基于组蛋白去乙酰化酶抑制活性诱导调节性B细胞高效扩增的试剂及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及基于组蛋白去乙酰化酶抑制活性诱导调节性B细胞高效扩增的试剂及其应用。

背景技术

B细胞通过产生抗体、展示抗原和分泌促炎及抑炎性因子在促、控炎症两个方面均有重要作用。在牙周炎症组织中，B细胞有促进牙周炎发展的作用。B细胞在类风湿性关节炎(RA)中起重要作用，不光分泌“类风湿因子”，还能分泌促炎细胞因子来促进RA的发生和发展。B细胞也是一种抗原呈递细胞，可通过HLA-DR4和抗原特异性T细胞结合，刺激其产生TNF-α并激活巨噬细胞，在RA中表现异常。B细胞还可抑制免疫反应，该类细胞被称为调节性B细胞(Breg)，其主要亚群为产IL-10型Breg(B10)。Breg不仅在维持静息状态下的外周耐受中发挥作用,而且对于抑制正在进行的免疫反应、重建自身免疫性耐受至关重要。牙周炎患者炎症牙龈组织中B10细胞的数量显著高于健康牙龈组织。类风湿性关节炎(RA)病人的B10明显异常，不光数量减少而且功能减弱，提示Breg可能是牙周炎参与RA发病的关键免疫细胞。

现有技术表明Breg能抑制牙周炎细胞因子的表达和减少牙槽骨吸收，Breg细胞经静脉注射后在牙龈组织中显著增加并抑制牙周炎，LPS在与CpG联用时能够增加体外培养的CD1d

虽然B细胞的体外培养技术已经建立，Breg细胞的体外诱导使其比例显著上升以及在体外高效扩增的技术仍有待开发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导调节性B细胞高效扩增的试剂。

本发明的再一目的在于提供上述诱导调节性B细胞高效扩增的试剂的应用。

根据本发明具体实施方式的诱导调节性B细胞高效扩增的试剂，所述试剂包括刺激物和诱导物，其中，刺激物为LPS、CD40抗体或CpG中的至少一种，诱导物为组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是一种内毒素(Endotoxin)，当其作用于人类或动物等其他生物细胞时，就会表现出多种的生物活性。

CPG ODN(CpG oligonucleotide,CpG寡脱氧核苷酸)是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN)，可模拟细菌DNA刺激多种哺乳动物包括人的免疫细胞。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)，有干扰组蛋白去乙酰化酶的功能。HDACi按其结构分为4类：一、脂肪酸，如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐、丁酸苯酯和丙戊酸；二、氧肟酸盐，如TSA是被发现的第1个能抑制HDACs的天然氧肟酸，SAHA与TSA结构相似，是食品药品管理局批准的第一个可以用于临床的制剂；三、环肽，如天然产物缩酚酸肽FK-228、apicidin和环氧肟酸；四、苯酰胺类，如MS-275、MGCD0103。

根据本发明具体实施方式的诱导调节性B细胞高效扩增的试剂，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括脂肪酸，不限于乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠、TSA或Vorinostat。

本发明所用的脂肪酸包括短链脂肪酸类，如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，本发明所用的脂肪酸包括短链脂肪酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐，具体的，乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠，或者乙酸钾、丙酸钾、丁酸钾、戊酸钾，或者其他的短链脂肪酸盐。

Vorinostat也叫SAHA，中文名是伏立诺他，是小分子量(<300)线性肟酸，抑制HDAC活性，包括乙酰化组蛋白和非组蛋白的积累，抑制培养细胞的增殖，且抑制肿瘤生长。Vorinostat通过结合到酶的活性位点而抑制HDAC活性。

TSA全称为trichostatin A，其中文名称是曲古菌素A，是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能引起多种基因的表达。

本发明中可选择的试剂组合包括：

1)1μg/mL CD40抗体+0.5mM丙酸钠，丙酸钠可替换为丁酸钠或戊酸钠；

2)10μg/mL LPS+0.5mM丙酸钠，丙酸钠可替换为丁酸钠或戊酸钠；

3)10μg/mL LPS+2mM乙酸钠；

4)10μg/mL LPS+10nM TSA或0.5mM Vorinostat；

5)40nM CpG+0.5mM丁酸钠。

根据本发明具体实施方式的诱导调节性B细胞高效扩增的试剂，所述CD40的浓度为0.1-3μg/mL，CpG的浓度为4-400nM，LPS的浓度为0.1～50μg/mL。

根据本发明具体实施方式的诱导调节性B细胞高效扩增的试剂，所述乙酸钠的浓度为0.1-20mM，丙酸钠的浓度为0.1-20mM，丁酸钠的浓度为0.1-20mM，戊酸钠的浓度为0.1-20mM，TSA的浓度为0.05-50μM，Vorinostat的浓度为0.05-50μM。

优选的，本发明的可选用的刺激物为LPS、CD40抗体，所述CD40抗体的浓度为0.1-3μg/mL，LPS的浓度为0.1～50μg/mL，对应的诱导物包括丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠，丙酸钠的浓度为0.1-20mM，丁酸钠的浓度为0.1-20mM，戊酸钠的浓度为0.1-20mM。

本发明提供诱导调节性B细胞高效扩增的试剂的应用，尤其是在在制备抗炎药物或自身免疫性疾病药物方面的应用，例如，用本发明试剂诱导扩增Breg细胞，可通过过继输入如静脉注射方式治疗类风湿性关节炎和肠炎等炎症或自身免疫疾病病人，或者通过服用或注射含有本发明试剂的药物，达到治疗炎症、或者自身免疫性疾病的效果。

根据本发明具体实施方式的诱导调节性B细胞高效扩增的方法，所述方法包括使用上述导调节性B细胞高效扩增的试剂培养B细胞的步骤。

根据本发明具体实施方式的诱导调节性B细胞高效扩增的方法，包括以下步骤：将细胞进行培养，培养过程中，加入刺激物和诱导物，其中，刺激物为LPS、CD40抗体或CpG中的至少一种，诱导物为组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

根据本发明具体实施方式的诱导调节性B细胞高效扩增的方法，细胞培养时间为24-240小时，期间每2天更换含有刺激物和诱导物的新鲜培养基。

本发明的有益效果：

本发明通过刺激物与诱导物联合使用，诱导调节性B细胞并高效扩增，使得B细胞在体外持续高速增殖，在体外培养的脾脏细胞或PBMC细胞中的比例显著增加，且不丧失其抑制体内外免疫反应的功能。

本发明提供诱导调节性B细胞高效扩增的试剂的应用，尤其是在在制备抗炎药物或自身免疫性疾病药物方面的应用，例如，用本发明试剂诱导扩增Breg细胞，可通过过继输入如静脉注射方式治疗类风湿性关节炎等炎症或自身免疫疾病病人，或者通过服用或注射含有本发明试剂的药物，达到治疗炎症、或者自身免疫性疾病的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示短链脂肪酸类HDACi在体外显著诱导小鼠和人Breg细胞的情况，其中，A为小鼠脾脏细胞在CD40抗体刺激或LPS刺激条件下，短链脂肪酸类HDACi诱导Breg细胞情况；B为小鼠脾脏细胞在CpG-1826和CpG2395刺激条件下，丁酸钠显著诱导Breg情况；C为人外周血单个核细胞(PBMC)分别在CD40抗体、LPS和CpG刺激条件下，丁酸钠对Breg细胞的诱导作用；D为人外周血单个核细胞(PBMC)分别在CD40抗体刺激条件下，不同短链脂肪酸对Breg细胞的诱导作用；E为小鼠脾脏纯化B细胞在LPS刺激条件下，不同短链脂肪酸诱导处理48h后细胞内IL-10和Prdm1基因mRNA水平；A-D中左图为代表性的流式图，右图为统计图。；

图2显示丁酸钠对小鼠Breg细胞增殖作用结果，其中，A为在CD40抗体刺激培养联合丁酸钠诱导48h、72h和96h后细胞增殖及Breg细胞比例变化情况；B为LPS(刺激培养联合丁酸钠诱导48h、72h和96h后细胞增殖及Breg细胞比例变化情况；C为CpG刺激培养联合丁酸钠诱导48h、72h和96h后细胞增殖及Breg细胞比例变化情况；

图3显示丁酸钠对B细胞增殖、Breg分化及细胞凋亡的影响，其中，A图为在CD40抗体、CpG-1826和LPS刺激培养联合丁酸钠诱导48h后细胞计数统计结果，B图为对应Breg细胞计数结果，C图为CD40抗体或LPS刺激培养联合丁酸钠诱导48h后细胞死亡统计结果。

图4显示短链脂肪酸的HDAC抑制活性对Breg细胞的诱导作用情况；A.脾脏纯化B细胞在LPS刺激条件下经短链脂肪酸和TSA抑制细胞HDAC的百分比；B现实乙酸钠不同浓度对诱导Breg细胞比例的作用；C显示小鼠脾脏B细胞在Cd40抗体或LPS刺激条件下，HDAC抑制剂TSA和Vorinostat、丁酸钠对小鼠Breg细胞的诱导作用；D显示小鼠脾脏B细胞在Cd40抗体或LPS刺激条件下，丁酸钠对Breg细胞的诱导作用被组蛋白乙酰基转移酶抑制剂(HATinhibitor，HATi)anacardic acid减弱，C-D中上面代表性流式图，流式图下对应统计结果；

图5显示短链脂肪酸类HDACi在体内诱导小鼠Breg细胞的情况,A为SCFAs处理C57BL/6J健康小鼠的过程示意图；B为小鼠PBMC中CD19

图6显示丁酸钠促进B10细胞功能情况，(A)为B细胞抑制T细胞增殖情况；(B)为采用DAI评分和结肠组织学切片检查(H&E染色)评价结肠炎的严重程度；(C)NaBu上调小鼠外周血淋巴细胞、脾脏和LN中Treg的表达情况；(D)采用DAI评分和结肠组织学切片检查(H&E染色)评价结肠炎的严重程度；(E)经Breg转移后，小鼠脾脏淋巴细胞和LN中Treg表达上调情况；(F)NaBu对CIA的抑制作用。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1B细胞的制备、培养及Breg细胞体外诱导

通过常用方法分离小鼠脾脏淋巴细胞、外周血单核细胞(PBMC)和纯化的B细胞，分离人外周血单核细胞(PBMC)；

将所得细胞或经CFSE染料染色后的细胞进行体外培养，培养时铺板密度为0.2～3×10

刺激培养时，加入诱导物；

在收集细胞染色前5h，细胞用LPS和PMA、ionomycin及monensin(L+PIM)刺激；

流式染色检测细胞增殖和分化情况。

1.1考察本发明试剂对小鼠细胞的作用

培养时小鼠脾脏细胞时，加入的刺激物分别为CD40抗体(1μg/mL)、LPS(10μg/mL)，在用CD40、LPS培养时，分别加入0.1或0.5mM乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠和戊酸钠中的一种进行诱导，观察Breg细胞的增加情况。

如图1中(A)所示，纯化小鼠脾脏B细胞经CD40抗体或LPS诱导培养2天，流式检测Breg细胞(CD19

小鼠脾脏细胞在CpG-1826(40nM)和CpG-2395(4μg/mL)刺激条件下，加入丁酸钠进行诱导，考察Breg细胞的增加情况。

如图1中(B)所示，纯化小鼠脾脏B细胞经CpG-1826或CpG-2395诱导培养2天后，流式检测Breg细胞(CD19

1.2考察本发明试剂对人细胞的作用

采用分离得到的人外周血单个核细胞(PBMC)，分别在CD40抗体(1μg/mL)、LPS(10μg/mL)和CpG-2395(4μg/mL)刺激条件下，加入丁酸钠(0.5mM)，考察对Breg细胞的诱导作用。

如图1中(C)所示，PBMC细胞经CD40(1μg/mL)、LPS(10μg/mL)和CpG-2395(4μg/mL)诱导培养2天后，流式检测Breg细胞(CD19

采用分离得到的人外周血单个核细胞(PBMC)，在CD40抗体刺激条件下(1μg/mL)，加入短链脂肪酸乙酸钠(0.5mM)、丁酸钠(0.5mM)、戊酸钠(0.5mM)，考察对Breg细胞的诱导作用。

如图1中(D)所示，PBMC细胞经CD40(1μg/mL)诱导培养2天后，流式检测Breg细胞(CD19

取小鼠脾脏纯化B细胞在LPSCD40(请指明使用浓度1μg/mL)刺激条件下，0.5mM不同短链脂肪酸(乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠)诱导处理48h，通过RT-qPCR检查细胞内IL-10和Prdm1基因mRNA水平。

如图1中(E)所示，相较对照组，乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠处理细胞后，IL10表达水平分别上升1.22倍(乙酸钠)、2.17倍(丙酸钠)、6.26倍(丁酸钠)、2.76倍(戊酸钠)；同时，PRDM1表达水平分别上升1.11倍(乙酸钠)、1.67倍(丙酸钠)、3.44倍(丁酸钠)、2.78倍(戊酸钠)。以上结果表明：小鼠脾脏B细胞在CD40抗体诱导条件下，除乙酸外其余SCFA能够上调IL10及其转录因子PRDM1转录水平。

实施例2考察丁酸钠对小鼠Breg细胞增殖的诱导分化作用

小鼠脾脏B细胞(2μM)经CFSE(2μM)染色后，在CD40抗体(1μg/mL)、LPS(10μg/mL)和CpG-1826(40nM)刺激培养联合丁酸钠(0.5mM)诱导48h、72h和96h后细胞增殖及Breg细胞比例变化情况。

纯化小鼠脾脏B细胞预染CFSE染料后，以CD40抗体(1μg/mL)刺激作为对照组，实验组在对照组基础上分别加入丁酸钠(0.5mM)。细胞分别培养48、72和96h用于流式分析B细胞增殖及Breg细胞比例。

如图2中(A)所示，对照组B细胞增殖比例分别为5.6％(48h)、53.6％(72h)、63.5％(96h)；丁酸钠处理后，B细胞增殖比例依次为1.87％(48h)、26.6％(72h)、33.9％(96h)。对照组中，分裂细胞及未分裂细胞中Breg细胞分别占0.65％和7.59％(48h)、5.51％和4.75％(72h)、8.86％和3.23％(96h)；丁酸钠处理后，分裂细胞及未分裂细胞中Breg细胞分别占0.57％和9.34％(48h)、3.3％和7.39％(72h)、7.03％和5.51％(96h)。以上结果表明，CD40诱导条件下，丁酸钠能够抑制B细胞增殖，同时促进Breg细胞分化。

纯化小鼠脾脏B细胞预染CFSE染料后，以LPS(10μg/mL)刺激作为对照组，实验组在对照组基础上分别加入丁酸钠(0.5mM)。细胞分别培养48、72和96h后，流式检测B细胞增殖及Breg细胞比例。

结果如图2中(B)所示，对照组B细胞增殖比例分别为77.0％(48h)、87.2％(72h)、88％(96h)；丁酸钠处理后，B细胞增殖比例依次为65.4％(48h)、81.8％(72h)、88％(96h)。对照组中，分裂细胞及未分裂细胞中Breg细胞分别占11.9％和2.43％(24h)、14.7％和1.53％(48h)、27.7％和1.71％(96h)；丁酸钠处理后，分裂细胞及未分裂细胞中Breg细胞分别占18.0％和8.21％(48h)、34.7％和4.77％(72h)、50％和2.64％(96h)。以上结果表明，LPS诱导条件下，丁酸能够抑制B细胞增殖，同时促进Breg细胞分化。

纯化小鼠脾脏B细胞预染CFSE染料后，以CpG-1826(40nM)刺激作为对照组，实验组在对照组基础上分别加入丁酸钠(0.5mM)。细胞分别培养48、72和96h后，流式检测B细胞增殖及Breg细胞比例。

结果如图2中(C)所示，对照组B细胞增殖比例分别为60.2％(48h)、85.9％(72h)、89.2％(96h)；丁酸钠处理后，B细胞增殖比例依次为43.9％(48h)、73.0％(72h)、81.5％(96h)。对照组中，分裂细胞及未分裂细胞中Breg细胞分别占7.65％和4.13％(24h)、10.0％和1.84％(48h)、13.6％和2.10％(96h)；丁酸钠处理后，分裂细胞及未分裂细胞中Breg细胞分别占18.0％和5.17％(48h)、18.6％和5.32％(72h)、39.0％和6.83％(96h)。以上结果表明，CpG-2395诱导条件下，丁酸能够抑制B细胞增殖，同时促进Breg细胞分化。

实施例3考察丁酸钠对小鼠Breg细胞增殖及凋亡作用

脾脏纯化B细胞(5×10

如图3中(A)所示，小鼠脾脏B细胞在CD40抗体(1μg/mL)培养条件下，B细胞生长较慢(约为6.4±0.2×10

如图3中(B)所示，小鼠脾脏B细胞在CD40抗体(1μg/mL)培养条件下，2天后，通过统计B细胞数量及Breg所占比例计算培养体系中Breg细胞数量。结果显示，CD40抗体(1μg/mL)培养条件下，Breg细胞数约为4.5±0.3×10

如图3中(C)所示，小鼠脾脏B细胞在CD40抗体(1μg/mL)培养条件下，2天后，通过live/dead染料对细胞死活进行评估。结果显示，CD40抗体(1μg/mL)培养条件下，死亡细胞占比24.4％，丁酸钠作用后，死亡细胞占比23.7％，无明显差异；在LPS(10μg/mL)培养条件下，死亡细胞占比15.6％，丁酸钠作用后，死亡细胞占比16.2％，无明显差异。以上结果表明，在CD40抗体或LPS培养条件下，丁酸对B细胞死亡无明显影响。

实施例4考察短链脂肪酸的HDAC对Breg细胞的诱导作用

脾脏纯化B细胞在LPS刺激条件下，经短链脂肪酸和HDACi Trichostatin A(TSA)诱导后，考察HDAC的百分比，其中，乙酸钠的浓度分别为0.5mM、1mM，丙酸钠的浓度分别为0.5mM、1mM，丁酸钠的浓度分别为0.5mM、1mM，戊酸钠的浓度分别为0.5mM、1mM，TSA的浓度为0.5μM。

小鼠脾脏B细胞在LPS(10μg/mL)诱导条件下培养2天，分别加入乙酸钠(0.5Mm、1mM)、丙酸钠(0.5Mm、1mM)、丁酸钠(0.5Mm、1mM)、戊酸钠(0.5Mm、1mM)培养2天并用细胞核/浆蛋白抽提试剂盒试剂(康为)提取核蛋白，采用HDAC Activity/Inhibition Assay Kit(Fluorometric)试剂盒测定HDAC抑制活性。

结果如图4中(A)所示，阳性对照组TSA处理后，HDAC活性受抑制程度为84.33％，SCFA处理细胞后HDAC活性受抑制程度依次为7.51％(0.5mM乙酸钠)、10.94％(1mM乙酸钠)、19.55％(0.5mM丙酸钠)、34.57％(1mM丙酸钠)、37.23％(0.5mM丁酸钠)、64.76％(1mM丁酸钠)、35.90％(0.5mM戊酸钠)、44.81％(1mM戊酸钠)。以上结果表明：短链脂肪酸可以抑制HDAC活性，在相同浓度下，丁酸钠HDAC抑制活性最强。

纯化脾脏B细胞以CD40抗体(1μg/mL)或LPS(10μg/mL)刺激细胞分别作为对照组，对照组基础上加入乙酸钠(1mM、10mM)培养作为实验组，细胞培养2天后流式检测Breg细胞比例。

结果如图中4(B)所示，对照组Breg细胞比例分别为8.12％(CD40)、13.9％(LPS)，1mM乙酸钠处理后，Breg细胞比例分别为：8.89％(CD40)、15.0％(LPS)，10mM乙酸钠处理后，Breg细胞比例分别为：10.4％(CD40)、21.2％(LPS)。以上结果表明，提高乙酸钠浓度后，可以显著诱导Breg细胞分化。

小鼠纯化脾脏B细胞在Cd40抗体(1μg/mL)或LPS(10μg/mL)刺激条件细胞作为对照组，实验组在对照组基础上分别加入TSA(1nM、10nM)、Vorinostat(100nM、500nM)或丁酸钠(0.5mM)培养，2天后流式检测Breg细胞比例。

结果如图4中(C)所示，对照组Breg细胞比例分别为8.00％(CD40)、10.7％(LPS)；HDAC抑制剂或丁酸钠处理后，Breg细胞比例依次为CD40组：13.3％(1nM TSA)、15.8％(10nMTSA)、13.0％(0.5mM乙酸钠)、12.5％(100nM Vorinostat)、14.7％(500nM Vorinostat)；LPS组：17.3％(1nM TSA)、31.5％(10nM TSA)、24.7％(0.5mM乙酸钠)、13.2％(100nMVorinostat)、23.5％(500nM Vorinostat)。以上结果表明，HDAC抑制剂能够诱导Breg细胞体外分化。

纯化脾脏B细胞在CD40抗体(1μg/mL)或LPS(10μg/mL)刺激细胞作为对照组，实验组在对照组基础上分别加入丁酸钠(0.5mM)或丁酸钠(0.5mM)+Anacardic acid(10μM)，细胞培养2天后流式检测Breg细胞比例。

结果如图4中(D)所示，对照组Breg细胞比例分别为8.63％(CD40)、14.5(LPS)；丁酸处理后Breg细胞比例分别为13.0％(CD40)、27.4(LPS)；而丁酸联合Anacardic acid处理后，Breg细胞比例分别为10.2％(CD40)、23.9(LPS)。上述结果表明，丁酸钠可以通过抑制HDAC活性增加Breg细胞比例，而抑制乙酰转移酶活性后可以部分抵制丁酸诱导Breg细胞分化效果。

实施例5考察短链脂肪酸在小鼠体内对Breg细胞的诱导作用

选择C57BL/6小鼠，构建胶原蛋白诱导关节炎(CIA)疾病模型小鼠(DBA1小鼠)及DSS诱导急性肠炎小鼠(C57BL/6)。

图5中(A)为SCFAs处理C57BL/6J健康小鼠的过程，将小鼠随机分组，首先给予vancomycin(500mg/L),neomycin(1g/L)和metronidazole(1g/L)这三种抗生素联合干预小鼠7天以清除肠道细菌，然后在处死取样前在饮用水中给予短链脂肪酸(150mM)3周，此过程同样按前述方法给以抗生素饮水干预，进而考察短链脂肪酸在小鼠体内对Breg细胞的诱导作用。

细胞在染色前用L+PIM培养5h，如图5中(B)所示，左图为小鼠PBMC中CD19

图5中(C)为短链脂肪酸治疗DBA/1J小鼠预防胶原诱导关节炎的过程示意图，第28天给予50μL CII(2mg/mL)+50μL CFA免疫，第49天给予50μL CII+50μL IFA免疫增强，从第7～60天开始在饮用水中添加短链脂肪酸(150mM)，第60天处死小鼠取脾脏细胞。

细胞用CD40单抗培养48h,L+PIM培养5h。如图5中(D)所示，左图小鼠脾细胞中CD19

图5中(E)为SCFAs治疗C57BL/6小鼠预防DSS诱导结肠炎的程序示意图。将小鼠随机分组，实验组小鼠提前2天每日给与腹腔注射丁酸钠(1mg/kg)，2天后以2.5％DSS溶液诱导结肠炎，7天后换成正常饮水并在第10天取材分析。

细胞在染色前用L+PIM培养5h。如图5中(F)所示，左图小鼠脾脏或腹腔液中CD19

实施例6鉴定细胞功能

6.1Breg细胞体外抑制功能的鉴定

1)纯化脾脏B细胞并诱导Breg细胞分化2d。

2)共培养当天，准备圆底96孔板，PBS配置5μg/ml anti-mouse CD3溶液，每个孔内分别加入50μL anti-mouse CD3溶液，然后放入37℃培养箱孵育1.5～3h或4℃冰箱过夜包板。孵育结束后200μL PBS漂洗2次，待用。

3)Breg细胞诱导2d后收集混合细胞，PBS漂洗2次后，1640完全培养基重悬并计数，调整至合适密度(4×10

4)将Breg(50μL或100μL)细胞与CFSE预染的脾脏淋巴细胞(50μL)按2×10

5)培养基配置4μg/mL anti-mouse CD28溶液，每孔分别加入50μL溶液。

6)每孔补足体积至200μL，放入培养箱继续培养3d。

7)3d后，收集细胞，流式染色，检测CD4和CD8 T淋巴细胞增殖情况。

如图6中(A)所示，对照组中，CD4+T细胞增殖比例为88.0％，CD8+T细胞增殖比例为91.9％；Breg与脾脏细胞共培养(20×10

6.2丁酸钠干预DSS诱导的肠炎实验

1)DSS试剂准备：2.5％DSS水溶液(0.22μM过滤除菌)，4℃备用。

2)分组：①阴性对照组；②DSS造模+PBS组；③DSS造模+丁酸钠干预组；每组8只小鼠。

3)造模：造模当日，记录小鼠体重情况，然后第①组小鼠不做处理，第②组和第③组给以2.5％DSS饮水，实验过程中保证DSS饮水充足，每2～3天更换一次DSS饮水，第7天后换成正常饮水，并继续观察3天。

4)DSS评分，每日记录体重，观察便血和腹泻情况，统计小鼠发病情况。

小鼠肠炎疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分标准如下：

注：DAI评分记作三项评分平均数。

5)组织病理学评分

将结肠组织末端冲洗干净后固定，制作石蜡切片，HE染色并评分。

注：病理组织学评分为各项指标之和。

如图6中(B)所示，与对照组①中小鼠相比，造模组②中小鼠疾病活动指数大幅升高，丁酸干预后③中小鼠DAI评分显著降低。HE病理切片结果显示，对照组①中结肠隐窝结构正常，无明显淋巴细胞浸润，造模组②中小鼠出现典型肠炎症状：隐窝遭到明显破坏，伴有大量淋巴细胞浸润和杯状细胞缺失。通过每日腹腔注射丁酸钠，③中小鼠肠炎症状得到明显改善，炎性细胞浸润程度降低。

如图6中(C)所示，第10天处死小鼠，分别取血液，脾脏和肠系膜淋巴结细胞进行流式染色分析。结果显示，组①中小鼠血液、脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+Foxp3+细胞含量分别为4.36％，11.3％，4.81％；组②中小鼠血液、脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+Foxp3+细胞含量有所增加，分别为6.06％，14.2％，8.13％；组③中小鼠血液、脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+Foxp3+细胞含量进一步增加，分别为7.72％，16.7％，10.4％。右图为统计结果

以上结果显示，丁酸钠干预后有效改善肠炎症状，同时能增加Treg细胞比例。

6.3Breg细胞治疗疾病的实验

1)DSS造模：准备2.5％DSS水溶液(0.22μM过滤除菌)，bc组小鼠给以DSS饮水，每2～3天更换新鲜DSS溶液，7天后换成ddH

2)分组：①DSS造模组；②DSS造模+Breg过继治疗组；③DSS造模+丁酸钠处理的Breg过继治疗组；每组8只小鼠。

3)造模第1、3、5天，②③组分别腹腔注射LPS诱导的Breg细胞，每只小鼠接种2×10

4)DSS评分，每日记录体重，观察便血和腹泻情况，统计发病情况。

如图6中(D)所示，DSS造模后，小鼠疾病活动指数逐渐升高，过继体外LPS诱导的Breg细胞后疾病活动指数有所下降，而接种丁酸诱导的Breg细胞后疾病活动指数有所下降进一步下降。HE切片结果显示，相较于DSS造模组，直接过继体外LPS诱导的Breg细胞后结肠炎性细胞浸润程度有所改善，而接种丁酸钠诱导的Breg细胞后结肠炎性浸润进一步改善。

如图6中(E)所示，第10天处死小鼠，分别取脾脏和肠系膜淋巴结细胞进行流式染色分析。结果显示，组①中小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+Foxp3+细胞含量分别为17.2％，18.7％；组②中小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+Foxp3+细胞含量有所增加，分别为17.6％，19.1％；组③中小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+Foxp3+细胞含量进一步增加，分别为21.6％，22.4％。

以上结果显示，DSS诱发小鼠急性肠炎实验中，过继输入体外丁酸钠处理后的Breg细胞后有效改善肠炎症状，同时能增加Treg细胞比例。

6.4短链脂肪酸干预关节炎小鼠

1)分组：4～5周DBA/1小鼠购自北京维通丽华，共设置5组，每组5只，依次为组①：对照组；组②：CIA造模组；组③：乙酸钠+CIA造模组；组④：丁酸钠+CIA造模组；组⑤：戊酸钠+CIA造模组；

2)SCFA干预：造模开始前三周，组③④⑤分别将饮水替换为相应脂肪酸饮水：150mM乙酸钠、丁酸钠、戊酸钠溶液，组①②保持正常饮水，直至实验结束。

3)一次免疫：三种后，开始造模，组②③④⑤小鼠尾部皮内分别接种100μL乳化液(100μg II型鸡胶原蛋白(2mg/mL)+50μL氟氏完全佐剂(含5mg/mL灭活结核分枝杆菌))

4)二次免疫：21天后，组②③④⑤小鼠再次接种100μL乳化液(100μg II型鸡胶原蛋白(2mg/mL)+50μL氟氏不完全佐剂)。

5)疾病观察：2次免疫前三天，开始观察小鼠关节炎发病情况。

如图6中(F)所示，相较对照组①，造模组②出现典型关节炎症状，丁酸钠或戊酸钠干预后，CIA小鼠发病得到缓解，而乙酸钠干预后无明显改善效果。以上结果显示，丁酸钠或乙酸钠能够用于治疗关节炎。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。