分选技术从含有Lgr5-EGFP细胞的单细胞悬液中分选出Lgr5+细胞，在细胞培养皿中培养。用在OC-1细胞中敲低效率最佳的siRNA敲低Lgr5+细胞中的Gpm6b基因。

四、Gpm6b基因敲低对Lgr5+祖细胞增殖/分化的影响

细胞成球实验：将Gpm6b基因敲减的Lgr5+细胞接种在96孔皿上以1000个/孔的密度培养5天，其中培养液含DMEM/F12、2％B27、1％N2、IGF、EGF、β-FGF、Hsp、0.1％的氨苄青霉素。活细胞工作站观察并量化球形的数量和直径来评估Lgr5+细胞的增殖能力。

EdU免疫荧光染色：取对数生长期的细胞，以每孔4*10

五、数据分析

采用GraphPad Prism 6进行数据统计分析。两组比较时，使用双侧、未配对的t检验来确定统计显著性。p值<0.05为差异有统计学意义。

如图1所示为N1301、N885、N1082三种siRNA在OC-1细胞中对Gpm6b基因的敲减效率示意图，三种siRNA在OC-1细胞中对Gpm6b基因的敲减效率与对照组相比都具有显著性差异(P＜0.01)。

如图2所示为Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞增殖的作用示意图，其中，图a为Lgr5+细胞Gpm6b基因敲减的对照组的明场图；图b为Lgr5+细胞Gpm6b基因敲减组的明场图；图c为每1000细胞/孔中Lgr5+细胞成球数目的比较，Gpm6b基因敲低组成球数目与对照组具有显著性差异(P＜0.05)；图d为Lgr5+细胞成球直径的比较，Gpm6b基因敲低组成球数目与对照组无显著性差异。Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞增殖有抑制作用。

如图3所示为Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞再生毛细胞的作用示意图，图e为不同倍数下Gpm6b基因敲减对照组和实验组Lgr5+细胞DAPI、EdU和Myo7a染色的细胞免疫荧光图；图f为每2000细胞中实验组与对照组Myo7a+、EdU+以及Myo7a+/EdU+染色细胞数目无显著性差异；图g为每2000细胞中Myo7a+在细胞球形内层、外层及总数上均与对照组无显著性差异。Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞分化再生毛细胞无调控作用。

本方案可以概括为：

Gpm6b调控内耳干细胞增殖分化方法，包括以下步骤：

一、OC-1细胞培养

将小玻片放入24孔皿中，加1ml ddH

二、siRNA敲低Gpm6b基因

采用N1301、N885、N1082三种不同的siRNA敲减OC-1细胞中的Gpm6b基因；

三、Lgr5+祖细胞的分离培养及Gpm6b基因敲低

消化成单细胞后，采用流式细胞分选技术进行分选，经培养后再Gpm6b基因敲低；

四、Gpm6b基因敲低对Lgr5+祖细胞增殖/分化的影响

采用细胞成球实验和EdU染色实验研究Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞增殖/分化的影响，再评估Lgr5+细胞增殖、分化为毛细胞的能力；

五、数据分析

采用GraphPad Prism 6进行数据统计分析。

所述步骤一中的DMEM基本培养基为：DMEM 45ml、FBS 5ml、Amp 50ul。

所述步骤三中消化成单细胞的方法为：取新生Lgr5-EGFP小鼠耳蜗放入装有50ul1×PBS的1.5ml EP管中，用50ul 0.25％胰酶在37℃下培养8-12min后消化成单细胞。

所述步骤四中的细胞成球实验通过活细胞工作站观察并量化球形的数量和直径来评估Lgr5+细胞的增殖能力。

所述步骤四中的免疫荧光染色实验通过EdU、DAPI、Myo7a染色，然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察。

所述步骤五中的数据分析在两组比较时，使用双侧、未配对的t检验来确定统计显著性。

结果分析：

1、三种siRNA在OC-1细胞中敲低Gpm6b基因后，与对照组相比，三种siRNA在OC-1细胞中对Gpm6b基因的敲减效率具有显著性差异；

2、敲低Gpm6b基因后对于Lgr5+细胞成球有抑制(p<0.05)，即Gpm6b敲低抑制Lgr5+细胞增殖，但对比成球直径大小，Gpm6b敲低后没有差别；

3、Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞分化为Myo7a+细胞数量无显著性差异，表明Gpm6b基因敲减对Lgr5+细胞分化为毛细胞无调控作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。