无同源性、多个长片段、高效零背景组装方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体的，涉及无同源性、多个长片段、高效零背景组装方法。

背景技术

目前，由于基因片段之间无同源性，通常无法一次性将6个片段按次序依次连接成环，常规基因合成方法都是分段依次多步骤完成，所需要的轮次经理的步骤较多。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无同源性、多个长片段、高效零背景组方法装方法。

本发明需要解决的技术问题为：

现有技术中，由于基因片段之间无同源性，通常无法一次性将6个片段按次序依次连接成环，常规基因合成方法都是分段依次多步骤完成，所需要的轮次经理的步骤较多。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

无同源性、多个长片段、高效零背景组方法，包括以下步骤：

第一步、在整个环化质粒限制性内切酶NotI位点唯一处，添加一个B片段Yesatori，同时保证B片段左右有且刚好只两个NotI酶切位点，以便后续NotI单切自连去除B片段；

第二步、示例无同源性的A、B片段之间设计两条Primer 1/2引物，无同源性的B、C片段之间设计两条Primer 3/4引物以引物作为两个片段之间连接的桥梁，其它片段之间设计依次类推；

第三步、将所有片段共7个ABCDEFG，这些片段可以通过PCR扩增或者质粒酶切得到，同每个片段接头处的一对引物共7对primer1-14，一同转入酵母感受态细胞，使用Sc-Trp缺色氨酸液体培养基进行30℃震荡培养两天；

第四步、提取培养两天的酵母质粒；

第五步、提取的酵母质粒转化大肠杆菌扩增；

第六步、PCR菌检、提取大肠杆菌质粒酶切验证，测序验证；

第七步、NotI单切正确的大肠杆菌质粒，凝胶电泳回收，去除B片段，T4 DNA连接酶自连处理后导入大肠杆菌37℃培养筛选，得到去除多余的B片段质粒，最后再抽提大肠杆菌中的质粒，测序验证以及酶切验证质粒的正确性。

进一步地，所述提取酵母质粒的具体操作步骤如下:

步骤S1、取1-5mL酵母培养物，于12000rpm转速下离心1-3min，吸去上清；

步骤S2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入470μL山梨醇Buffer，充分悬浮菌体，加入25μL酵母破壁霉和5μLβ-疏基乙醇，混匀后于30℃下处理1-2h，期间可颠倒离心管3-5次，然后在转速12000r/min条件下离心1-3min，弃去上清，收集沉淀，向沉淀中加入250μLYP1充分悬浮沉淀，吸取上清；

步骤S3、向离心管中加入350μL YP3，立即温和地上下翻转6-8次，混匀后，于转速12000r/min下离心10min，用移液器小心地将上清转移至另一个干净的离心管中；

步骤S4、将步骤S3中上清液加入吸附柱中，于室温条件下放置2min，于转速12000r/min下离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min后，弃除废液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min转速离心2min后，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置3-5min，然后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加5-200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000r/min条件下离心1min，即得酵母质粒。

本发明的有益效果：

本发明提供一种无同源性、多个长片段、高效零背景组方法，经过酵母组装、大肠杆菌筛选，即完成零背景克隆，无空载体产出，且相较于传统克隆方式节约大量时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明片段A和B接头引物primer1/2设计的结构示意图；

图2为本发明片段B和C接头引物primer3/4设计；

图3为本发明片段及引物示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

请参阅图1-3所示，无同源性、多个长片段、高效零背景组方法，包括以下步骤：

第一步、在整个环化质粒限制性内切酶NotI位点唯一处，添加一个B片段Yesatori，同时保证B片段左右有且刚好只两个NotI酶切位点，以便后续NotI单切自连去除B片段；

第二步、示例无同源性的A、B片段之间设计两条Primer 1/2引物，无同源性的B、C片段之间设计两条Primer 3/4引物以引物作为两个片段之间连接的桥梁，其它片段之间设计依次类推；

第三步、将所有片段共7个ABCDEFG，这些片段可以通过PCR扩增或者质粒酶切得到，同每个片段接头处的一对引物共7对primer1-14，一同转入酵母感受态细胞，使用Sc-Trp缺色氨酸液体培养基进行30℃震荡培养两天；

第四步、提取培养两天的酵母质粒；

第五步、提取的酵母质粒转化大肠杆菌扩增；

第六步、PCR菌检、提取大肠杆菌质粒酶切验证，测序验证；

第七步、NotI单切正确的大肠杆菌质粒，凝胶电泳回收，去除B片段，T4 DNA连接酶自连处理后导入大肠杆菌37℃培养筛选，得到去除多余的B片段质粒，最后再抽提大肠杆菌中的质粒，测序验证以及酶切验证质粒的正确性。

其中，所述提取酵母质粒的具体操作步骤如下:

步骤S1、取1mL酵母培养物，于12000rpm转速下离心1min，吸去上清；

步骤S2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入470μL山梨醇Buffer，充分悬浮菌体，加入25μL酵母破壁霉和5μLβ-疏基乙醇，混匀后于30℃下处理1h，期间可颠倒离心管3次，然后在转速12000r/min条件下离心1min，弃去上清，收集沉淀，向沉淀中加入250μLYP1充分悬浮沉淀，吸取上清；

步骤S3、向离心管中加入350μL YP3，立即温和地上下翻转6次，混匀后，于转速12000r/min下离心10min，用移液器小心地将上清转移至另一个干净的离心管中；

步骤S4、将步骤S3中上清液加入吸附柱中，于室温条件下放置2min，于转速12000r/min下离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min后，弃除废液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min转速离心2min后，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置3min，然后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加5μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000r/min条件下离心1min，即得酵母质粒。

实施例2

无同源性、多个长片段、高效零背景组方法，包括以下步骤：

第一步、在整个环化质粒限制性内切酶NotI位点唯一处，添加一个B片段Yesatori，同时保证B片段左右有且刚好只两个NotI酶切位点，以便后续NotI单切自连去除B片段；

第二步、示例无同源性的A、B片段之间设计两条Primer 1/2引物，无同源性的B、C片段之间设计两条Primer 3/4引物以引物作为两个片段之间连接的桥梁，其它片段之间设计依次类推；

第三步、将所有片段共7个ABCDEFG，这些片段可以通过PCR扩增或者质粒酶切得到，同每个片段接头处的一对引物共7对primer1-14，一同转入酵母感受态细胞，使用Sc-Trp缺色氨酸液体培养基进行30℃震荡培养两天；

第四步、提取培养两天的酵母质粒；

第五步、提取的酵母质粒转化大肠杆菌扩增；

第六步、PCR菌检、提取大肠杆菌质粒酶切验证，测序验证；

第七步、NotI单切正确的大肠杆菌质粒，凝胶电泳回收，去除B片段，T4 DNA连接酶自连处理后导入大肠杆菌37℃培养筛选，得到去除多余的B片段质粒，最后再抽提大肠杆菌中的质粒，测序验证以及酶切验证质粒的正确性。

其中，所述提取酵母质粒的具体操作步骤如下:

步骤S1、取3mL酵母培养物，于12000rpm转速下离心2min，吸去上清；

步骤S2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入470μL山梨醇Buffer，充分悬浮菌体，加入25μL酵母破壁霉和5μLβ-疏基乙醇，混匀后于30℃下处理1.5h，期间可颠倒离心管4次，然后在转速12000r/min条件下离心2min，弃去上清，收集沉淀，向沉淀中加入250μLYP1充分悬浮沉淀，吸取上清；

步骤S3、向离心管中加入350μL YP3，立即温和地上下翻转7次，混匀后，于转速12000r/min下离心10min，用移液器小心地将上清转移至另一个干净的离心管中；

步骤S4、将步骤S3中上清液加入吸附柱中，于室温条件下放置2min，于转速12000r/min下离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min后，弃除废液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min转速离心2min后，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置4min，然后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加100μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000r/min条件下离心1min，即得酵母质粒。

实施例3

无同源性、多个长片段、高效零背景组方法，包括以下步骤：

第一步、在整个环化质粒限制性内切酶NotI位点唯一处，添加一个B片段Yesatori，同时保证B片段左右有且刚好只两个NotI酶切位点，以便后续NotI单切自连去除B片段；

第二步、示例无同源性的A、B片段之间设计两条Primer 1/2引物，无同源性的B、C片段之间设计两条Primer 3/4引物以引物作为两个片段之间连接的桥梁，其它片段之间设计依次类推；

第三步、将所有片段共7个ABCDEFG，这些片段可以通过PCR扩增或者质粒酶切得到，同每个片段接头处的一对引物共7对primer1-14，一同转入酵母感受态细胞，使用Sc-Trp缺色氨酸液体培养基进行30℃震荡培养两天；

第四步、提取培养两天的酵母质粒；

第五步、提取的酵母质粒转化大肠杆菌扩增；

第六步、PCR菌检、提取大肠杆菌质粒酶切验证，测序验证；

第七步、NotI单切正确的大肠杆菌质粒，凝胶电泳回收，去除B片段，T4 DNA连接酶自连处理后导入大肠杆菌37℃培养筛选，得到去除多余的B片段质粒，最后再抽提大肠杆菌中的质粒，测序验证以及酶切验证质粒的正确性。

其中，所述提取酵母质粒的具体操作步骤如下:

步骤S1、取5mL酵母培养物，于12000rpm转速下离心3min，吸去上清；

步骤S2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入470μL山梨醇Buffer，充分悬浮菌体，加入25μL酵母破壁霉和5μLβ-疏基乙醇，混匀后于30℃下处理2h，期间可颠倒离心管5次，然后在转速12000r/min条件下离心3min，弃去上清，收集沉淀，向沉淀中加入250μLYP1充分悬浮沉淀，吸取上清；

步骤S3、向离心管中加入350μL YP3，立即温和地上下翻转8次，混匀后，于转速12000r/min下离心10min，用移液器小心地将上清转移至另一个干净的离心管中；

步骤S4、将步骤S3中上清液加入吸附柱中，于室温条件下放置2min，于转速12000r/min下离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min后，弃除废液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min转速离心2min后，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置5min，然后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000r/min条件下离心1min，即得酵母质粒。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。