能够结合CD3和CD137但不同时结合CD3和CD137的抗原结合分子

技术领域

本发明涉及结合CD3和CD137(4-1BB)的抗原结合分子及其使用方法。

背景技术

抗体在血浆中具有很高的稳定性并且产生很少的不良反应，因而作为药物而受到关注(Nat.Biotechnol.(2005)23,1073-1078(NPL 1)和Eur J Pharm Biopharm.(2005)59(3),389-396(NPL 2))。抗体不仅具有抗原结合作用和激动剂或拮抗剂作用，而且诱导效应细胞介导的细胞毒活性(也称为效应子功能)，例如ADCC(抗体依赖性细胞毒性)、ADCP(抗体依赖性细胞吞噬)或CDC(补体依赖性细胞毒性)。特别地，IgG1亚类的抗体对癌细胞表现出效应子功能。因此，在肿瘤学领域中开发了大量的抗体药物。

为了使发挥抗体的ADCC、ADCP或CDC，必须使它们的Fc区与存在于效应细胞(例如NK细胞或巨噬细胞等)上的抗体受体(FcγR)和各种补体成分相结合。对于人而言，作为FcγR的蛋白质家族，已报道了FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb同种型，也已报道了它们各自的同种异型(Immunol.Lett.(2002)82,57-65(NPL3))。在这些同种型中，FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa在其细胞内结构域中具有称为ITAM(ImmunoreceptorTyrosine-based Activation Motif，免疫受体酪氨酸活化基序)的结构域，该结构域传导活化信号。相比之下，仅FcγRIIb在其细胞内结构域中具有称为ITIM(ImmunoreceptorTyrosine-based Inhibitory Motif，基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)的结构域，该结构域转导抑制信号。已知FcγR的这些同种型通过免疫复合体等得以交联，从而转导信号(Nat.Rev.Immunol.(2008)8,34-47(NPL4))。实际上，抗体对癌细胞发挥效应子功能时，通过结合到癌细胞膜上的多个抗体的Fc区，效应细胞膜上的FcγR分子被聚簇，并因此通过效应细胞转导活化信号。其结果，可以发挥细胞杀伤效果。在这一方面，FcγR的交联被限定为位于癌细胞附近的效应细胞，这表明免疫的活化定位于癌细胞(Ann.Rev.Immunol.(1988).6,251-81(NPL5))。

天然存在的免疫球蛋白通过其可变区与抗原结合，并通过其恒定区与FcγR、FcRn、FcαR、FcεR等受体或补体结合。FcRn的每个分子(与IgG Fc区相互作用的结合分子)以一对一连接的方式与抗体的每个重链结合。因此，据报道，两个分子的FcRn与一个IgG型抗体分子结合。与FcRn等不同，FcγR与抗体铰链区和CH2结构域相互作用，并且仅一个分子的FcγR与一个IgG型抗体分子结合(J.Bio.Chem.,(20001)276,16469-16477)。对于FcγR和抗体的Fc区之间的结合，已经发现在抗体的铰链区和CH2结构域中的一些氨基酸残基以及添加到CH2结构域的Asn 297(EU编号)的糖链是重要的(Chem.Immunol.(1997),65,88-110(NPL 6),Eur.J.Immunol.(1993)23,1098-1104(NPL 7),和Immunol.(1995)86,319-324(NPL 8))。先前已经通过关注该结合位点来研究具有各种FcγR结合特性的Fc区变体，以产生对活化FcγR具有更高结合活性的Fc区变体(WO2000/042072(PTL 1)和WO2006/019447(PTL 2))。例如，Lazar等人已分别用Asn，Leu和Glu取代人IgG1的Ser 239，Ala 330和Ile332(EU编号)，成功地将人IgG1对人FcγRIIIa(V158)的结合活性提高了约370倍(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103,4005-4010(NPL 9)和WO2006/019447(PTL 2))。就FcγRIIIa与FcγIIb之比(A/I比)而言，这种改变的形式具有约9倍于野生型的结合活性。备选地，Shinkawa等人已经通过缺失添加到Asn 297(EU编号)上的糖链的岩藻糖成功地将对FcγRIIIa的结合活性提高至约100倍(J.Biol.Chem.(2003)278，3466-3473(NPL10))。与天然存在的人IgG1相比，这些方法可以大大改善人IgG1的ADCC活性。

天然存在的IgG型抗体通常通过其可变区(Fab)识别并结合一个表位，因此只能结合一种抗原。同时，已知许多类型的蛋白质参与癌症或炎症，并且这些蛋白质可能彼此串扰。例如，已知某些炎性细胞因子(TNF，IL1和IL6)参与免疫疾病(Nat.Biotech.，(2011)28，502-10(NPL 11))。另外，已知其他受体的活化是构成癌症获得耐药性的基础的一种机制(Endocr Relat Cancer(2006)13，45-51(NPL 12))。在这种情况下，识别一个表位的常规抗体不能抑制多种蛋白质。

已经研究了通过一个分子与两种或更多种类型的抗原结合的抗体(这些抗体称为双特异性抗体)作为抑制多个靶标的分子。可以通过修饰天然存在的IgG型抗体来赋予针对两种不同抗原(第一抗原和第二抗原)的结合活性(mAbs.(2012)Mar 1，4(2))。因此，这种抗体不仅具有通过一个分子中和这两种或更多种类型抗原的作用，而且还具有通过具有针对癌细胞的细胞毒活性的细胞的交联来增强抗肿瘤活性的作用。具有添加在抗体的N或C末端的抗原结合位点的分子(DVD-Ig，TCB和scFv-IgG)，具有抗体的两个Fab区的不同序列的分子(共同L链双特异性抗体和杂交的杂交瘤)，一个Fab区识别两种抗原的分子(二合一IgG和DutaMab)以及具有CH3结构域环作为另一个抗原结合位点(Fcab)的分子，先前已被报道为双特异性抗体的分子形式(Nat.Rev.(2010)，10，301-316(NPL 13)和Peds(2010)，23(4)，289-297(NPL 14))。由于这些双特异性抗体中的任何一个在其Fc区与FcγR相互作用，因此抗体效应子功能得以保留。

如果双特异性抗体识别的所有抗原都是在癌症中特异性表达的抗原，则与任何一种抗原结合的双特异性抗体均表现出对癌细胞的细胞毒活性，因此可以预期具有比识别一种抗原的常规抗体更有效的抗癌作用。然而，在双特异性抗体识别的任何一种抗原在正常组织中表达或是在免疫细胞上表达的细胞的情况下，由于与FcγR的交联，会发生对正常组织的伤害或细胞因子的释放(J.Immunol.(1999)Aug 1,163(3),1246-52(NPL15))。结果，引起强烈的不良反应。

例如，已知catumaxomab是双特异性抗体，其识别在T细胞上表达的蛋白质和在癌细胞上表达的蛋白质(癌抗原)。Catumaxomab在两个Fab处分别结合在T细胞上表达的癌抗原(EpCAM)和CD3ε链。Catumaxomab通过同时结合癌抗原和CD3ε链诱导T细胞介导的细胞毒活性，并通过同时结合癌抗原和FcγR诱导NK细胞或抗原呈递细胞(例如巨噬细胞)介导的细胞毒活性。通过使用这两种细胞毒活性，catumaxomab通过腹膜内施用对恶性腹水表现出很高的治疗效果，因此已在欧洲获得批准(Cancer Treat Rev.(2010)Oct 36(6)，458-67(NPL 16))。此外，据报道，在某些情况下，施用catumaxomab会产生癌细胞反应性抗体，证明诱导了获得性免疫(Future Oncol.(2012)Jan 8(1)，73-85(NPL 17))。由该结果可知，这种具有T细胞介导的细胞毒活性以及由NK细胞或巨噬细胞等细胞通过FcγR引起的作用的抗体(这些抗体特别被称为三功能抗体)已受到关注，因为可以预期较强的抗肿瘤作用和诱导获得性免疫。

但是，即使在没有癌抗原的情况下，三功能抗体也同时结合CD3ε和FcγR，因此即使在没有癌细胞的环境中，也能使表达CD3ε的T细胞与表达FcγR的细胞交联，以生产大量的多种细胞因子。这种不依赖于癌抗原的对产生多种细胞因子的诱导将三功能抗体的当前施用限制为腹膜内途径(Cancer Treat Rev.2010 Oct 36(6)，458-67(NPL 16))。由于严重的细胞因子风暴样不良反应，三功能抗体很难全身施用(Cancer ImmunolImmunother.2007 Sep；56(9):1397-406(NPL 18))。

常规技术的双特异性抗体能够同时结合两种抗原，即第一抗原癌抗原(EpCAM)和第二抗原CD3ε，并与FcγR结合，因此从其分子结构来看，不能避免由于同时结合FcγR和第二抗原CD3ε而引起的这种不良反应。

近年来，通过使用对FcγR的结合活性降低的Fc区，提供了一种在避免不良反应的同时引起T细胞介导的细胞毒活性的修饰抗体(WO2012/073985)。

然而，从其分子结构来看，即使这样的抗体在结合至癌抗原时也不能作用于两种免疫受体，即CD3ε和FcγR。

尚未得知以癌抗原特异性方式同时发挥由T细胞介导的细胞毒活性和由T细胞以外的细胞介导的细胞毒活性，同时规避不良反应的抗体。

T细胞在肿瘤免疫中起着重要的作用，并且已知会被两种信号活化：1)T细胞受体(TCR)与主要组织相容性复合物(MHC)I类分子呈递的抗原肽的结合以及TCR的活化；和2)T细胞表面上的共刺激物与抗原呈递细胞上的配体的结合以及该共刺激物的活化。此外，T细胞表面的CD137(4-1BB)等属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族和TNF受体超家族的分子的活化对于T细胞活化很重要(Vinay,2011,Cellular&Molecular Immunology,8,281-284(NPL19))。

已经证明CD137激动剂抗体具有抗肿瘤作用，并且实验证明这主要归因于CD8阳性T细胞和NK细胞的活化(Houot，2009，Blood，114，3431-8(NPL 20))。还应理解，被改造成具有嵌合抗原受体分子(CAR-T细胞)的T细胞可以增强功效的持久性，所述T细胞由作为细胞外结构域的肿瘤抗原结合结构域和作为细胞内结构域的CD3和CD137信号转导结构域组成(Porter，N ENGL J MED，2011，365；725-733(NPL 21))。然而，由于其非特异性肝毒性，这种CD137激动剂抗体的副作用在临床和非临床上都是问题，并且药剂的开发尚未进展(Dubrot，Cancer Immunol.Immunother.，2010，28，512-22(NPL 22))。已经表明，这种副作用的主要原因涉及抗体通过抗体恒定区与Fcγ受体的结合(Schabowsky，Vaccine，2009，28，512-22(NPL 23))。此外，据报道，对于靶向属于TNF受体超家族的受体以在体内发挥激动剂活性的激动剂抗体，通过表达Fcγ受体的细胞(表达FcγRII的细胞)进行抗体交联是必要的(Li，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2013，110(48)，19501-6(NPL 24))。WO2015/156268(PTL 3)描述了具有具CD137激动活性的结合结构域和针对肿瘤特异性抗原的结合结构域的双特异性抗体仅在表达肿瘤特异性抗原的细胞存在下才可能发挥CD137激动活性并活化免疫细胞，通过它可以避免CD137激动剂抗体的肝毒性不良事件，同时保留该抗体的抗肿瘤活性。WO2015/156268进一步描述了通过将这种双特异性抗体与另一种双特异性抗体组合使用，可以进一步增强抗肿瘤活性，并且可以避免这些不良事件，所述另一种双特异性抗体具有具有CD3激动活性的结合域和针对肿瘤特异性抗原的结合结构域。还已经报道了具有针对CD137、CD3和肿瘤特异性抗原(EGFR)的三个结合结构域的三特异性抗体(WO2014/116846(PTL 4))。然而，尚未得知能够以癌抗原特异性方式通过CD137发挥T细胞介导的细胞毒活性和T细胞及其他免疫细胞的活化活性同时避免不良反应的抗体。

引用列表

专利文献

[PTL 1]WO2000/042072

[PTL 2]WO2006/019447

[PTL 3]WO2015/156268

[PTL 4]WO2014/116846

非专利文献

[NPL 1]Nat.Biotechnol.(2005)23,1073-1078

[NPL 2]Eur J Pharm Biopharm.(2005)59(3),389-396

[NPL 3]Immunol.Lett.(2002)82,57-65

[NPL 4]Nat.Rev.Immunol.(2008)8,34-47

[NPL 5]Ann.Rev.Immunol.(1988).6.251-81

[NPL 6]Chem.Immunol.(1997),65,88-110

[NPL 7]Eur.J.Immunol.(1993)23,1098-1104

[NPL 8]Immunol.(1995)86,319-324

[NPL 9]Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103,4005-4010

[NPL 10]J.Biol.Chem.(2003)278,3466-3473

[NPL 11]Nat.Biotech.,(2011)28,502-10

[NPL 12]Endocr Relat Cancer(2006)13,45-51

[NPL 13]Nat.Rev.(2010),10,301-316

[NPL 14]Peds(2010),23(4),289-297

[NPL 15]J.Immunol.(1999)Aug 1,163(3),1246-52

[NPL 16]Cancer Treat Rev.(2010)Oct 36(6),458-67

[NPL 17]Future Oncol.(2012)Jan 8(1),73-85

[NPL 18]Cancer Immunol Immunother.2007 Sep；56(9):1397-406

[NPL 19]Vinay,2011,Cellular&Molecular Immunology,8,281-284

[NPL 20]Houot,2009,Blood,114,3431-8

[NPL 21]Porter,N ENGL J MED,2011,365；725-733

[NPL 22]Dubrot,Cancer Immunol.Immunother.,2010,28,512-22

[NPL 23]Schabowsky,Vaccine,2009,28,512-22

[NPL 24]Li,Proc Natl Acad Sci USA.2013,110(48),19501-6

发明内容

技术问题

已经报道了包含肿瘤特异性抗原(EGFR)结合结构域，CD137结合结构域和CD3结合结构域的三特异性抗体(WO2014116846)。然而，由于具有这种分子形式的抗体可以同时结合三种不同的抗原，本发明人推测那些三特异性抗体可以导致表达CD3ε的T细胞和表达CD137的细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞、DC等)通过同时结合CD3和CD137而交联。

此外，已经报道了针对CD8和CD3ε的双特异性抗体诱导了CD8阳性T细胞之间的相互细胞毒性，因为该抗体使它们交联(Wong，Clin.Immunol.Immunopathol.1991，58(2)，236-250)。因此，本发明人推测针对T细胞上表达的分子和CD3ε的双特异性抗体也将诱导T细胞之间的相互细胞毒性，因为它们将使表达该分子和CD3ε的细胞交联。

解决问题的方法

本发明提供了结合CD3和CD137的抗原结合结构域及其使用方法。本发明还提供了获得可更有效地诱导T细胞依赖性细胞毒性的抗原结合分子的方法。

本发明人已经成功地制备了抗原结合分子，其包含能够结合CD3和CD137(4-1BB)但不同时结合CD3和CD137的抗体可变区，和与不同于CD3和CD137的第三抗原结合的可变区，所述第三抗原优选为在癌组织中特异性表达的分子，更优选Glypican-3(GPC3)。通过改善与CD3和/或CD137的结合活性，发明人成功地制备了抗原结合分子，其通过结合三种不同的抗原而表现出由这些抗原结合分子诱导的增强的T细胞依赖性细胞毒性活性。此类抗原结合分子可用于免疫治疗，同时能够避免由于常规多特异性抗原结合分子与在不同细胞上表达的抗原结合而导致的不同细胞之间的交联，这被认为是当多特异性抗原结合分子用作药物时造成不良反应的原因。

更具体地，本发明提供以下内容:

[1]抗原结合分子，其包含：

能够结合CD3和CD137但不同时结合CD3和CD137的抗体可变区，其中抗原结合分子以小于5x10

37℃，pH 7.4，20mM ACES，150mM NaCl，0.05％Tween 20，0.005％NaN3；将抗原结合分子固定在CM4传感器芯片上，抗原用作分析物。

[1A][1]的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子以5×10

37℃，pH 7.4，20mM ACES，150mM NaCl，0.05％Tween 20，0.005％NaN3；将抗原结合分子固定在CM4传感器芯片上，抗原用作分析物。

[1B][1]至[1A]的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子以2×10

25℃，pH 7.4，20mM ACES，150mM NaCl，0.05％Tween 20，0.005％NaN3；将抗原结合分子固定在CM4传感器芯片上，抗原用作分析物。

[2][1]至[1B]的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子与以下结合：

(a)CD3ε(CD3ε)的细胞外结构域的至少一个，两个，三个或更多个氨基酸残基，其包含SEQ ID No：159的氨基酸序列；和/或

(b)CD137的N端区域的至少一个，两个，三个或更多个氨基酸残基，其包含人CD137的LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC(SEQ ID NO:152)，优选LQDPCSN，NNRNQI和/或GQRTCDI的氨基酸序列。

[3][1]至[2]的抗原结合分子，其中所述抗体可变区是具有1至25个氨基酸改变的抗体可变区，其中待改变的氨基酸是环中的氨基酸，FR3区中的氨基酸或选自抗体H链可变结构域中Kabat编号位置31至35、50至65、71至74和95至102以及L链可变结构域中Kabat编号位置24至34、50至56和89至97的氨基酸。

[3A][1]至[3]中任一项的抗原结合分子，其中所述重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)包含一个或更多个选自表1.3(a)至表1.3(d)的氨基酸取代，其中一个或更多个氨基酸取代显示相对于表1.3(a)至表1.3(d)中所述CD3和/或CD137至少0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5或2倍的结合亲和力增加。在一些实施方案中，抗体可变区优选包含：

(a)重链可变结构域氨基酸序列，其在以下每个位置(均通过Kabat编号)包含针对该位置指示的一个或更多个以下氨基酸残基：

在氨基酸位置26的A、D、E、I、G、K、L、M、N、R、T、W或Y；

在氨基酸位置27的D、F、G、I、M或L；

在氨基酸位置28的D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置29的F或W；

在氨基酸位置30的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置31的F、I、N、R、S、T或V；

在氨基酸位置32的A、H、I、K、L、N、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置33的W；

在氨基酸位置34的F、I、L、M或V；

在氨基酸位置35的F、H、S、T、V或Y；

在氨基酸位置50的E、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、W或Y；

在氨基酸位置51的I、K或V；

在氨基酸位置52的K、M、R或T；

在氨基酸位置52b的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；

在氨基酸位置52c的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置53的A、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置54的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置55的E、F、G、H、L、M、N、Q、W或Y；

在氨基酸位置56的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置57的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置58的A、F、H、K、N、P、R或Y；

在氨基酸位置59的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置60的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置61的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置62的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置63的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置64的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置65的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置93的H或R；

在氨基酸位置94的F、G、H、L、M、S、T、V或Y；

在氨基酸位置95的I或V；

在氨基酸位置96的F、H、I、K、L、M、T、V、W或Y；

在氨基酸位置97的F、Y或W；

在氨基酸位置98的A、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置99的A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100a的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100b的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100c的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100d的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100e的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100f的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100g的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100h的A、D、E、G、H、I、L、M、N、P、S、T或V；

在氨基酸位置100i的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置101的A、D、F、I、L、M、N、Q、S、T或V；

在氨基酸位置102的A、D、E、F、G、H、IK、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

和/或

(b)轻链可变结构域氨基酸序列，其在以下每个位置(均通过Kabat编号)包含针对该位置指示的一个或更多个以下氨基酸残基：

在氨基酸位置24的A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置25的A、G、N、P、S、T或V；

在氨基酸位置26的A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置27的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27a的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27b的A、I、L、M、P、T或V；

在氨基酸位置27c的A、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；

在氨基酸位置27d的A、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27e的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置28的G、N、S或T；

在氨基酸位置29的A、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、W或Y；

在氨基酸位置30的A、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W或Y；

在氨基酸位置31的I、L、Q、S、T或V；

在氨基酸位置32的F、W或Y；

在氨基酸位置33的A、F、H、L、M、Q或V；

在氨基酸位置34的A、H或S；

在氨基酸位置50的I、K、L、M或R；

在氨基酸位置51的A、E、I、K、L、M、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置52的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置53的A、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；

在氨基酸位置54的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置55的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；

在氨基酸位置56的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置89的A、G、K、S或Y；

在氨基酸位置90的Q；

在氨基酸位置91的G；

在氨基酸位置92的A、D、H、K、N、Q、R、S或T；

在氨基酸位置93的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置94的A、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置95的P；

在氨基酸位置96的F或Y；

在氨基酸位置97的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或V。

[4][1]-[3A]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗体可变区包含以下任一项：

(a1)包含与SEQ ID NO:16有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:30有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:44有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a2)包含与SEQ ID NO:17有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:31有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:45有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:64有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:69有至少至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:74有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a3)包含与SEQ ID NO:18有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:32有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:46有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a4)包含与SEQ ID NO:19有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:33有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:47有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a5)包含与SEQ ID NO:19有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:33有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:47有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:65有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:70有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:75有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a6)包含与SEQ ID NO:20有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:34有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:48有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a7)包含与SEQ ID NO:22有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:36有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:50有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a8)包含与SEQ ID NO:23有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:37有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:51有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a9)包含与SEQ ID NO:23有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:37有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:51有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:66有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:71有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:76有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a10)包含与SEQ ID NO:24有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:38有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:52有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a11)包含与SEQ ID NO:25有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:39有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:53有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:66有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:71有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:76有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a12)包含与SEQ ID NO:26有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:40有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:54有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:66有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:71有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:76有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a13)包含与SEQ ID NO:26有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:40有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:54有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a14)包含与SEQ ID NO:27有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:41有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:55有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a15)包含与SEQ ID NO:28有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:42有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:56有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(b1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:64的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:74的LCDR3；

(b3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:65的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:75的LCDR3；

(b6)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b7)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:50的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b8)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b9)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:66的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:71的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的LCDR3；

(b10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:66的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:71的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的LCDR3；

(b12)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:66的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:71的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的LCDR3；

(b13)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b14)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b15)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(c1)包含与SEQ ID NO:2有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构结构域(VL)；

(c2)包含与SEQ ID NO:3有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:59有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c3)包含与SEQ ID NO:4有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c4)包含与SEQ ID NO:5有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c5)包含与SEQ ID NO:5有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:60有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c6)包含与SEQ ID NO:6有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c7)包含与SEQ ID NO:8有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c8)包含与SEQ ID NO:9有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c9)包含与SEQ ID NO:9有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:61有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c10)包含与SEQ ID NO:10有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c11)包含与SEQ ID NO:11有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:61有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c12)包含与SEQ ID NO:12有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:61有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c13)包含与SEQ ID NO:12有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c14)包含与SEQ ID NO:13有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c15)包含与SEQ ID NO:14有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(d1)SEQ ID NO:2的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d2)SEQ ID NO:3的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:59的轻链可变结构域(VL)；

(d3)SEQ ID NO:4的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d4)SEQ ID NO:5的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d5)SEQ ID NO:5的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:60的轻链可变结构域(VL)；

(d6)SEQ ID NO:6的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d7)SEQ ID NO:8的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d8)SEQ ID NO:9的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d9)SEQ ID NO:9的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:61的轻链可变结构域(VL)；

(d10)SEQ ID NO:10的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d11)SEQ ID NO:11的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:61的轻链可变结构域(VL)；

(d12)SEQ ID NO:12的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:61的轻链可变结构域(VL)；

(d13)SEQ ID NO:12的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d14)SEQ ID NO:13的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d15)SEQ ID NO:14的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(e)与(a1)至(d15)的抗体可变区中的任何一个竞争与CD3结合的抗体可变区；

(f)与(a1)至(d15)的抗体可变区中的任何一个竞争与CD137结合的抗体可变区；

(g)与(a1)至(d15)的抗体可变区中的任何一个结合到CD3上相同表位的抗体可变区；

(g)与(a1)至(d15)的抗体可变区中的任何一个结合到CD137上相同表位的抗体可变区；

[4A][4][c1]-[c15]的抗原结合分子，其中所述重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)包含一个或更多个选自表1.3(a)至表1.3(d)的氨基酸取代，其中一个或更多个氨基酸取代显示如表1.3(a)至表1.3(d)中所示相对于CD3和/或CD137至少0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5或2倍的结合亲和力增加。

[4B][4A]的抗原结合分子，其中所述抗体可变区包含：

(a)重链可变结构域氨基酸序列，其在以下每个位置(均通过Kabat编号)包含针对该位置指示的一个或更多个以下氨基酸残基：

在氨基酸位置26的A、D、E、I、G、K、L、M、N、R、T、W或Y；

在氨基酸位置27的D、F、G、I、M或L；

在氨基酸位置28的D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置29的F或W；

在氨基酸位置30的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置31的F、I、N、R、S、T或V；

在氨基酸位置32的A、H、I、K、L、N、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置33的W；

在氨基酸位置34的F、I、L、M或V；

在氨基酸位置35的F、H、S、T、V或Y；

在氨基酸位置50的E、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、W或Y；

在氨基酸位置51的I、K或V；

在氨基酸位置52的K、M、R或T；

在氨基酸位置52b的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；

在氨基酸位置52c的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置53的A、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置54的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置55的E、F、G、H、L、M、N、Q、W或Y；

在氨基酸位置56的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置57的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置58的A、F、H、K、N、P、R或Y；

在氨基酸位置59的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置60的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置61的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置62的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置63的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置64的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置65的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置93的H或R；

在氨基酸位置94的F、G、H、L、M、S、T、V或Y；

在氨基酸位置95的I或V；

在氨基酸位置96的F、H、I、K、L、M、T、V、W或Y；

在氨基酸位置97的F、Y或W；

在氨基酸位置98的A、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置99的A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100a的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100b的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100c的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100d的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100e的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100f的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100g的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100h的A、D、E、G、H、I、L、M、N、P、S、T或V；

在氨基酸位置100i的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置101的A、D、F、I、L、M、N、Q、S、T或V；

在氨基酸位置102的A、D、E、F、G、H、IK、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

和/或

(b)轻链可变结构域氨基酸序列，其在以下每个位置(均通过Kabat编号)包含针对该位置指示的一个或更多个以下氨基酸残基：

在氨基酸位置24的A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置25的A、G、N、P、S、T或V；

在氨基酸位置26的A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置27的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27a的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27b的A、I、L、M、P、T或V；

在氨基酸位置27c的A、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；

在氨基酸位置27d的A、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27e的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置28的G、N、S或T；

在氨基酸位置29的A、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、W或Y；

在氨基酸位置30的A、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W或Y；

在氨基酸位置31的I、L、Q、S、T或V；

在氨基酸位置32的F、W或Y；

在氨基酸位置33的A、F、H、L、M、Q或V；

在氨基酸位置34的A、H或S；

在氨基酸位置50的I、K、L、M或R；

在氨基酸位置51的A、E、I、K、L、M、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置52的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置53的A、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；

在氨基酸位置54的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置55的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；

在氨基酸位置56的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置89的A、G、K、S或Y；

在氨基酸位置90的Q；

在氨基酸位置91的G；

在氨基酸位置92的A、D、H、K、N、Q、R、S或T；

在氨基酸位置93的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置94的A、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置95的P；

在氨基酸位置96的F或Y；

在氨基酸位置97的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或V。

[5][1]至[4B]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有选自由以下(1)至(3)组成的组的至少一种特征：

(1)抗原结合分子不同时与各自在不同细胞上表达的CD3和CD137结合。

(2)抗原结合分子对CD137具有激动活性；和

(3)与包含SEQ ID NO:1的VH序列和SEQ ID NO:57的VL序列的参照抗体相比，抗原结合分子具有相等或降低10倍、20倍、50倍、100倍的结合人CD137的KD值，其中KD值优选在以下条件下通过SPR测量：37℃，pH 7.4，20mM ACES，150mM NaCl，0.05％吐温20、0.005％NaN3；抗原结合分子固定在CM4传感器芯片上，抗原用作分析物。

[6][1]至[5]中任一项的抗原结合分子，其进一步包含能够结合不同于CD3和CD137的第三抗原的抗体可变区。

[7][6]的抗原结合分子，其中所述第三抗原是在癌组织中特异性表达的分子。

[7A][6]至[7]中任一项的抗原结合分子，其中所述第三抗原是Glypican-3(GPC3)。

[7B][7A]的抗原结合分子，其中能够结合Glypican-3(GPC3)的抗体可变区包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:206的VH序列和具有氨基酸序列SEQ ID NO:207的VL序列。

[7C][6]至[7B]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有选自由以下(1)至(5)组成的组的至少一种特征：

(1)所述抗原结合分子诱导T细胞针对表达所述第三抗原分子的细胞的CD3活化，但不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的CD3活化；

(2)所述抗原结合分子诱导T细胞针对表达所述第三抗原分子的细胞的细胞毒性，但不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的细胞毒性；

(3)在不存在表达所述第三抗原分子的细胞的情况下，所述抗原结合分子不诱导来自PBMC的细胞因子释放；

(4)与包含SEQ ID NO:1的VH序列和SEQ ID NO:57的VL序列的参照抗体相比，所述抗原结合分子诱导相等或2倍、5倍、10倍、20倍或100倍更高的T细胞针对表达所述第三抗原分子的细胞的CD137活化和/或细胞毒性；和/或

(5)与靶向所述第三抗原和CD3的参照双特异性抗体相比，所述抗原结合分子诱导2倍、5倍、10倍、20倍或100倍更高的T细胞针对表达所述第三抗原分子的细胞的细胞毒性，而不诱导细胞因子(IL-6)从PBMC释放。

[8][1]至[7C]中任一项的抗原结合分子，其进一步包含抗体Fc区。

[9][8]的抗原结合分子，其中与天然存在的人IgG1抗体的Fc区相比，所述Fc区是具有降低的针对FcγR的结合活性的Fc区。

[10]药物组合物，其包含根据[1]至[9]中任一项的抗原结合分子和药学上可接受的载体。

[10A][10]的药物组合物或[1]至[9]的抗原结合分子，用于治疗癌症。

[10B][10]的药物组合物或[1]至[9]的抗原结合分子在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

[10C]预防、治疗或抑制癌症的方法，其包括：向患有癌症的哺乳动物受试者施用[10]的药物组合物或[5]至[9]的抗原结合分子。

[10D]在受试者中诱导细胞毒性，优选T细胞依赖性细胞毒性的方法，其包括：对患有癌症的哺乳动物受试者施用[10]的药物组合物或[5]至[9]的抗原结合分子。

[10E]减少或杀死受试者的癌细胞的方法，其包括：向患有癌症的哺乳动物受试者施用[10]的药物组合物或[5]至[9]的抗原结合分子。

[10F]延长癌症患者的寿命或存活率的方法，其包括：向患有癌症的哺乳动物受试者施用[10]的药物组合物或[5]至[9]的抗原结合分子。

[10G]根据[10A]至[10F]中任一项使用的药物组合物或抗原结合分子、用途或方法，其中所述癌症的特征在于所述第三抗原，优选Glypican-3(GPC3)的表达或上调的表达。

[11]分离的多核苷酸，其包含编码[1]至[9]中任一项的抗原结合分子的核苷酸序列。

[12]表达载体，其包含根据[11]的多核苷酸。

[13]用根据[11]的多核苷酸或根据[12]的表达载体转化或转染的宿主细胞。

[14]制备多特异性抗原结合分子或多特异性抗体的方法，其包括培养[13]的宿主细胞。

[15]通过[14]的方法制备的多特异性抗原结合分子或多特异性抗体。

[16]获得或筛选能够结合CD3和CD137但不同时结合CD3和CD137的抗体可变区的方法，其包括：

(a)提供包含多个抗体可变区的文库，

(b)使步骤(a)中提供的文库与作为第一抗原的CD3或CD137接触，并收集与所述第一抗原结合的抗体可变区，

(c)使步骤(b)中收集的抗体可变区与CD3和CD137中的第二抗原接触，并收集与所述第二抗原结合的抗体可变区，和

(d)选择抗体可变区，其中：

(1)以小于约5x10

(2)以介于2x10

[16A][16]的方法，其中从步骤(c)至(d)，进一步包括将一个或更多个氨基酸改变引入步骤(c)中收集的所述抗体可变区。

[17][16]至[16A]的方法，其中步骤(a)或步骤(c)至(d)中的所述抗体可变区是具有1至25个氨基酸改变的抗体可变区，其中待改变的氨基酸是环中的氨基酸，FR3区中的氨基酸或选自抗体H链可变结构域中Kabat编号位置31至35、50至65、71至74和95至102以及L链可变结构域中Kabat编号位置24至34、50至56和89至97的氨基酸。

[18][17]的方法，其中所述重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)包含一个或更多个选自表1.3(a)至表1.3(d)的氨基酸取代，其中一个或更多个氨基酸取代显示如表1.3(a)至表1.3(d)中所示相对于CD3和/或CD137至少0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5或2倍的结合亲和力增加。在一些实施方案中，所述抗体可变区优选包含：

(a)重链可变结构域氨基酸序列，其在以下每个位置(均通过Kabat编号)包含针对该位置指示的一个或更多个以下氨基酸残基：

在氨基酸位置26的A、D、E、I、G、K、L、M、N、R、T、W或Y；

在氨基酸位置27的D、F、G、I、M或L；

在氨基酸位置28的D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置29的F或W；

在氨基酸位置30的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置31的F、I、N、R、S、T或V；

在氨基酸位置32的A、H、I、K、L、N、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置33的W；

在氨基酸位置34的F、I、L、M或V；

在氨基酸位置35的F、H、S、T、V或Y；

在氨基酸位置50的E、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、W或Y；

在氨基酸位置51的I、K或V；

在氨基酸位置52的K、M、R或T；

在氨基酸位置52b的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；

在氨基酸位置52c的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置53的A、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置54的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置55的E、F、G、H、L、M、N、Q、W或Y；

在氨基酸位置56的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置57的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置58的A、F、H、K、N、P、R或Y；

在氨基酸位置59的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置60的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置61的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置62的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置63的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置64的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置65的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置93的H或R；

在氨基酸位置94的F、G、H、L、M、S、T、V或Y；

在氨基酸位置95的I或V；

在氨基酸位置96的F、H、I、K、L、M、T、V、W或Y；

在氨基酸位置97的F、Y或W；

在氨基酸位置98的A、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置99的A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100a的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100b的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100c的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100d的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100e的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100f的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100g的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100h的A、D、E、G、H、I、L、M、N、P、S、T或V；

在氨基酸位置100i的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置101的A、D、F、I、L、M、N、Q、S、T或V；

在氨基酸位置102的A、D、E、F、G、H、IK、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

和/或

(b)轻链可变结构域氨基酸序列，其在以下每个位置(均通过Kabat编号)包含针对该位置指示的一个或更多个以下氨基酸残基：

在氨基酸位置24的A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置25的A、G、N、P、S、T或V；

在氨基酸位置26的A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置27的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27a的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27b的A、I、L、M、P、T或V；

在氨基酸位置27c的A、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；

在氨基酸位置27d的A、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27e的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置28的G、N、S或T；

在氨基酸位置29的A、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、W或Y；

在氨基酸位置30的A、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W或Y；

在氨基酸位置31的I、L、Q、S、T或V；

在氨基酸位置32的F、W或Y；

在氨基酸位置33的A、F、H、L、M、Q或V；

在氨基酸位置34的A、H或S；

在氨基酸位置50的I、K、L、M或R；

在氨基酸位置51的A、E、I、K、L、M、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置52的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置53的A、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；

在氨基酸位置54的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置55的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；

在氨基酸位置56的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置89的A、G、K、S或Y；

在氨基酸位置90的Q；

在氨基酸位置91的G；

在氨基酸位置92的A、D、H、K、N、Q、R、S或T；

在氨基酸位置93的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置94的A、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置95的P；

在氨基酸位置96的F或Y；

在氨基酸位置97的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或V。

另一方面，本发明涉及抗原结合分子，例如抗体，其与CD137的N端区域的至少一个、两个、三个或更多个氨基酸残基结合，所述与CD137的N端区域包含人CD137的LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC(SEQ ID NO:152)，优选LQDPCSN，NNRNQI和/或GQRTCDI的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子可以通过其对CD3的激动活性来活化T细胞，并且可以诱导T细胞对靶细胞的细胞毒性，并通过其对CD137和CD3的共同刺激性激动活性增强T细胞的活化、存活以及向记忆T细胞的分化。同时，本发明的抗原结合分子可以避免由CD137和CD3的交联引起的不良事件，因为它不同时结合CD3和CD137。

在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子还可以通过对CD137的激动活性来活化表达CD137的免疫细胞并增强对靶细胞的免疫应答。

附图说明

亲和力成熟的GPC3/双-Ig变体三特异性抗体的CD3激动活性的测量。根据所选择的抗体被分成板1(上图)和板2(下图)，以E：T比为5，将SK-pba60细胞系与NFAT-luc2Jurkat报告细胞共培养24小时后检测到的平均发光单位+/-标准差(s.d.)。以0.02、0.2和2nM加入抗体。

亲和力成熟的GPC3/双-Ig变体三特异性抗体的CD137激动活性的测量。根据所选择的抗体被分成板1(上图)和板2(下图)，以E：T比为5，将SK-pba60细胞系与过表达CD137的Jurkat NF kappa B报告细胞共培养5小时后检测到的平均发光单位+/-标准差(s.d.)。以0.5、2.5和5nM加入抗体。

[图1.3a]在所选择的GPC3/双-Ig三特异性分子(板1)存在的情况下，对与PBMC共培养的表达GPC3的SK-pca60细胞系的细胞毒性。绘制在大约120小时获得的平均细胞生长抑制(％)值+/-s.d.。

[图1.3b]在所选择的GPC3/双-Ig三特异性分子(板2)存在的情况下，对与PBMC共培养的表达GPC3的SK-pca60细胞系的细胞毒性。绘制在大约120小时获得的平均细胞生长抑制(％)值+/-s.d.。

[图1.3c]在所选择的GPC3/双-Ig三特异性分子存在的情况下，在表达GPC3的SK-pcca60细胞系与pbmc的共培养物中测量的细胞因子(IFNγ)释放。在48h时间点分析共培养物的上清液。该图显示IFNγ的平均浓度+/-s.d.。将抗体分成用于评价的板1(上图)和板2(下图)。

[图1.3d]在所选择的GPC3/双-Ig三特异性分子存在的情况下，在表达GPC3的SK-pcca60细胞系与PBMC的共培养物中测量的细胞因子(IL-2)释放。在48h时间点分析共培养物的上清液。该图显示IL-2的平均浓度+/-s.d.。将抗体分成用于评价的板1(上图)和板2(下图)。

[图1.3e]在所选择的GPC3/双-Ig三特异性分子存在的情况下，在表达GPC3的SK-pcca60细胞系与PBMC的共培养物中测量的细胞因子(IL-6)释放。在48h时间点分析共培养物的上清液。该图显示IL-6的平均浓度+/-s.d.。将抗体分成用于评价的板1(上图)和板2(下图)。

[图2.1]三特异性抗体(mAbAB)的设计和构建

[图2.2]制备的三特异性抗体的命名规则

[图2.3a]对GPC3阴性细胞的抗原独立的Jurkat活化。将亲本CHO细胞与NFAT-luc2Jurkat报告细胞以E:T为5共培养24h。描绘在0.5、5和50nM下温育的不同抗体形式的平均发光单位+/-标准差(s.d.)的图。

[图2.3b]对GPC3阴性细胞的抗原独立的Jurkat活化。将过表达CD137的CHO细胞与NFAT-luc2 Jurkat报告细胞以E:T为5共培养24h。描绘在0.5、5和50nM下温育的不同抗体形式的平均发光单位+/-标准差(s.d.)的图。

[图2.4a]PBMC溶液中的抗原独立的细胞因子(IFNγ)释放。在48h时间点分析以3.2、16和80nM加入到PBMC溶液中的亲和力成熟的GPC3/双-Ig变体或GPC3/CD137xCD3三特异性抗体的上清液。图显示IFNγ的平均浓度+/-s.d.。将抗体分成用于评价的板1(上图)和板2(下图)。

[图2.4b]PBMC溶液中的抗原独立的细胞因子(TNFα)释放。在48h时间点分析以3.2、16和80nM加入到PBMC溶液中的亲和力成熟的GPC3/双-Ig变体或GPC3/CD137xCD3三特异性抗体的上清液。该图显示TNFα的平均浓度+/-s.d.。将抗体分成用于评价的板1(上图)和板2(下图)。

[图2.4c]PBMC溶液中的抗原独立的细胞因子(IL-6)释放。在48h时间点分析以3.2、16和80nM加入到PBMC溶液中的亲和力成熟的GPC3/双-Ig变体或GPC3/CD137xCD3三特异性抗体的上清液。该图显示IL-6的平均浓度+/-s.d.。将抗体分成用于评价的板1(上图)和板2(下图)。

[图3.1a]人源化CD3/CD137小鼠模型中的针对LLC1/hGPC3异种移植物的抗体的体内抗体功效。Y轴表示肿瘤体积(mm

[图3.1b]人源化CD3/CD137小鼠模型中针对LLC1/hGPC3异种移植物的抗体的体内功效。Y轴表示肿瘤体积(mm

[图3.1c]血浆IL-6浓度。抗体注射2小时后将小鼠被取血,并使用Bio-PlexPro小鼠细胞因子Th1 Panel测量血浆IL-6浓度。

[图3.2]huNOG小鼠模型中的针对sk-pca-13a异种移植物的抗体的体内抗体功效。Y轴表示肿瘤体积(mm

[图3.3a]CD137上的H0868L0581Fab接触区的表位。CD137氨基酸序列中的表位作图(黑色：距H0868L0581小于3.0埃，条纹：距H0868L0581小于4.5埃)。

[图3.3b]CD137上的H0868L0581Fab接触区的表位。晶体结构中的表位作图(暗灰色球：距H0868L0581小于3.0埃，浅灰棒：距H0868L0581小于4.5埃)。

[图4]显示通过二硫键接头而生物素标记的C3NP1-27、CD3ε肽抗原的设计的图。

[图5]显示通过噬菌体展示至CD3和CD137而获得的克隆的噬菌体ELISA结果的图。Y轴表示对CD137-Fc的特异性，X轴表示对每个克隆的CD3的特异性。

[图6]显示通过噬菌体展示至CD3和CD137而获得的克隆的噬菌体ELISA结果的图。Y轴表示在珠粒ELISA中对CD137-Fc的特异性，X轴表示在板ELISA中与每个克隆的图5相同的对CD3的特异性。

[图7]显示人CD137氨基酸序列与食蟹猴CD137氨基酸序列的比较数据的图。

[图8]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的ELISA结果的图。Y轴表示对cyno CD137-Fc的特异性，X轴表示每个克隆的对人CD137的特异性。

[图9]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的ELISA结果的图。Y轴表示对CD3e的特异性。

[图10]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的竞争ELISA结果的图。Y轴表示ELISA对生物素-人CD137-Fc或生物素-人Fc的响应。过量的人CD3或人Fc用作竞争剂。

[图11A]显示针对CD3和CD137的噬菌体展示

[图11B]显示针对CD3和CD137的噬菌体展示

[图11C]显示针对CD3和CD137的噬菌体展示

[图12.1]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的ELISA结果的一组图。Y轴表示对人CD137-Fc的特异性，X轴表示每个克隆的对cyno CD137或CD3的特异性。

[图12.2]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的ELISA结果的一组图。Y轴表示对人CD137-Fc的特异性，X轴表示每个克隆对cyno CD137或CD3的特异性。

[图12.3]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的ELISA结果的一组图。Y轴表示对人CD137-Fc的特异性，X轴表示每个克隆对cyno CD137或CD3的特异性。

[图13]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的ELISA结果的一组图。Y轴表示对人CD137-Fc的特异性，X轴表示每个克隆对cyno CD137或CD3的特异性。

[图14]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的竞争ELISA结果的图。Y轴表示ELISA对生物素-人CD137-Fc或生物素-人Fc的响应。过量的人CD3用作竞争剂。

[图15]显示用噬菌体展示至CD3和CD137以鉴定每个克隆的表位结构域而获得的IgG的ELISA结果的图。Y轴表示ELISA对人CD137的每个结构域的响应。

[图16]显示用噬菌体展示亲和成熟至CD3和CD137而获得的IgG的ELISA结果的一组图。Y轴表示对人CD137-Fc的特异性，X轴表示每个克隆对cyno CD137或CD3的特异性。

[图17.1]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的竞争ELISA结果的一组图。Y轴表示ELISA对生物素-人CD137-Fc或生物素-人Fc的响应。过量的人CD3用作竞争剂。

[图17.2]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的竞争ELISA结果的一组图。Y轴表示ELISA对生物素-人CD137-Fc或生物素-人Fc的响应。过量的人CD3用作竞争剂。

[图17.3]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的竞争ELISA结果的一组图。Y轴表示ELISA对生物素-人CD137-Fc或生物素-人Fc的响应。过量的人CD3用作竞争剂。

[图17.4]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的竞争ELISA结果的一组图。Y轴表示ELISA对生物素-人CD137-Fc或生物素-人Fc的响应。过量的人CD3用作竞争剂。

[图17.5]显示用噬菌体展示至CD3和CD137而获得的IgG的竞争ELISA结果的一组图。Y轴表示ELISA对生物素-人CD137-Fc或生物素-人Fc的响应。过量的人CD3用作竞争剂。

[图18A]示意性显示通过抗人GPC3/双Fab抗体从活化的B细胞分泌IL-6的机制的图。

[图18B]显示通过由活化的B细胞分泌的IL-6的生产水平来评估各种抗人GPC3/双Fab抗体的CD137介导的激动剂活性的结果的图。ctrl表示阴性对照人IgG1抗体。

[图19A]示意性地显示通过抗人GPC3/双-Fab抗体在活化的Jurkat T细胞中萤光素酶表达的机制的图。

[图19B]显示通过由活化的Jurkat T细胞表达的萤火素酶的生产水平来评估各种抗人GPC3/双Fab抗体的CD3介导的激动剂活性的结果的一组图。ctrl表示阴性对照人IgG1抗体。

[图20]显示在每个固定化抗体存在的情况下评估来自人PBMC来源T细胞的细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)释放的结果的一组图。Y轴表示分泌的各细胞因子的浓度，X轴表示固定化抗体的浓度。对照抗CD137抗体(B)，对照抗CD3抗体(CE115)，阴性对照抗体(Ctrl)和双抗体之一(H183L072)用于测定。

[图21]显示用每种双特异性抗体评估针对GPC3阳性靶细胞(SK-pca60和SK-pcca13a)的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)的结果的一组图。Y轴表示细胞生长抑制(CGI)的比例，X轴表示每种双特异性抗体的浓度。抗GPC3/双特异性抗体(GC33/H183L072)、阴性对照/双双特异性抗体(Ctrl/H183L072)、抗GPC3/抗CD137双特异性抗体(GC33/B)和阴性对照/抗CD137双特异性抗体(Ctrl/B)用于该测定。在肿瘤(T)细胞(ET5)上添加5倍量的效应(E)细胞。

[图22]显示针对CD3e的CE115的细胞-ELISA结果的图。

[图23]显示EGFR_ERY22_CE115的分子形式的图。

[图24]显示EGFR_ERY22_CE115的TDCC(SK-pca13a)的结果的图。

[图25]具有小于0.8的结合量比例的抗体的示例性传感图。

[图26]图26是显示GPC3/CD137xCD3三特异性抗体和抗GPC3/双Fab抗体的同时结合的Biacore分析结果的一组图。Y轴表示对每个抗原的结合响应。首先将人CD3(hCD3)用作分析物，然后还将hCD3(显示为虚线)或人CD137(hCD137)和hCD3的混合物(显示为实线)用作分析物。

[图27]图27是显示每种抗体对CD137阳性CHO细胞或Jurkat细胞的FACS分析结果的一组传感图。图27(a)和(c)是结合人CD137阳性CHO细胞的结果，图27(b)和(d)是结合亲本CHO细胞的结果。在图27(a)和(b)中，实线显示抗GPC3/双抗体(GC33/H183L072，即GPC33/H183L072)的结果，并且填充的显示对照抗体(Ctrl)的结果。在图27(c)和(d)中，实线、深灰色填充和浅灰色填充分别显示GPC3/CD137xCtrl三特异性抗体、GPC3/CD137xCD3三特异性抗体和Ctrl/CtrlxCD3三特异性抗体的结果。图27(e)和(f)是结合Jurkat CD3阳性细胞的结果。在图27(e)中，实线和填充的分别显示抗GPC3/双抗体(GC33/H183L072，即GPC33/H1831L072)和对照抗体(Ctrl)的结果。在图27(f)中，实线、深灰色填充和浅灰色填充分别显示GPC3/CtrlxCD3三特异性抗体、GPC3/CD137xCD3三特异性抗体和Ctrl/CD137xCtrl三特异性抗体的结果。

[图28]图28给出了显示通过在活化的Jurkat T细胞中表达的萤光素酶的生产水平评估各种抗体对GPC3阳性靶细胞SK-pca60的CD3介导的激动剂活性的结果的图。将六种三特异性抗体、抗GPC3/双Fab抗体(GPC3/H183L072)和对照/双Fab抗体(Ctrl/H183L072)用于该测定。X轴表示每种抗体所用的浓度。

[图29]图29给出了显示通过在活化的Jurkat T细胞中表达的萤光素酶的生产水平评估各种抗体对人CD137阳性CHO细胞和亲本CHO细胞的CD3介导的激动剂活性的结果的图。将六种三特异性抗体，抗GPC3/双Fab抗体(GPC3/H183L072)和对照/双Fab抗体(Ctrl/H183L072)用于该测定。X轴表示每种抗体所用的浓度。

[图30]图30是显示在每个可溶性抗体的存在下评估来自人PBMC的细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)释放的结果的一组图。Y轴表示分泌的各细胞因子的浓度，X轴表示所用抗体的浓度。Ctrl/CD137xCD3三特异性抗体和对照/双Fab抗体(Ctrl/H183L072)用于该测定。

具体实施方式

在本发明中,“抗体可变区”通常是指由4个框架区(FR)和侧翼的3个互补决定区(CDR)构成的区域，也包括其部分序列，只要该部分序列具有与抗原的一部分或全部结合的活性。特别地，优选含有抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)的区。本发明的抗体可变区可以具有任意序列，可以是源自以下任意抗体的可变区，例如小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体，和通过将这些非人抗体进行人源化而获得的人源化抗体、以及人抗体。“人源化抗体”也被称为改型(reshaped)人抗体，通过将来源于非人类哺乳动物的抗体，例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的CDR而获得。用于鉴定CDR的方法是本领域公知的(Kabat等人,Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987),National Institute of Health,Bethesda,Md.；和Chothia等人,Nature(1989)342:877)。此外，通常的基因重组方法在本领域中也是公知的(参照欧州专利申请公开号EP125023和WO96/02576)。

本发明的“不同时结合CD3和CD137(4-1BB)的抗体可变区”是指，本发明的抗体可变区在与CD3结合的状态下无法与CD137结合，而该可变区在与CD137结合的状态下无法与CD3结合。在本文中，短语“不同时结合CD3和CD137”也包括表达CD3的细胞和表达CD137的细胞不交联、或者不同时结合各自表达在不同细胞的CD3和CD137。该短语进一步包括下述的情形：当CD3和CD137如可溶型蛋白那样不表达在细胞膜上、或者二者均存在于同一细胞上时，可变区能够同时结合CD3和CD137，但不同时结合各自表达在不同细胞上的CD3和CD137。这样的抗体可变区没有特别限定，只要抗体可变区具有这些功能即可。其实例可包括：通过将IgG型抗体可变区的一部分氨基酸改变从而与所期望的抗原结合而源自所述IgG型抗体可变区的可变区。待改变的氨基酸选自，例如可在与CD3或CD137结合的抗体可变区中，其改变不消除与抗原的结合的氨基酸。

在本文中，短语“表达在不同细胞上”仅是指抗原表达在分离的细胞上。这样的细胞组合可以是，例如，诸如T细胞与其它T细胞这样的同一类型的细胞，或者可以是T细胞与NK细胞这样的不同类型的细胞。

在本发明中,可以单独使用一个氨基酸改变，也可以组合使用多个氨基酸改变。

在组合使用多个氨基酸改变的情况下，对要组合的改变数目没有特别限定，可在能够实现发明目的的范围内适当设定。例如，要组合的改变的数目为2个以上且30个以下、优选为2个以上且25个以下、2个以上且22个以下、2个以上且20个以下、2个以上且15个以下、2个以上且10个以下、2个以上且5个以下、或2个以上且3个以下。

要组合的多个氨基酸改变可以只加入到抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域，或者也可以适当分布到重链可变结构域和轻链可变结构域二者。

只要抗原结合活性得以维持，则可以将可变区中的一个或更多个氨基酸残基接受为待改变的氨基酸残基。在改变可变区中的氨基酸的情况下，所得到的可变区优选维持相应的未改变抗体的结合活性，并优选具有例如改变前结合活性的50％以上、更优选80％以上、进一步优选100％以上,尽管根据本发明的可变区不限于此。通过氨基酸改变，结合活性可以提高，可以为例如改变前结合活性的2倍、5倍或10倍。

优选用于氨基酸改变的区域的实例包括可变区中的溶剂暴露区和环。其中，优选CDR1、CDR2、CDR3、FR3和环。具体而言，优选H链可变结构域中的Kabat编号位置31至35、50至65、71至74和95至102，以及L链可变结构域中的Kabat编号位置24至34、50至56和89至97。更优选H链可变结构域中的Kabat编号位置31、52a至61、71至74和97至101，L链可变结构域中的Kabat编号位置24至34、51至56和89至96。此外，在氨基酸改变时，可以进一步引入提高抗原结合活性的氨基酸。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的抗体可变结构域的每个区域。通常，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1，H2，H3)和VL中的三个(L1，L2，L3)。本文中的示例性HVR包括：

(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；

(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；

(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262ddd 732-745(1996))；和

(d)(a)，(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)和94-102(H3)。

除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。

在本发明中，“环”是指包含不参与免疫球蛋白的β桶结构维持的残基的区域。

在本发明中，氨基酸改变是指取代、缺失、添加、插入、或修饰、或者它们的组合。在本发明中，氨基酸改变可与氨基酸突变互换使用，并以相同的含义来使用。

氨基酸残基的取代通过利用另一个氨基酸残基置换来进行，其目的在于改变下述的(a)至(c)中的任一项：(a)具有折叠结构或螺旋结构的区域中的多肽主链结构；(b)靶位点的电荷或疏水性；或(c)侧链的大小。

氨基酸残基根据通常的侧链特性可分类为以下的组：(1)疏水性残基：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu和Ile；(2)中性亲水性残基：Cys、Ser、Thr、Asn和Gln；(3)酸性残基：Asp和Glu；(4)碱性残基：His、Lys和Arg；(5)影响链取向的残基：Gly和Pro；以及(6)芳族残基：Trp、Tyr和Phe。

这些组内任一个的氨基酸残基取代称为保守取代，而这些组之一中的氨基酸残基被另一组中的氨基酸残基取代称为非保守取代。

根据本发明的取代可以是保守取代，也可以是非保守取代。或者，保守取代和非保守取代可以组合。

氨基酸残基的改变还包括：在与CD3或CD137结合的抗体可变区中，从通过氨基酸随机改变；和将事先已知对于所期望的抗原具有结合活性的肽插入上述区域的改变而获得的且其改变不消除与该抗原的结合的可变区中，选择能够结合CD3和CD137但无法同时结合的可变区。

在本发明的抗体可变区中，上述改变可以与本领域中已知的改变结合。例如，可变区的N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰基化修饰成为焦谷氨酸是本领域技术人员熟知的修饰。因此，在其重链的N末端具有谷氨酰胺的本发明的抗体可包含N末端的谷氨酰胺被修饰成焦谷氨酸的可变区。

这种抗体可变区可进一步具有氨基酸改变以改善，例如抗原结合、药代动力学、稳定性、抗原性。本发明的抗体可变区可以被改变以对抗原具有pH依赖性的结合活性，从而能够重复结合抗原(WO2009/125825)。

此外，可以将根据靶组织特异性化合物的浓度改变抗原结合活性的氨基酸改变添加至，例如，与第三抗原结合的这种抗体可变区(WO2013/180200)。

可变区可进一步出于以下目的而改变：例如，提高结合活性、改善特异性、降低pI、赋予pH依赖性抗原结合特性、改善结合的热稳定性、改善溶解性、改善对化学修饰的稳定性、改善来源于糖链的异质性、避免通过计算机模拟预测(in silico prediction)或基于体外T细胞的测定法鉴定的T细胞表位以降低免疫原性、或者引入用于活化调节T细胞的T细胞表位等(mAbs 3:243-247,2011)。

可以使用本领域中已知的方法来确定本发明的抗体可变区是否“能结合CD3和CD137”。

例如，这可以通过电化学发光法(ECL法)来确定(BMC Research Notes2011,4:281)。

具体而言，例如，由能够结合CD3和CD137的区组成的低分子抗体，例如，经生物素标记的待测抗原结合分子的Fab区，或者其单价抗体(缺少通常抗体所具有的两个Fab区之一的抗体)与用磺基标签(Ru络合物)标记的CD3或CD137混合，将混合物添加到链霉亲和素固定的板上。在该操作中，经生物素标记的待测抗原结合分子与板上的链霉亲和素结合。从Sulfo-tag发光，利用Sector Imager 600或2400(MSD K.K.)等检测发光信号，从而确认待测抗原结合分子的上述区域与CD3或CD137的结合。

或者，可以通过ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting，荧光激活细胞分选术)、ALPHAScreen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay，增强的发光接近均质测定筛选)或基于表面等离振子共振(SPR)现象的BIACORE法等来进行该测定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。

具体而言，例如，可以使用基于表面等离振子共振(SPR)现象的相互作用分析仪Biacore(GE Healthcare)来进行该测定。Biacore分析仪包括任意型号，如Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、或C。可将Biacore的任意传感器芯片，例如，CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA或Au芯片用作传感器芯片。通过偶联方法如胺偶联、二硫化物偶联(disulfide coupling)、醛偶联将捕获本发明的抗原结合分子的蛋白(例如蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗人IgG抗体、抗人IgG-Fab、抗人L链抗体、抗人Fc抗体、抗原蛋白或抗原肽)固定在传感器芯片上。将CD3或CD137作为分析物注射在芯片上，测定相互作用以获取传感图。在该操作中，CD3或CD137的浓度可以根据测定样品的相互作用强度(例如KD等)在数μM至数pM的范围内选择。

或者，可以将CD3或CD137而并非抗原结合分子固定在传感器芯片上，使要评价的抗体样品与CD3或CD137相互作用。根据由相互作用的传感图算出的解离常数(KD)值、或根据抗原结合分子样品作用后相对于作用前水平的传感图的增加程度，可以确认本发明的抗原结合分子的抗体可变区是否具有对CD3或CD137的结合活性。

在一些实施方案中，使用例如Biacore T200仪器(GE Healthcare)或Biacore 8K仪器(GE Healthcare)在37℃(对于CD137)或25℃(对于CD3)下评估本发明的抗体可变区与目的抗原(即CD3或CD137)的结合活性或亲和力。使用胺偶联试剂盒(例如GE Healthcare)，将抗人Fc(例如GE Healthcare)固定在CM4传感器芯片的所有流通池上。将抗原结合分子或抗体可变区捕获到抗Fc传感器表面上，然后将抗原(CD3或CD137)注射到流通池上。抗原结合分子或抗体可变区的捕获水平的目标可以为200个共振单位(RU)。重组人CD3或CD137可以以通过两倍连续稀释制备的400到25nM注射，然后进行解离。在包含20mM ACES，150mMNaCl，0.05％吐温20、0.005％NaN3的ACES pH 7.4中制备所有抗原结合分子或抗体可变区和分析物。每个周期用3M MgCl2再生传感器表面。通过使用例如Biacore T200评估软件2.0版(GE Healthcare)或Biacore 8K评估软件(GE Healthcare)处理数据并将其拟合到1：1结合模型来确定结合亲和力。计算KD值以评估本发明的抗原结合结构域的特异性结合活性或亲和力。

ALPHAScreen是通过使用两种珠粒(供体和受体)的ALPHA技术，基于下述原理来实施的：通过结合于供体珠粒的分子和结合于受体珠粒的分子之间生物学相互作用，仅在这两种珠粒靠近时检测到发光信号。供体珠粒内的由激光激发的光敏剂将周围的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散至供体珠粒周围，到达靠近的受体珠粒，从而引起珠粒内的化学发光反应，最终发出光。结合于供体珠粒的分子和结合于受体珠粒的分子之间不发生相互作用时，供体珠粒产生的单线态氧不会到达受体珠粒。因此，不会发生化学发光反应。

将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上。从传感器芯片的背面用光照射传感器芯片，使得在金薄膜和玻璃之间的界面发生全反射。结果，在一部分反射光中形成了反射强度(SPR信号)下降的部位。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)注射到传感器芯片的表面。分析物与配体结合时，固定化配体分子的质量会增加，从而改变传感器芯片表面的溶剂的折射率。折射率的这种变化使SPR信号的位置发生移位(相反，结合分子的解离会使信号返回到原始位置)。Biacore系统在纵坐标上绘制位移量，即传感器芯片表面上的质量变化，并显示依赖时间的质量变化作为测定数据(传感器图)。由传感图可确定与被捕获到传感器芯片表面上的配体结合的分析物的量(在分析物相互作用前后的传感图上的响应的变化量)。但是，由于结合量也取决于配体的量，必须在使用基本上相同的配体量的条件下进行比较。由传感图的曲线可确定动力学，即缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，而由这些常数的比例可确定亲和力(KD)。BIACORE法中还优选使用抑制测定法。抑制测定法的实例描述在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010中。

本发明的抗原结合分子是否“不同时结合CD3和CD137”可如下进行确认：确认抗原结合分子对CD3和CD137都具有结合活性，然后使CD3或CD137预先结合到包含具有该结合活性的可变区的抗原结合分子上，然后通过上述方法确定其对另一个是否具有结合活性。或者，这也可以通过确定抗原结合分子与固定在ELISA板或传感器芯片上的CD3或CD137的结合是否被加入到溶液中的另一个抑制来确认。在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子与CD3或CD137的结合被抗原结合分子与另一个的结合抑制了至少50％，优选60％以上，更优选70％以上，更优选80％以上，进一步优选90％以上，或甚至更优选95％以上。

在一方面，当一种抗原(例如CD3)被固定时，可以通过现有技术中已知的方法(即ELISA，BIACORE等)在存在另一种抗原(例如CD137)的情况下确定对抗原结合分子与CD3的结合的抑制。在另一方面，当CD137被固定时，也可以在CD3存在下确定对抗原结合分子与CD137的结合的抑制。当进行上述两个方面中的任何一个时，如果结合被抑制至少50％，优选60％以上，优选70％以上，进一步优选80％以上，进一步优选90％以上，甚至更优选95％以上，则确定本发明的抗原结合分子不同时结合CD3和CD137。

在一些实施方案中，作为分析物注射的抗原的浓度比待固定的另一抗原的浓度高至少1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍或100倍。

优选地，作为分析物注射的抗原的浓度比待固定的另一抗原的浓度高100倍，并且结合被抑制至少80％。

在一个实施方案中，计算了抗原结合分子的CD3(分析物)结合活性的KD值与抗原结合分子的CD137(固定化)结合活性的KD之比(KD(CD3)/KD(CD137))，为CD137(固定化)浓度的KD值比(KD(CD3)/KD(CD137)10倍、50倍、100倍或200倍高的CD3(分析物)浓度可用于上面的竞争性测量。(例如，当KD值的比为0.1时，可以选择1倍、5倍、10倍或20倍高的浓度。另外，当Kd值的比为10时，可以选择100倍、500倍、1000倍或2000倍高的浓度。)

在一方面，当一种抗原(例如CD3)被固定时，可以通过现有技术中已知的方法(即ELISA，ECL等)在存在另一种抗原(例如CD137)的情况下确定抗原结合分子与CD3的结合信号的衰减。在另一方面，当CD137被固定时，也可以在CD3存在下确定抗原结合分子与CD137的结合信号的衰减。当进行上述两个方面中的任何一个时，如果结合信号衰减至少50％，优选60％以上，优选70％以上，进一步优选80％以上，进一步优选90％以上，甚至更优选95％以上，则确定本发明的抗原结合分子不同时结合CD3和CD137。

在一些实施方案中，作为分析物注射的抗原的浓度比待固定的另一抗原的浓度高至少1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍或100倍。

优选地，作为分析物注射的抗原的浓度比待固定的另一抗原的浓度高100倍，并且结合被抑制至少80％。

在一个实施方案中，计算了抗原结合分子的CD3(分析物)结合活性的KD值与抗原结合分子的CD137(固定化)结合活性的KD之比(KD(CD3)/KD(CD137))，并且为CD137(固定化)浓度的KD值比(KD(CD3)/KD(CD137)的10倍、50倍、100倍或200倍高的CD3(分析物)浓度可用于上面的测量。(例如，当KD值的比为0.1时，可以选择1倍、5倍、10倍或20倍高的浓度。另外，当Kd值的比为10时，可以选择100倍、500倍、1000倍或2000倍高的浓度。)

具体地，在使用例如ECL方法的情况下，制备了待测的生物素标记的抗原结合分子、用磺基标签(Ru复合物)标记的CD3和未标记的CD137。当待测抗原结合分子能够结合CD3和CD137，但不同时结合CD3和CD137时，通过将待测抗原结合分子和标记的CD3的混合物添加到固定有链霉亲和素的板上，然后进行光显影,在不存在未标记的CD137的情况下检测到了磺基标签的发光信号。相反，在未标记的CD137存在下发光信号降低。发光信号的这种降低可以被量化以确定相对结合活性。可以通过使用标记的CD137和未标记的CD3类似地进行该分析。

在ALPHAScreen的情况下，待测抗原结合分子在不存在竞争CD137的情况下与CD3相互作用，从而产生520至620nm的信号。未标记的CD137与CD3竞争与待测抗原结合分子的相互作用。可以将由于竞争而导致的荧光减少定量，从而确定相对结合活性。使用磺基-NHS-生物素等的多肽生物素化是本领域已知的。可以通过适当采用的方法用GST标记CD3，该方法包括例如将编码CD3的多核苷酸与编码GST的多核苷酸

或者，可以采用使用荧光共振能量转移(FRET)的方法。FRET是一种激发能通过电子共振直接在彼此相邻的两个荧光分子之间转移的现象。当发生FRET时，供体(具有激发态的荧光分子)的激发能被转移到受体(位于供体附近的另一个荧光分子)，从而从供体发出的荧光消失(准确地说，荧光的寿命缩短)，反而从受体发出荧光。通过使用这种现象，可以分析是否同时结合CD3和CD137。例如，当带有荧光供体的CD3和带有荧光受体的CD137同时与待测抗原结合分子结合时，供体的荧光消失，而从受体发出荧光。因此，观察到荧光波长的变化。确认这样的抗体同时结合CD3和CD137。另一方面，如果CD3、CD137和待测抗原结合分子的混合不改变与CD3结合的荧光供体的荧光波长，则该待测抗原结合分子可被认为是能够结合CD3和CD137但不同时结合CD3和CD137的抗原结合结构域。

例如，使待测的生物素标记的抗原结合分子与供体珠粒上的链霉亲和素结合，而使标记有谷胱甘肽S转移酶(GST)的CD3与受体珠粒结合。在不存在竞争性第二抗原的情况下，待测抗原结合分子与CD3相互作用，以产生520至620nm的信号。未标记的第二抗原与CD3竞争与待测抗原结合分子的相互作用。可以将由于竞争而导致的荧光减少定量，从而确定相对结合活性。使用磺基-NHS-生物素等的多肽生物素化是本领域已知的。可以通过适当采用的方法用GST标记CD3，该方法包括例如将编码CD3的多核苷酸与编码GST的多核苷酸框内融合；允许得到的融合基因被含有能够表达其的载体的细胞等表达，然后使用谷胱甘肽柱进行纯化。优选地，使用例如基于非线性回归分析的适于单位点竞争(one-sitecompetition)模型的软件GRAPHPAD PRISM(GraphPad Software，Inc.，San Diego)来分析所获得的信号。

标签不限于GST标签，并且可以利用任何标签来进行，例如但不限于，组氨酸标签、MBP、CBP、Flag标签、HA标签、V5标签、或c-myc标签。待测抗原结合分子与供体珠粒的结合不限于使用生物素-链霉亲和素反应的结合。特别地，当待测抗原结合分子包含Fc时，一种可能的方法涉及允许待测抗原结合分子通过Fc识别蛋白例如蛋白A或蛋白G结合到供体珠粒上。

同样，当CD3和CD137如可溶性蛋白那样不表达在细胞膜上、或者二者均存在于同一细胞上时，可变区能够同时结合CD3和CD137，但不同时结合各自表达在不同细胞上的CD3和CD137，这种情况也可以同时通过本领域已知的方法进行测定。

具体地，在ECL-ELISA中被确认为阳性的、用于检测同时与CD3和CD137的结合的待测抗原结合分子也与表达CD3的细胞和表达CD137的细胞混合。可以表明，除非抗原结合分子和这些细胞彼此同时结合，否则待测抗原结合分子不能同时结合表达在不同细胞上的CD3和CD137。该测定可以通过例如基于细胞的ECL-ELISA进行。将表达CD3的细胞预先固定在板上。在将待测抗原结合分子结合到板上之后，将表达CD137的细胞添加到板上。使用针对该抗原的磺基标签标记的抗体检测仅在表达CD137的细胞上表达的不同抗原。当抗原结合分子同时结合分别表达在两个细胞上的两个抗原时，观察到信号。当抗原结合分子不同时结合这些抗原时，没有观察到信号。

或者，该测定可以通过ALPHAScreen方法进行。将待测抗原结合分子与结合于供体珠粒的表达CD3的细胞和结合于受体珠粒的表达CD137的细胞混合。当抗原结合分子同时结合分别表达在两个细胞上的两个抗原时，观察到信号。当抗原结合分子不同时结合这些抗原时，没有观察到信号。

或者，该测定也可以通过Octet相互作用分析方法进行。首先，使用肽标签标记的表达CD3的细胞被允许与识别该肽标签的生物传感器结合。将表达CD137的细胞和待测抗原结合分子置于孔中，并分析其相互作用。当抗原结合分子同时结合分别表达在两个细胞上的两个抗原时，观察到由待测抗原结合分子和表达CD137的细胞与生物传感器的结合而引起的较大波长偏移。当抗原结合分子不同时结合这些抗原时，观察到仅由待测抗原结合分子与生物传感器的结合而引起的较小波长偏移。

代替这些基于结合活性的方法，可以进行基于生物活性的测定。例如，将表达CD3的细胞和表达CD137的细胞与待测抗原结合分子混合，并进行培养。当抗原结合分子同时结合这两个抗原时，分别表达在两个细胞上的两个抗原通过待测抗原结合分子相互活化。因此，可以检测到活化信号的改变，例如抗原的相应下游磷酸化水平的增加。或者，由于活化而诱导了细胞因子的产生。因此，可以测量产生的细胞因子的量，从而确认是否同时结合两个细胞。或者，由于活化而诱导了针对表达CD137的细胞的细胞毒性。或者，报告基因的表达由启动子诱导，该启动子由于活化而在CD137或CD3的信号转导途径的下游被活化。因此，可以测量细胞毒性或产生的报告蛋白的量，从而确认是否同时结合两个细胞。

在一个实施方案中，细胞毒性是T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)。在另一个实施方案中，细胞毒性是对在其表面表达CD3或CD137的细胞的细胞毒性。本发明的抗体(或抗原结合分子)的(细胞)细胞毒性或TDCC可以通过本领域已知的任何合适方法来评估。例如，可以如实施例2.3.2中所述通过实时细胞生长抑制测定法测量TDCC。在该测定中，将靶细胞与T细胞(例如PBMC)或扩增的T细胞在存在测试抗体的情况下在96孔板上温育，并通过本领域已知的方法监测靶细胞的生长，例如，通过使用合适的分析仪器(例如xCELLigence实时细胞分析仪)。根据CGI(％)＝100-(CI

在一个优选的方面，可以通过本领域已知的方法来测定T细胞活化，例如使用响应于其活化而表达报告基因(例如萤光素酶)的工程化T细胞系(例如Jurkat/NFAT-RE报告细胞系(T细胞活化生物测定法，Promega))的方法。在该方法中，在存在测试抗体的情况下，将靶细胞(例如表达CD3的细胞和表达CD137的细胞)与T细胞一起培养，然后通过适当的方法测量报告基因的表达产物的水平或活性作为T细胞活化的指数。当报告基因是萤光素酶基因时，可以测量由萤光素酶与其底物之间的反应引起的发光作为T细胞活化的指数。如果如上所述测量的T细胞活化较高，则确定测试抗体具有较高的T细胞活化活性。一方面，当在存在抗原结合分子的情况下将表达响应CD3信号传导的报告基因的重组T细胞与表达CD137的细胞共培养时，如果报告基因的表达或报告基因产物的活性至多为约50％、30％、20％、10％、5％或1％，则确定抗原结合分子不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的活化，其中100％活化是由同时结合CD3和CD137的抗原结合分子所达到的活化水平。一方面，当在存在抗原结合分子的情况下将表达响应CD3信号传导的报告基因的重组T细胞与表达CD137的细胞共培养时，如果报告基因的表达或报告基因产物的活性至多为约50％、30％、20％、10％、5％或1％，则确定抗原结合分子不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的活化，其中100％活化是由针对表达第三抗原分子的细胞的相同抗原结合分子所达到的活化水平。

在一个实施方案中，抗原结合分子是否不诱导细胞因子的释放可以通过例如将PBMC与抗原结合分子一起温育，并使用本领域已知的方法测量从PBMC释放到培养上清液中的细胞因子如IL-2、IFNγ和TNFα来确定。如果在已与抗原结合分子一起温育的PBMC的培养上清液中未检测到显著水平的细胞因子或未显著诱导细胞因子表达，则确定抗原结合分子不诱导来自PBMC的细胞因子释放。一方面，“无显著水平的细胞因子”也指约至多50％、30％、20％、10％、5％或1％的细胞因子浓度水平，其中100％是由同时结合CD3和CD137的抗原结合分子所达到的细胞因子浓度。一方面，“无显著水平的细胞因子”也指约至多50％、30％、20％、10％、5％或1％的细胞因子浓度水平，其中100％是在存在表达第三抗原分子的细胞的情况下所达到的细胞因子浓度。在一方面，“未显著诱导细胞因子表达”也指细胞因子浓度增加的水平，其是添加抗原结合分子之前每种细胞因子浓度的至多5倍、2倍或1倍。

在本发明中，“Fc区”是指包含由抗体分子中的铰链或其部分与CH2和CH3结构域组成的片段的区域。IgG类的Fc区是指但不限于从例如半胱氨酸226(EU编号(在本文中也称为EU索引))到C末端或从脯氨酸230(EU编号)到C末端的区域。Fc区可以优选通过以下方式获得：例如，用蛋白水解酶例如胃蛋白酶部分消化IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体，然后重新洗脱吸附在蛋白A柱或蛋白G柱上的级分。这种蛋白水解酶没有特别限制，只要该酶在适当设定的酶反应条件(例如pH)下能够消化全长抗体以限制性地形成Fab或F(ab')

在一些实施方案中，“抗原结合分子”没有特别限制，只要该分子包含本发明的“抗体可变区”即可。抗原结合分子可以进一步包含具有大约5个或更多个氨基酸的长度的肽或蛋白质。肽或蛋白质不限于源自生物体的肽或蛋白质，并且可以是例如由人工设计的序列组成的多肽。另外，可以使用天然多肽、合成多肽、重组多肽等。

在一些实施方案中，本发明的“抗原结合分子”不特别限于包含“抗体可变区”的分子。在某些实施方案中，可以通过本领域技术人员通常已知的方法获得不是包含可变区的抗体并且可以结合两种不同的抗原的抗原结合分子，例如Affibody等(PLoS One.2011；6(10):e25791；PLoS One.2012；7(8):e42288；J Mol Biol.2011 Aug 5；411(1):201-19；Proc Natl Acad Sci U S A.2011 Aug 23；108(34):14067-72)。

本发明的抗原结合分子的优选实例可包括包含抗体Fc区的抗原结合分子。

源自例如天然存在的IgG的Fc区可以用作本发明的“Fc区”。在本文中，天然存在的IgG是指含有与天然存在的IgG相同的氨基酸序列的多肽，并且属于基本上由免疫球蛋白γ基因编码的一类抗体。天然存在的人IgG是指例如天然存在的人IgG1，天然存在的人IgG2，天然存在的人IgG3或天然存在的人IgG4。天然存在的IgG还包括由其自发衍生的变体等。NIH出版号91-3242的具有免疫学意义的蛋白质序列中，将基于基因多态性的多个同种异型序列描述为人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4抗体的恒定区，其中任何一个都可以用于本发明中。特别地，人IgG1的序列可以具有作为EU编号位置356至358的氨基酸序列的DEL或EEM。

发现抗体Fc区为例如IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM类型的Fc区。例如，源自天然存在的人IgG抗体的Fc区可以用作本发明的抗体Fc区。例如，源自天然存在的IgG恒定区的Fc区，特别是源自天然存在的人IgG1的恒定区(SEQ ID NO:208)，源自天然存在的人IgG2的恒定区(SEQ ID NO:209)，源自天然存在的人IgG3的恒定区(SEQ ID NO:210)或源自天然存在的人IgG4的恒定区(SEQ ID NO:211)可用作本发明的Fc区。天然存在的IgG的恒定区还包括由其自发衍生的变体等。

本发明的Fc区特别优选为对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区。在本上下文中，Fcγ受体(在本文中也称为FcγR)是指能够结合IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的受体，并且是指基本上由Fcγ受体基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，该家族包括但不限于：FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa，FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131(H型)和R131(R型))，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)；以及尚未发现的人类FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR包括源自人、小鼠、大鼠、兔子和猴子的那些FcγR。FcγR不限于这些分子，并且可以源自任何生物。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)，FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)，以及任何尚未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。此类Fcγ受体的优选实例包括人FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)，FcγRIIb(CD32)，FcγRIIIa(CD16)和/或FcγRIIIb(CD16)。

FcγR被发现以具有ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)的活化受体和具有ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)的抑制受体的形式存在。FcγR被分类为活性型FcγR(FcγRI、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa和FcγRIIIb)和抑制型FcγR(FcγRIIb)。

FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于NM_000566.3和NP_000557.1中；FcγRIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于BC020823.1和AAH20823.1中；FcγRIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于BC146678.1和AAI46679.1中；FcγRIIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于BC033678.1和AAH33678.1中；以及FcγRIIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于BC128562.1和AAI28563.1中(RefSeq登记号)。FcγRIIa具有FcγRIIa的131位的氨基酸被组氨酸(H型)或精氨酸(R型)取代的两种基因多态性(J.Exp.Med,172,19-25,1990)。FcγRIIb具有FcγRIIb的232位的氨基酸被异亮氨酸(I型)或苏氨酸(T型)取代的两种基因多态性(Arthritis.Rheum.46:1242-1254(2002))。FcγRIIIa具有FcγRIIIa的158位的氨基酸被缬氨酸(V型)或苯丙氨酸(F型)取代的两种基因多态性(J.Clin.Invest.100(5):1059-1070(1997))。FcγRIIIb具有两种基因多态性(NA1型和NA2型)(J.Clin.Invest.85:1287-1295(1990))。

对Fcγ受体的降低的结合活性，可通过如FACS、ELISA形式、ALPHAScreen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay,放大发光邻近均相测定筛选)或基于表面等离振子共振(SPR)现象的BIACORE方法等熟知的方法来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。

ALPHAScreen方法是通过使用两种珠粒(供体和受体)的ALPHA技术，基于下述原理来实施的：通过结合于供体珠粒的分子和结合于受体珠粒的分子之间生物学相互作用，仅在这两种珠粒靠近时检测到发光信号。供体珠粒内的由激光激发的光敏剂将周围的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散至供体珠粒周围，到达靠近的受体珠粒，从而引起珠粒内的化学发光反应，最终发出光。结合于供体珠粒的分子和结合于受体珠粒的分子不发生相互作用时，供体珠粒产生的单线态氧不会到达受体珠粒。因此，不会发生化学发光反应。

例如，使生物素标记的抗原结合分子与供体珠粒结合，而使谷胱甘肽S转移酶(GST)标记的Fcγ受体与受体珠粒结合。在不存在具有突变的Fc区的竞争抗原结合分子的情况下，具有野生型Fc区的抗原结合分子和Fcγ受体发生相互作用而产生520-620nm的信号。具有突变的Fc区的未标记抗原结合分子与具有野生型Fc区的抗原结合分子竞争与Fcγ受体的相互作用。由于竞争而导致的荧光减少可以定量，从而确定相对结合亲和力。使用磺基-NHS-生物素等的抗原结合分子(例如抗体)生物素化是本领域已知的。可以通过适当采用的方法用GST标记Fcγ受体，该方法包括例如将编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸在框内融合；使得到的融合基因被含有能够表达其的载体的细胞等表达，然后使用谷胱甘肽柱进行纯化。优选地，使用例如基于非线性回归分析的适于单位点竞争(one-sitecompetition)模型的软件GRAPHPAD PRISM(GraphPad Software，Inc.，San Diego)来分析所获得的信号。

将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上。从传感器芯片的背面用光照射传感器芯片，使得在金薄膜和玻璃之间的界面发生全反射。结果，在一部分反射光中形成了反射强度(SPR信号)下降的部位。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)注射到传感器芯片的表面。分析物与配体结合时，固定化配体分子的质量会增加，从而改变传感器芯片表面的溶剂的折射率。折射率的这种变化使SPR信号的位置发生移位(相反，结合分子的解离会使信号返回到原始位置)。Biacore系统在纵坐标上绘制位移量，即传感器芯片表面上的质量变化，并显示依赖时间的质量变化作为测定数据(传感器图)。由传感图的曲线可确定动力学，即缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，而由这些常数的比例可确定亲和力(KD)。BIACORE法中还优选使用抑制测定法。抑制测定法的实例描述在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010中。

本说明书中，对Fcγ受体的降低的结合活性是指，根据上述的分析方法，与含有Fc区的对照抗原结合分子的结合活性相比，待测抗原结合分子显示出例如，50％以下、优选45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、或15％以下、特别优选10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下的结合活性。

具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子可以适当地用作对照抗原结合分子。Fc区的结构描述于：SEQ ID NO:212(RefSeq登记号AAC82527.1，N末端添加有A)、SEQ ID NO:213(RefSeq登记号AAB59393.1，N末端添加有A)、SEQ ID NO:214(RefSeq登记号CAA27268.1，N末端添加有A)、或SEQ ID NO:215(RefSeq登记号AAB59394.1，N末端添加有A)中。在使用具有某种同种型抗体的Fc区的变体的抗原结合分子作为测试物质的情况下，将具有该某种同种型抗体的Fc区的抗原结合分子用作对照，以测试变体中的突变对针对Fcγ受体的结合活性的影响。适当地制备了具有由此确认的对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区变体的抗原结合分子。

例如，231A-238S缺失(WO 2009/011941)，C226S，C229S，P238S，(C220S)(J.Rheumatol(2007)34、11)，C226S，C229S(Hum.Antibod.Hybromaomas(1990)1(1)，47-54)，C226S，C229S，E233P，L234V或L235A(Blood(2007)109，1185-1192)(这些氨基酸根据EU编号定义)变体作为这种变体在本领域中是已知的。

其优选实例包括具有通过取代以下任一组成氨基酸而从某种同种型抗体的Fc区衍生的Fc区的抗原结合分子:根据EU编号定义的在位置220,226,229,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,264,265,266,267,269,270,295,296,297,298,299,300,325,327,328,329,330,331,和332处的氨基酸。Fc区所来源的抗体同种型没有特别限制，并且可以适当地使用源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体的Fc区。优选使用源自天然存在的人IgG1抗体的Fc区。

例如，还可以适当地使用具有从IgG1抗体Fc区通过组成氨基酸的以下任意取代基衍生的Fc区的抗原结合分子(数字表示根据EU编号定义的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母氨基酸代码表示取代前的氨基酸残基；位于该数字之后的单字母氨基酸代码表示取代后的氨基酸残基)：

(a)L234F、L235E和P331S，

(b)C226S、C229S和P238S，

(c)C226S和C229S，以及

(d)C226S、C229S、E233P、L234V和L235A，

或者通过缺失根据EU编号定义的231至238位的氨基酸序列而衍生。

还可以适当地使用具有从IgG2抗体Fc区通过组成氨基酸的以下任意取代基而衍生的Fc区的抗原结合分子(数字表示根据EU编号定义的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母氨基酸代码表示取代前的氨基酸残基；位于该数字之后的单字母氨基酸代码表示取代后的氨基酸残基)：

(e)H268Q、V309L、A330S和P331S，

(f)V234A，

(g)G237A，

(h)V234A和G237A，

(i)A235E和G237A，以及

(j)V234A、A235E和G237A，

以上根据EU编号定义。

还可以适当地使用具有从IgG3抗体Fc区通过组成氨基酸的以下任意取代基衍生的Fc区的抗原结合分子(数字表示根据EU编号定义的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母氨基酸代码表示取代前的氨基酸残基；位于该数字之后的单字母氨基酸代码表示取代后的氨基酸残基)：

(k)F241A,

(l)D265A,和

(m)V264A

以上根据EU编号定义。

还可以适当地使用具有从IgG4抗体Fc区通过组成氨基酸的以下任意取代基衍生的Fc区的抗原结合分子(数字表示根据EU编号定义的氨基酸残基的位置；位于数字前的单字母氨基酸代码表示取代前的氨基酸残基；位于该数字之后的单字母氨基酸代码表示取代后的氨基酸残基)：

(n)L235A、G237A和E318A,

(o)L235E,和

(p)F234A和L235A

以上根据EU编号定义。

其他优选实例包括具有从天然存在的人IgG1抗体的Fc区衍生的Fc区的抗原结合分子，所述Fc区通过利用在对应的IgG2或IgG4的Fc区中的相应EU编号位置处的氨基酸取代以下任意组成氨基酸而获得：根据EU编号定义的233、234、235、236、237、330和331位的氨基酸。

其他优选实例包括具有从天然存在的人IgG1抗体的Fc区衍生的Fc区的抗原结合分子，所述Fc区通过利用不同氨基酸取代以下任意一个或更多个组成氨基酸而获得：根据EU编号定义的234、235和297位的氨基酸。取代后所存在的氨基酸的类型没有特别限制。特别优选具有234位、235位、297位的任一个或更多个氨基酸被丙氨酸取代的Fc区的抗原结合分子。

其他优选实例包括具有从IgG1抗体的Fc区衍生的Fc区的抗原结合分子，所述Fc区通过利用不同氨基酸取代根据EU编号定义的265位的组成氨基酸而获得。取代后所存在的氨基酸的类型没有特别限制。特别优选具有265位的氨基酸被丙氨酸取代的Fc区的抗原结合分子。

本发明的“抗原结合分子”的一个优选形式可以为，例如，含有本发明抗体可变区的多特异性抗体。

通过将电荷排斥引入抗体H链的第二恒定结构域(CH2)或第三恒定结构域(CH3)之间的界面来抑制H链之间的非目标缔合的技术(WO2006/106905)可用于多特异性抗体的缔合。在通过将电荷排斥引入CH2或CH3界面来抑制H链之间的非目标缔合的技术中，在H链恒定结构域之间的界面上彼此接触的氨基酸残基的实例可以包括一个CH3结构域中EU编号位置356处的残基，EU编号位置439处的残基，EU编号位置357处的残基，EU编号位置370处的残基，EU编号位置399处的残基以及EU编号位置409处的残基，以及它们在另一个CH3结构域中的伙伴残基。

更具体地，例如，包含两个H链CH3结构域的抗体可以制备为其中选自第一H链CH3结构域中以下氨基酸残基对(1)至(3)的一至三对氨基酸残基带有相同电荷的抗体：(1)H链CH3结构域中包含的EU编号位置356和439处的氨基酸残基；(2)H链CH3结构域中包含的EU编号位置357和370处的氨基酸残基；以及(3)H链CH3结构域中包含的EU编号位置399和409处的氨基酸残基。

该抗体可以进一步制备成这样的抗体，其中一至三对氨基酸残基选自与第一H链CH3结构域不同的第二H链CH3结构域中的氨基酸残基对(1)至(3)，从而对应于第一H链CH3结构域中带有相同电荷的氨基酸残基对(1)至(3)，并且带有与第一H链CH3结构域中其相应氨基酸残基相反的电荷。

(1)至(3)对中记载的每个氨基酸残基位于其在缔合H链中的伙伴的附近。本领域技术人员可以使用市售的软件通过同源性建模等，找到与期望的H链CH3结构域或H链恒定结构域的各对(1)～(3)中记载的氨基酸残基对应的位置，并且可以适当地改变这些位置的氨基酸残基。

在上述抗体中，每个“带有电荷的氨基酸残基”优选选自，例如，以下(a)和(b)组中的任一个所包含的氨基酸残基：

(a)谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；和

(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。

在上述抗体中，短语“带有相同电荷”是指，例如，两个或更多个氨基酸残基全部是(a)和(b)组中的任一个所包括的氨基酸残基。术语“带有相反电荷”是指，例如，两个或更多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基可以是(a)和(b)组中任一个所包含的氨基酸残基，而剩余的氨基酸残基是另一组中包含的氨基酸残基。

在一个优选的实施方案中，抗体可以具有通过二硫键交联的第一H链CH3结构域和第二H链CH3结构域。

根据本发明待改变的氨基酸残基不限于上述抗体可变区或抗体恒定区中的氨基酸残基。本领域技术人员可以使用可商购的软件通过同源性建模等来发现构成多肽变体或异源多聚体的界面的氨基酸残基，并且可以改变该位置处的氨基酸残基以调节缔合。

本发明的多特异性抗体的缔合也可以通过本领域已知的备选技术来进行。一个抗体H链可变结构域中存在的氨基酸侧链被较大的侧链(旋钮)取代，另一个H链可变结构域中存在的其伙伴氨基酸侧链被较小的侧链取代(孔)。可将旋钮放入孔中以有效地缔合氨基酸序列不同的Fc结构域的多肽(WO1996/027011；Ridgway JB等人，Protein Engineering(1996)9，617-621；和Merchant Am等人,Nature Biotechnology(1998)16，677-681)。

除该技术外，本领域已知的另一种备选技术可用于形成本发明的多特异性抗体。一个抗体H链的CH3的一部分被转化为其对应的IgA衍生序列，另一条H链的CH3的CH3互补部分被转化为其对应的IgA衍生序列。使用所得的链交换工程化结构域CH3可导致通过互补CH3缔合而在序列中不同的多肽之间的有效缔合(Protein Engineering Design&Selection，23；195-202，2010)。通过使用本领域已知的该技术，还可以有效地形成目的多特异性抗体。

或者，还可以通过以下技术形成多特异性抗体：如WO2011/028952中记载的使用抗体的CH1-CL缔合和VH-VL缔合的抗体制备技术；如WO2008/119353和WO2011/131746中记载的使用分别制备的单克隆抗体(Fab臂交换)来制备双特异性抗体的技术；如WO2012/058768和WO2013/063702中记载的控制抗体重链CH3结构域之间的缔合的技术；WO2012/023053中记载的制备由两种类型轻链和一种类型重链构成的双特异性抗体的技术；或如Christoph等人(Nature Biotechnology Vol.31,p753-758(2013))中记载的使用分别表达由1条H链和1条L链构成的抗体半分子(half-molecule)的2个细菌细胞系来制备双特异性抗体的技术等。除了这些缔合技术之外，CrossMab技术也可用于制备本发明所提供的多特异性或多互补位(multiparatopic)抗原结合分子，所述CrossMab技术是使形成结合于第一表位的可变区的轻链和形成结合于第二表位的可变区的轻链分别与形成结合于第一表位的可变区的重链和形成结合于第二表位的可变区的重链缔合的已知异种轻链缔合技术(Scaefer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2011)108,11187-11192)。使用单独制备的单克隆抗体制备双特异性抗体的技术的实例可包括涉及通过将重链CH3结构域中特定氨基酸被取代的单克隆抗体置于还原条件下以促进抗体异二聚化来获得所需双特异性抗体的方法。该方法中优选的氨基酸取代位点的实例可包括CH3结构域中EU编号位置392处的残基和EU编号位置397处的残基。此外，还可以使用抗体来制备双特异性抗体，所述前一抗体中选自第一H链CH3结构域中以下氨基酸残基对(1)至(3)的一至三对氨基酸残基带有相同电荷：(1)H链CH3结构域中包含的EU编号位置356和439处的氨基酸残基；(2)H链CH3结构域中包含的EU编号位置357和370处的氨基酸残基；以及(3)H链CH3结构域中包含的EU编号位置399和409处的氨基酸残基。该双特异性抗体可以通过使用这样的抗体来制备，该抗体中一至三对氨基酸残基选自与第一H链CH3结构域不同的第二H链CH3结构域中的氨基酸残基对(1)至(3)，从而对应于带有第一H链CH3结构域中相同电荷的氨基酸残基对(1)至(3)，并且带有与第一H链CH3结构域中其相应氨基酸残基相反的电荷。

即使无法有效地形成目标多特异性抗体，通过从所产生的抗体中分离、纯化目标多特异性抗体也可获得本发明的多特异性抗体。例如，先前报道的方法包括：向两种类型H链的可变区引入氨基酸取代来赋予其等电点的差异，从而将两种类型同源二聚体和目标异源二聚体抗体用离子交换层析分别纯化(WO2007114325)。作为纯化异源二聚体的方法，先前已报道了：使用蛋白A纯化异源二聚化抗体的方法，所述异源二聚化抗体由能结合于蛋白A的小鼠IgG2a的H链和不能结合于蛋白A的大鼠IgG2b的H链组成(WO98050431和WO95033844)。或者，构成IgG的蛋白A结合位点的EU编号位置435和436处的氨基酸残基可以被诸如Tyr和His之类的氨基酸取代，所述氨基酸提供了蛋白A不同的结合强度，并且所得的H链用于改变每个H链与蛋白A的相互作用。结果，通过使用蛋白A柱，只有异源二聚体化抗体可以被有效地纯化。

这些技术中的多种，例如，两种或更多种可以组合使用。此外，这些技术还可以适当地分别适用于待缔合的两个H链。基于但不同于如此改变的形式，本发明的抗原结合分子可以被制备为具有与其相同的氨基酸序列的抗原结合分子。

氨基酸序列的改变可以通过该领域中已知的多种方法来进行。可以进行的这些方法的实例包括但不限于诸如定点诱变(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,andNakagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method forsite-directed mutagenesis.Gene 152,271-275；Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned intoM13vectors.Methods Enzymol.100,468-500；Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984)Thegapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic Acids Res.12,9441-9456；Kramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction ofmutations via gapped duplex DNAMethods.Enzymol.154,350-367；Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection.Proc Natl Acad Sci U S A.82,488-492)、PCR诱变法和盒式诱变的方法。

本发明的“抗原结合分子”可以是在单个多肽链内含有形成本发明“抗体可变区”的重链和轻链、但缺乏恒定区的抗体片段。这样的抗体片段可以是，例如双抗体(Db)、单链抗体或sc(Fab')2。

Db是由两条多肽链构成的二聚体(Holliger P等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)；EP404,097和W093/11161)。这些多肽链通过短至例如约5个残基的接头连接，使得同一条多肽链上的L链可变结构域(VL)和H链可变结构域(VH)不能彼此配对。

由于该短接头，在同一条多肽链上编码的VL和VH不能形成单链Fv，而是分别在另一条多肽链上与VH和VL二聚化，以形成两个抗原结合位点。

单链抗体的实例包括sc(Fv)2。sc(Fv)2是一种单链抗体，其一条链由通过肽接头等接头连接的四个可变结构域(即两个VL和两个VH)构成(J Immunol.Methods(1999)231(1-2)，(177-189)。这两个VH和VL可以源自不同的单克隆抗体。其优选实例包括双特异性sc(Fv)2，其识别存在于同一抗原中的两种类型的表位，如Journal of Immunology(1994)152(11)，5368-5374中所公开。sc(Fv)2可以通过本领域技术人员通常已知的方法来制备。例如，sc(Fv)2可以通过经诸如肽接头的接头连接两个scFv而制备。

构成本文所述的sc(Fv)2的抗原结合结构域的构型的实例包括抗体，其中两个VH和两个VL从单链多肽的N末端开始以VH、VL、VH和VL的顺序对齐(即[VH]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VL])。两个VH和两个VL的顺序不特别限于上述构型，并且可以是任何布置顺序。其实例还可以包括以下布置：

[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]，

[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]，

[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]，

[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]，以及

[VL]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VH]。

sc(Fv)2的分子形式也详细描述在WO2006/132352中。基于其中的描述，本领域技术人员可以适当地制备期望的sc(Fv)2以便制备本说明书中公开的抗原结合分子。

本发明的抗原结合分子可以与诸如PEG的载体聚合物或诸如抗癌剂的有机化合物缀合。另外，为了产生期望的效果，可优选通过插入糖基化序列将糖链添加到本发明的抗原结合分子中。

例如，可以通过基因工程引入的任意肽接头，或合成的化合物接头(例如，ProteinEngineering，9(3)，299-305，1996中公开的接头)可以用作连接抗体可变结构域的接头。在本发明中，肽接头是优选的。肽接头的长度没有特别限制，并且可以根据目的由本领域技术人员适当地选择。长度优选为5个以上的氨基酸(上限没有特别限制，通常为30个以下的氨基酸，优选为20个以下的氨基酸)，特别优选为15个氨基酸。当sc(Fv)2包含三个肽接头时，使用的所有这些肽接头可以具有相同的长度或可以具有不同的长度。

肽接头的实例可包括：

Ser,

Gly-Ser,

Gly-Gly-Ser,

Ser-Gly-Gly,

Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:216),

Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:217),

Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:218),

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:219),

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:220),

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:221),

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:222),

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:223),

(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:218))n,以及

(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:219))n，

其中n是1以上的整数。

然而，肽接头的长度或序列可以根据目的由本领域技术人员适当地选择。

合成化合物接头(化学交联剂)是肽的交联中通常所用的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)或双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)。

这些交联剂是可商购的。

连接4个抗体可变结构域通常需要3个接头。使用的所有这些接头可以是相同的接头或可以是不同的接头。

F(ab')2包含两条轻链和两条重链，所述重链包含恒定区(CH1结构域和CH2结构域的一部分)从而在两个重链间形成链间的二硫键。本说明书中公开的构成多肽缔合体的F(ab’)2，可优选通过下述的方法获取：将具有所期望的抗原结合结构域的全长单克隆抗体用胃蛋白酶等的蛋白水解酶进行部分消化，然后去除吸附于蛋白A柱上的Fc片段。这种蛋白水解酶没有特别限制，只要该酶在适当设定的酶反应条件(例如pH)下能够消化全长抗体以限制性地形成F(ab')

除了上述的氨基酸改变之外，本发明的抗原结合分子可以进一步包含额外的改变。额外的改变可选自，例如氨基酸的取代、缺失或修饰及其组合。

例如，本发明的抗原结合分子可以基本上不改变分子的预期功能而被任意地进一步改变。例如，这样的突变可以通过氨基酸残基的保守取代来进行。或者，可以进行甚至改变本发明的抗原结合分子的预期功能的改变，只要通过这种改变而改变的功能落在本发明的目的之内即可。

根据本发明的氨基酸序列的改变还包括翻译后修饰。具体地，翻译后修饰可以指糖链的添加或缺失。例如，具有IgG1型恒定区的本发明的抗原结合分子可以在EU编号位置297处具有糖链修饰的氨基酸残基。用于修饰的糖链结构不受限制。通常，由真核细胞表达的抗体在其恒定区中涉及糖链修饰。因此，由以下细胞表达的抗体通常会被一些糖链修饰：

哺乳动物的抗体产生细胞；和

利用含有编码抗体的DNA的表达载体转化的真核细胞。

在本上下文中，真核细胞包含酵母和动物细胞。例如，CHO细胞或HEK293H细胞是用于利用含有编码抗体的DNA的表达载体进行转化的典型动物细胞。另一方面，本发明的抗体还包括在该位点没有糖链修饰的抗体。恒定区没有被糖链修饰的抗体可通过使编码这些抗体的基因在大肠杆菌等原核细胞中表达来获得。

根据本发明的额外的改变可以更具体地是，例如，在Fc区中的糖链上添加唾液酸(mAbs.2010 Sep-Oct；2(5)：519-27)。

当本发明的抗原结合分子具有Fc区时，例如，可以向其中添加改善针对FcRn的结合活性的氨基酸取代(J Immunol.2006 Jan 1；176(1):346-56；J Biol Chem.2006 Aug18；281(33):23514-24；Int Immunol.2006Dec；18(12):1759-69；Nat Biotechnol.2010Feb；28(2):157-9；WO2006/019447；WO2006/053301；和WO2009/086320)或改善抗体异质性或稳定性的氨基酸取代((WO2009/041613))。

在本发明中，术语“抗体”以最广义使用，并且还包括任何抗体，例如单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，抗体变体，抗体片段，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，嵌合抗体和人源化抗体，只要所述抗体表现出所需的生物学活性即可。

本发明的抗体不受其抗原的类型，其来源等的限制，并且可以是任何抗体。抗体来源的实例可包括但不特别限于人抗体，小鼠抗体，大鼠抗体和兔抗体。

抗体可以通过本领域技术人员众所周知的方法来制备。例如，单克隆抗体可以通过杂交瘤方法(Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975))或重组方法(美国专利号4,816,567)制备。或者，可以从噬菌体展示的抗体文库中分离单克隆抗体(Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；和Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991))。而且，可以从单个B细胞克隆中分离单克隆抗体(N.Biotechnol.28(5)：253-457(2011))。

人源化抗体也称为改型人抗体。具体地，例如，由非人类动物(例如小鼠)抗体CDR移植的人类抗体组成的人源化抗体是本领域已知的。通用基因重组方法也已知用于获得人源化抗体。具体地，例如，重叠延伸PCR作为将小鼠抗体CDRs移植到人FR的方法在本领域中是已知的。

可将编码各自包含连接的三个CDR和四个FR的抗体可变结构域的DNA和编码人抗体恒定结构域的DNA插入表达载体，使得可变结构域DNA与恒定结构域DNA在框内融合以制备用于人源化抗体表达的载体。将具有插入序列的这些载体转移至宿主以建立重组细胞。然后，培养重组细胞以表达编码人源化抗体的DNA，以在培养细胞的培养物中产生人源化抗体(参见欧洲专利公开号EP239400和国际公开号WO1996/002576)。

如果需要，可以取代一个或多个FR氨基酸残基，使得改型人抗体的CDR形成合适的抗原结合位点。例如，FR的氨基酸序列可以通过应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR方法而突变。

可以使用具有人抗体基因的所有组成部分的转基因动物作为免疫动物通过DNA免疫获得所需的人抗体(参见国际公开号WO1993/012227,WO1992/003918,WO1994/002602,WO1994/025585,WO1996/034096,和WO1996/033735)。

另外，通过使用人抗体文库的淘选来获得人抗体的技术也是已知的。例如，通过噬菌体展示方法，人抗体V区在噬菌体表面上表达为单链抗体(scFv)。可以选择表达抗原结合scFv的噬菌体。可以分析所选噬菌体的基因以确定编码抗原结合人抗体的V区的DNA序列。确定抗原结合scFv的DNA序列后，可以将V区序列与所需人抗体C区的序列在框内融合，然后插入适当的表达载体中以制备表达载体。将表达载体转移至上面列出的优选表达细胞中，以表达编码人抗体的基因以获得人抗体。这些方法是本领域已知的(参见国际公开号WO1992/001047,WO1992/020791,WO1993/006213,WO1993/011236,WO1993/019172,WO1995/001438,和WO1995/015388)。

除了噬菌体展示技术外，例如，使用无细胞翻译系统的技术，在细胞或病毒表面展示抗原结合分子的技术以及使用乳剂的技术已知作为通过使用人抗体文库的淘选来获得人抗体的技术。例如，涉及通过去除终止密码子等经由核糖体形成mRNA和翻译的蛋白质的复合体的核糖体展示方法，涉及使用嘌呤霉素等化合物将翻译的蛋白质与基因序列共价结合的cDNA或mRNA展示方法，或涉及利用核酸结合蛋白形成基因与翻译蛋白的复合体的CIS展示法可以用作使用无细胞翻译系统的技术。噬菌体展示方法以及大肠杆菌展示方法，革兰氏阳性细菌展示方法，酵母展示方法，哺乳动物细胞展示方法，病毒展示方法等可以用作在细胞或病毒表面展示抗原结合分子的技术。例如，使用乳剂中包含的基因和翻译相关分子的体外病毒展示方法可以用作使用乳剂的技术。这些方法在本领域中是已知的(NatBiotechnol.2000 Dec；18(12):1287-92；Nucleic Acids Res.2006；34(19):e127；ProcNatl Acad Sci U S A.2004 Mar 2；101(9):2806-10；Proc Natl Acad Sci U S A.2004Jun 22；101(25):9193-8；Protein Eng Des Sel.2008 Apr；21(4):247-55；Proc NatlAcad Sci U S A.2000 Sep 26；97(20):10701-5；MAbs.2010 Sep-Oct；2(5):508-18；和Methods Mol Biol.2012；911:183-98)。

与本发明的第三抗原结合的可变区可以是识别任意抗原的可变区。与本发明的第三抗原结合的可变区可以是识别在癌症组织中特异性表达的分子的可变区。

本说明书中，对“第三抗原”没有特别限定，可以是任何抗原。抗原的实例包括：17-IA、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活蛋白、激活蛋白A、激活蛋白AB、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白RIA、激活蛋白RIA ALK-2、激活蛋白RIB ALK-4、激活蛋白RIIA、激活蛋白RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressins)、脂连蛋白、ADP核糖基环化酶-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、变应原、α1-抗化学胰蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、α-突触核蛋白、α-V/β-1拮抗剂、aminin、支链淀粉、淀粉样蛋白β、淀粉样蛋白免疫球蛋白重链可变区、淀粉样蛋白免疫球蛋白轻链可变区、雄激素、ANG、血管紧张素原、促血管生成素配体-2、抗-Id、抗凝血酶III、炭疽、APAF-1、APE、APJ、apo A1、apo血清淀粉样蛋白A、Apo-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、ASPARTIC、心钠素、心房钠尿肽、心房钠尿肽A、心房钠尿肽B、心房钠尿肽C、av/b3整联蛋白、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)保护抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、BcI、BCMA、BDNF、b-ECGF、β-2-微球蛋白、β内酰胺酶、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、B淋巴细胞刺激因子(BIyS)、BMP、BMP-2(BMP-2a)、BMP-3(成骨蛋白(Osteogenin))、BMP-4(BMP-2b)、BMP-5、BMP-6(Vgr-1)、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BMPR-II(BRK-3)、BMPs、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子(Bone-derivedneurotrophic factor)、牛生长激素、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、B-淋巴细胞粘附分子、C10、C1抑制剂、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a(补体5a)、CA125、CAD-8、钙黏蛋白-3、降钙素、cAMP、碳酸酐酶-IX、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原(carcinoma-associated antigen)、心肌营养蛋白-1、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/嗜酸粒细胞趋化蛋白(Eotaxin)、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/嗜酸粒细胞趋化蛋白-2、CCL25/TECK、CCL26/嗜酸粒细胞趋化蛋白-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-α、CCL3Ll/LD-78-β、CCL4/MIP-l-β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-γ、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受体、CINC、CKb8-1、密蛋白18、CLC、肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)毒素、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、补体因子3(C3)、补体因子D、皮质类固醇结合球蛋白、集落刺激因子-1受体、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/CXXXC趋化因子、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-α、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-l-α/β、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/Lungkine.CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-βCXCL3/Gro-γ、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCLlO/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰变促进因子、δ样蛋白(Delta-like protein)配体4、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、DHICA氧化酶、Dickkopf-1、地高辛、二肽基肽酶IV、DKl、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、含EGF样结构域的蛋白7(EGF like domain containing protein 7)、弹性蛋白酶、弹性蛋白、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、内皮唾液酸蛋白(Endosialin)、内皮素受体、内毒素、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸粒细胞趋化蛋白、嗜酸粒细胞趋化蛋白-2、eotaxini、EpCAM、肝配蛋白(Ephrin)B2/EphB4、Epha2酪氨酸激酶受体、上皮生长因子受体(EGFR)、ErbB2受体、ErbB3酪氨酸激酶受体、ERCC、EREG、促红细胞生成素(EPO)、促红细胞生成素受体、E-选择蛋白、ET-1、Exodus-2、RSV的F蛋白、F10、F11、F12、F13、F5、F9、因子Ia、因子IX、因子Xa、因子VII、因子VIII、因子VIIIc、Fas、FcαR、FcεRI、FcγIIb、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受体、FGF-3、FGF-8、酸性FGF(FGF-acidic)、碱性FGF(FGF-basic)、纤维蛋白、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-10、纤连蛋白、FL、FLIP、Flt-3、FLT3配体、叶酸受体、促卵泡激素(FSH)、CXXXC趋化因子(CX3C)、游离型重链、游离型轻链、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受体、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15(MIC-1)、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14/CDMP-1)、GDF-6(BMP-13/CDMP-2)、GDF-7(BMP-12/CDMP-3)、GDF-8(Myostatin，肌生长抑制素)、GDF-9、GDNF、凝溶胶蛋白、GFAP、GF-CSF、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GF-β1、gH包膜糖蛋白、GITR、胰高血糖素、胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽1受体、Glut 4、谷氨酸羧肽酶II、糖蛋白激素受体、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM-CSF、GM-CSF受体、gp130、gp140、gp72、粒细胞-CSF(G-CSF)、GRO/MGSA、生长激素释放因子、GRO-β、GRO-γ、幽门螺杆菌(H.pylori)、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCC1、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(Hemopoieticgrowth factor)(HGF)、Hep B gp120、乙酰肝素酶、肝素辅因子II、肝细胞生长因子、炭疽杆菌保护抗原、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、戊型肝炎、铁调素(Hepcidin)、Her1、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HGF、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen)(HMW-MAA)、HIV包膜蛋白如GP120、HIV MIB gp 120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖蛋白、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(hGH)、人血清白蛋白、人组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、亨廷顿蛋白、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgA、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1、IGF-1R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受体、IL-11、IL-11受体、IL-12、IL-12受体、IL-13、IL-13受体、IL-15、IL-15受体、IL-16、IL-16受体、IL-17、IL-17受体、IL-18(IGIF)、IL-18受体、IL-1α、IL-1β、IL-1受体、IL-2、IL-2受体、IL-20、IL-20受体、IL-21、IL-21受体、IL-23、IL-23受体、IL-2受体、IL-3、IL-3受体、IL-31、IL-31受体、IL-3受体、IL-4、IL-4受体、IL-5、IL-5受体、IL-6、IL-6受体、IL-7、IL-7受体、IL-8、IL-8受体、IL-9、IL-9受体、免疫球蛋白免疫复合体、免疫球蛋白、INF-α、INF-α受体、INF-β、INF-β受体、INF-γ、INF-γ受体、IFN I型、IFN I型受体、流感病毒、抑制素、抑制素α、抑制素β、iNOS、胰岛素、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、胰岛素样生长因子结合蛋白、整联蛋白、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α-V/β-3、整联蛋白α-V/β-6、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α5/β6、整联蛋白ασ(αV)、整联蛋白αθ、整联蛋白β1、整联蛋白β2、整联蛋白β3(GPIIb-IIIa)、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、激肽释放酶结合蛋白(kallistatin)、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、kit配体(KL)、Kit酪氨酸激酶、层粘连蛋白5、LAMP、LAPP(支链淀粉，胰岛淀粉样多肽)、LAP(TGF-1)、潜伏期相关肽、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受体、LECT2、Lefty、瘦蛋白、促黄体激素(leutinizinghormone)(LH)、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受体、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性剂、黄体生成素、淋巴细胞趋化蛋白、淋巴毒素β受体、lysosphingolipd受体、Mac-1、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、maspin、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I(MCAF)、M-CSF、MDC、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、megsin、Mer、MET酪氨酸激酶受体家族、金属蛋白酶、膜糖蛋白OX2、间皮蛋白、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、微生物蛋白(microbialprotein)、MIF、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、单核细胞趋化蛋白(monocyte attractant protein)、单核细胞集落抑制因子(monocytecolony inhibitory factor)、小鼠促性腺激素相关(gonadotropin-associated)多肽、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、黏蛋白(Mud)、缪勒氏管抑制物质(MIS)、Mug、MuSK、髓鞘相关糖蛋白、骨髓前体细胞抑制因子-1(MPIF-I)、NAIP、纳米抗体(Nanobody)、NAP、NAP-2、NCA90、NCAD、N-钙黏蛋白、NCAM、脑啡肽酶、神经细胞粘附分子、神经丝氨酸蛋白酶抑制剂(neroserpin)、神经元生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-6、神经毡蛋白1、Neurturin、NGF-β、NGFR、NKG20、N-甲硫氨酰人生长激素、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受体、丙型肝炎病毒衍生的非结构蛋白3型(NS3)、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、制癌蛋白M、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受体、骨诱导因子(osteoinductive factor)、骨桥蛋白、OX40L、OX40R、氧化型LDL、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏蛋白、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受体、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盘生长因子、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、胎盘催乳激素、纤溶酶原激活物抑制剂-1、血小板生长因子(platelet-growth factor)、plgR、PLP、不同大小的聚乙二醇链(poly glycol chain)(例如、PEG-20、PEG-30、PEG40)、PP14、前激肽释放酶、朊病毒蛋白、降钙素原、程序性细胞死亡蛋白1、胰岛素原、催乳素、原蛋白转化酶PC9、松弛素原(prorelaxin)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、蛋白A、蛋白C、蛋白D、蛋白S、蛋白Z、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-选择蛋白糖蛋白配体-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、松弛素、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV)F、Ret、reticulon 4、类风湿因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、Sclerostin、SDF-1、SDF1α、SDF1β、SERINE、血清淀粉样蛋白P、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、志贺样毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、鞘氨醇1-磷酸受体1、葡萄球菌的脂磷壁酸质、Stat、STEAP、STEAP-II、干细胞因子(SCF)、链激酶、超氧化物歧化酶、黏结蛋白聚糖-1、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TB、TCA-3、T细胞受体α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、生腱蛋白、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性(TGF-βPan Specific)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-βRl(ALK-5)、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、凝血酶、血小板生成素(TPO)、胸腺基质淋巴蛋白(Thymic stromal lymphoprotein)受体、胸腺Ck-1、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、组织因子蛋白酶抑制剂、组织因子蛋白、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受体I、TNF受体II、TNF-α、TNF-β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2/DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2/TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R/TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF/TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF12A、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16(NGFRp75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ/TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF Rl CD120a/p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b/p75-80)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRSF25(DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII/TNFC R)、TNFRSF4(OX40ACT35/TXGP1R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1/APT1/CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68/TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1 BB CD137/ILA)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体/TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF/OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体/DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体/LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体/TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin/DIF/TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa/TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC/p33)、TNFSF4(OX40配体gp34/TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体/APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1 BB配体CD137配体)、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代谢物(toxic metabolite)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TGF-α和TGF-β等转化生长因子(TGF)、跨膜糖蛋白NMB、运甲状腺素蛋白、TRF、Trk、TROP-2、滋养层糖蛋白、TSG、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤相关抗原CA 125、表达Lewis Y相关糖的肿瘤相关抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VAP-1、血管内皮生长因子(VEGF)、vaspin、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEFGR-2、VEGF受体(VEGFR)、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、维生素B12受体、玻连蛋白受体、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子(vWF)、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-l-β、XCLl/淋巴细胞趋化蛋白、XCR1、XEDAR、XIAP和XPD。

在T细胞上特异性表达的分子的具体实例包括CD3和T细胞受体。特别优选为CD3。例如，人CD3的情况下，本发明的抗原结合分子所结合的CD3中的位点可以是存在于构成人CD3的γ链、δ链或ε链序列中的任何表位。特别优选存在于人CD3复合物的ε链的细胞外区的表位。构成CD3的γ链，δ链和ε链结构的多核苷酸序列示于SEQ ID NO：224(NM_000073.2)、226(NM_000732.4)和228(NM_000733.3)中，其多肽序列示于SEQ ID NO：225(NP_000064.1)、227(NP_000723.1)和229(NP_000724.1)中(RefSeq登记号显示在括号中)。

本发明的抗原结合分子中所包括的抗体的两个可变区之一与不同于上述“CD3”和“CD137”的“第三抗原”结合。在一些实施方案中，第三抗原源自人、小鼠、大鼠、猴、兔或狗。在一些实施方案中，第三抗原是在人或小鼠、大鼠、猴、兔或狗来源的细胞或器官上特异性表达的分子。第三抗原优选是在细胞或器官上未系统表达的分子。第三抗原优选是，例如，肿瘤细胞特异性抗原，并且还包括与细胞的恶性改变相关联表达的抗原，以及在细胞恶性转化期间在细胞表面或蛋白质分子上出现的异常糖链。其具体实例包括ALK受体(多营养因子受体)、多营养因子、KS 1/4胰脏癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸性磷酸、前列腺特异性抗原(PSA)、黑色素瘤相关抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺特异性膜抗原、癌胚抗原(CEA)、多形上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、结肠直肠肿瘤相关抗原(例如CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1和LEA)、伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13、CD19、人B淋巴瘤抗原-CD20、CD33、黑色素瘤特异性抗原(例如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3)、肿瘤特异性移植抗原(TSTA)、T抗原、病毒诱导的肿瘤抗原(DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原)、结肠的CEA、癌胎儿抗原甲胎蛋白(癌胎儿滋养层糖蛋白5T4和癌胎儿膀胱肿瘤抗原)、分化抗原(人肺癌抗原L6和L20)、纤维肉瘤抗原、人T细胞白血病相关抗原-Gp37、新生糖蛋白、鞘脂、乳癌抗原(例如EGFR(上皮生长因子受体))、NY-BR-16、NY-BR-16和HER2抗原(p185HER2)、多形上皮粘蛋白(PEM)、恶性人淋巴细胞抗原-APO-1、分化抗原，如胎儿红细胞中发现的I抗原、成人红细胞中发现的原代内胚层I抗原、移植前的胚胎或胃癌中发现的I(Ma)、乳腺上皮中发现的M18、M39、骨髓细胞中发现的SSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、结肠直肠癌中发现的D156-22、TRA-1-85(血液群H)、睾丸和卵巢癌中发现的SCP-1、结肠癌中发现的C14、肺癌中发现的F3、胃癌中发现的AH6、Y半抗原、胚性癌细胞中发现的Ley、TL5(血液群A)、A431细胞中发现的EGF受体、胰癌中发现的E1系列(血液群B)、胚性癌细胞中发现的FC10.2、胃癌抗原、腺癌中发现的CO-514(血液群Lea)、腺癌中发现的NS-10、CO-43(血液群Leb)、A431细胞EGF受体中发现的G49、结肠癌中发现的MH2(血液群ALeb/Ley)、结肠癌中发现的19.9、胃癌粘蛋白、骨髓细胞中发现的T5A7、黑色素瘤中发现的R24、胚性癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、和M1:22:25:8以及4～8细胞阶段的胚中发现的SSEA-3和SSEA-4、皮肤T细胞淋巴瘤相关抗原、MART-1抗原、唾液酸Tn(STn)抗原、结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变体A、腺癌抗原ART1、副肿瘤性相关脑-睾丸癌抗原(癌神经元抗原MA2和副肿瘤性神经元抗原)、神经癌腹部抗原2(NOVA2)、血液细胞癌抗原基因520、肿瘤相关抗原CO-029、肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b和MAGE-X2、癌睾丸抗原(NY-EOS-1)、YKL-40和这些多肽的任意片段或其修饰的结构等(上述的修饰的磷酸基、糖链等)、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、唾液酸SSEA-1(SLX)、HER2、PSMA、CEA和CLEC12A。

本文中的术语“CD137”，也称为4-1BB，是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。属于TNF超家族或TNF受体超家族的因子的实例包括CD137、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR和GITRL。

一方面，本发明的抗原结合分子具有选自由以下(1)至(4)组成的组中的至少一种特征：

(1)可变区与包含氨基酸序列SEQ ID NO：159的CD3ε(ε)的细胞外结构域结合，

(2)所述抗原结合分子对CD137具有激动活性；和

(3)所述抗原结合分子诱导T细胞针对表达所述第三抗原的分子的细胞的CD3活化，但不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的活化；

(4)在不存在表达所述第三抗原的分子的细胞的情况下，所述抗原结合分子不诱导从PBMC的细胞因子释放；

一方面，本发明的抗原结合分子具有选自由以下(1)至(4)组成的组中的至少一种特征：

(1)可变区与包含氨基酸序列SEQ ID NO：159的CD3ε(ε)的细胞外结构域结合，

(2)所述抗原结合分子对CD137具有激动活性；和

(3)所述抗原结合分子诱导T细胞针对表达所述第三抗原的分子的细胞的细胞毒性，但不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的活性；

(4)在不存在表达所述第三抗原的分子的细胞的情况下，所述抗原结合分子不诱导从PBMC的细胞因子释放；

在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子具有选自由以下(1)至(2)组成的组中的至少一种特征：

(1)所述抗原结合分子不与CD137配体竞争与CD137的结合，和

(2)所述抗原结合分子诱导T细胞针对表达所述第三抗原的分子的细胞的细胞毒性，但不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的细胞毒性。

一方面，本发明的“CD137激动剂抗体”或“对CD137具有激动活性的抗原结合分子”是指当添加到表达CD137的细胞，组织或活体中时，将表达CD137的细胞活化至少约5％，特别地至少约10％，或更特别地至少约15％的抗体或抗原结合分子，其中0％活化是表达CD137的非活化细胞的背景水平(例如IL6分泌等)。在各种具体实例中，用作本发明药物组合物的CD137激动剂抗体可以将细胞活性激活至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、750％或1000％。

一方面，本发明的“CD137激动剂抗体”或“对CD137具有激动活性的抗原结合分子”还指当添加到表达CD137的细胞，组织或生物体中时，将表达CD137的细胞活化至少约5％，特别地至少约10％，或更特别地至少约15％的抗体或抗原结合分子，其中100％活化是在生理条件下等摩尔量的结合伙伴所达到的活化水平。在各种具体实例中，用作本发明药物组合物的CD137激动剂抗体可以将细胞活性激活至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、750％或1000％。在一些实施方案中，本文使用的“结合伙伴”是已知与CD137结合并诱导表达CD137的细胞活化的分子。在进一步的实施方案中，结合伙伴的实例包括描述于WO2005/035584A1的Urelumab(CAS登记号934823-49-1)及其变体，描述于WO2012/032433A1的Utomilumab(CAS登记号1417318-27-4)及其变体，以及各种已知的CD137激动剂抗体。在某些实施方案中，结合伙伴的实例包括CD137配体。在进一步的实施方案中，可以通过使用ELISA表征IL6分泌来确定抗CD137激动剂抗体对表达CD137的细胞的活化(参见，例如，本文的参考实施例5-2)。用作结合伙伴的抗CD137抗体和用于测量的抗体浓度可以参照参考实施例5-2，其中100％活化是抗体达到的活化水平。在进一步的实施方案中，包含SEQID NO：142的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：144的轻链氨基酸序列的抗体可以以30微克/毫升的浓度作为结合伙伴用于测量(参见，例如，本文的参考实施例5-2)。在一些实施方案中，抗CD137激动剂抗体对表达CD137的细胞的活化可以例如使用响应CD137信号传导而表达报告基因(例如萤光素酶)的重组T细胞，并检测报告基因的表达或报告基因产物的活性作为T细胞活化的指标来确定。当将响应CD137信号传导而表达报告基因的重组T细胞与抗原结合分子共培养时，如果报告基因的表达或报告基因产物的活性高于阴性对照10％，20％，30％，40％，50％，90％，100％或以上，则确定抗原结合分子可诱导T细胞针对表达CD137的细胞的活化(参见，例如，本文的实施例2.2)。

作为非限制性实施方案，本发明提供了包含Fc区的“CD137激动剂抗体”，其中所述Fc区对抑制性Fcγ受体具有增强的结合活性。

作为非限制性实施方案，可以使用已知在其表面表达CD137的B细胞来确认CD137激动活性。作为非限制性实施方案，HDLM-2B细胞系可以用作B细胞。CD137激动活性可以通过产生的人白介素6(IL-6)的量来评估，因为IL-6的表达是作为CD137活化的结果而被诱导。在该评估中，可以通过使用来自非活化B细胞的IL-6的量作为0％背景水平来评估IL-6表达的增加量，从而确定被评估分子具有的CD137激动活性的百分比的多少。

在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子诱导T细胞针对表达第三抗原分子的细胞的CD3活化，但不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的CD3活化。抗原结合分子是否诱导T细胞针对表达第三抗原的细胞的CD3活化，可以通过例如在抗原结合分子存在下将T细胞与表达第三抗原的细胞共培养并测定T细胞的CD3活化来确定。T细胞活化可以例如通过使用响应CD137信号传导而表达报告基因(例如萤光素酶)的重组T细胞，并检测报告基因的表达或报告基因产物的活性作为T细胞活化的指标来确定。当将响应CD3信号传导而表达报道基因的重组的T细胞在抗原结合分子存在的情况下与表达第三抗原的细胞共培养时，以依赖于抗原结合分子的剂量的方式对报告基因的表达或报告基因产物的活性的检测表明，该抗原结合分子诱导T细胞针对表达第三抗原的细胞的活化。类似地，抗原结合分子是否不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的CD3活化，可以通过例如在抗原结合分子存在的情况下将T细胞与表达CD137的细胞共培养并如上所述测定T细胞的CD3活化来确定。当将响应CD3信号传导而表达报告基因的重组T细胞与表达CD137的细胞在抗原结合分子存在的情况下共培养时，如果报告基因的表达或报告基因产物的活性不存在，或低于检测限或低于阴性对照时，则确定抗原结合分子不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的活化。一方面，当在存在抗原结合分子的情况下将表达响应CD3信号传导的报告基因的重组T细胞与表达CD137的细胞共培养时，如果报告基因的表达或报告基因产物的活性至多为约50％、30％、20％、10％、5％或1％，则确定抗原结合分子不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的活化，其中100％活化是由同时结合CD3和CD137的抗原结合分子所达到的活化水平。一方面，当在存在抗原结合分子的情况下将响应CD3信号传导表达报告基因的重组T细胞与表达CD137的细胞共培养时，如果报告基因的表达或报告基因产物的活性至多为约50％、30％、20％、10％、5％或1％，则确定抗原结合分子不诱导T细胞针对表达CD137的细胞的活化，其中100％活化是由针对表达第三抗原分子的细胞的相同抗原结合分子所达到的活化水平。

在一些实施方案中，在不存在表达所述第三抗原分子的细胞的情况下，本发明的抗原结合分子不诱导从PBMC的细胞因子释放。在不存在表达第三抗原分子的细胞的情况下，抗原结合分子是否不诱导细胞因子的释放可以通过例如将PBMC与抗原结合分子在不存在表达第三抗原分子的细胞的情况下一起温育，并使用本领域已知的方法测量从PBMC释放到培养上清液中的细胞因子如IL-2、IFNγ和TNFα来确定。如果在不存在表达第三抗原的细胞的情况下，已与抗原结合分子一起孵育的PBMC的培养上清液中未检测到显著水平的细胞因子或未出现细胞因子表达的显著诱导，则确定在不存在表达第三抗原的细胞的情况下抗原结合分子不诱导从PBMC的细胞因子释放。一方面，“无显著水平的细胞因子”也指约至多50％、30％、20％、10％、5％或1％的细胞因子浓度水平，其中100％是同时结合CD3和CD137的抗原结合分子所达到的细胞因子浓度。一方面，“无显著水平的细胞因子”也指约至多50％、30％、20％、10％、5％或1％的细胞因子浓度水平，其中100％是在存在表达第三抗原分子的细胞的情况下所达到的细胞因子浓度。在一方面，“未显著诱导细胞因子表达”也指细胞因子浓度增加的水平，其是添加抗原结合分子之前每种细胞因子浓度的至多5倍、2倍或1倍。

在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子与选自由以下组成的组中的抗体竞争与CD137的结合，或与CD137上的相同表位结合：

(a1)包含与SEQ ID NO:16有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:30有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:44有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a2)包含与SEQ ID NO:17有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:31有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:45有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:64有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:69有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:74有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a3)包含与SEQ ID NO:18有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:32有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:46有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a4)包含与SEQ ID NO:19有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:33有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:47有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a5)包含与SEQ ID NO:19有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:33有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:47有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:65有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:70有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:75有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a6)包含与SEQ ID NO:20有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:34有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:48有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a7)包含与SEQ ID NO:22有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:36有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:50有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a8)包含与SEQ ID NO:23有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:37有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:51有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a9)包含与SEQ ID NO:23有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:37有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:51有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:66有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:71有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:76有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a10)包含与SEQ ID NO:24有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:38有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:52有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a11)包含与SEQ ID NO:25有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:39有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:53有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:66有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:71有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:76有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a12)包含与SEQ ID NO:26有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:40有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:54有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:66有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:71有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:76有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a13)包含与SEQ ID NO:26有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:40有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:54有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a14)包含与SEQ ID NO:27有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:41有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:55有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(a15)包含与SEQ ID NO:28有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含与SEQ ID NO:42有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)，包含与SEQ ID NO:56有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，包含与SEQ ID NO:63有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含与SEQ ID NO:68有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)，以及包含与SEQ ID NO:73有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)；

(b1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:64的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:74的LCDR3；

(b3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:65的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:75的LCDR3；

(b6)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b7)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:50的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b8)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b9)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:66的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:71的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的LCDR3；

(b10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:66的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:71的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的LCDR3；

(b12)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:66的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:71的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的LCDR3；

(b13)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b14)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(b15)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的HCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HCDR2，包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的HCDR3，包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的LCDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的LCDR3；

(c1)包含与SEQ ID NO:2有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c2)包含与SEQ ID NO:3有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:59有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c3)包含与SEQ ID NO:4有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c4)包含与SEQ ID NO:5有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c5)包含与SEQ ID NO:5有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:60有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c6)包含与SEQ ID NO:6有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c7)包含与SEQ ID NO:8有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c8)包含与SEQ ID NO:9有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c9)包含与SEQ ID NO:9有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:61有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c10)包含与SEQ ID NO:10有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c11)包含与SEQ ID NO:11有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:61有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c12)包含与SEQ ID NO:12有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:61有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c13)包含与SEQ ID NO:12有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c14)包含与SEQ ID NO:13有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(c15)包含与SEQ ID NO:14有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，以及包含与SEQ ID NO:58有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

(d1)SEQ ID NO:2的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d2)SEQ ID NO:3的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:59的轻链可变结构域(VL)；

(d3)SEQ ID NO:4的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d4)SEQ ID NO:5的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d5)SEQ ID NO:5的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:60的轻链可变结构域(VL)；

(d6)SEQ ID NO:6的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d7)SEQ ID NO:8的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d8)SEQ ID NO:9的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d9)SEQ ID NO:9的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:61的轻链可变结构域(VL)；

(d10)SEQ ID NO:10的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d11)SEQ ID NO:11的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:61的轻链可变结构域(VL)；

(d12)SEQ ID NO:12的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:61的轻链可变结构域(VL)；

(d13)SEQ ID NO:12的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d14)SEQ ID NO:13的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

(d15)SEQ ID NO:14的重链可变结构域(VH),和SEQ ID NO:58的轻链可变结构域(VL)；

可以基于两种抗体对同一表位的竞争来评估测试抗体是否与某种抗体具有共同的表位。抗体之间的竞争可以通过交叉阻断测定法等来检测。例如，竞争性ELISA测定法是优选的交叉阻断测定法。具体地，在交叉阻断测定法中，在存在或不存在候选竞争抗体的情况下，将用于包被微量滴定板的孔的CD137蛋白预温育，然后向其中添加本发明的抗CD137抗体。孔中与CD137蛋白结合的本发明的抗CD137抗体的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗体(测试抗体)的结合能力间接相关。即，测试抗体对相同表位的亲和力越大，结合到CD137蛋白包被的孔上的本发明的抗CD137抗体的量越少，并且结合到CD137蛋白包被的孔上的测试抗体的量越多。

通过预先标记抗体，可以容易地确定结合到孔的抗体的量。例如，可以使用抗生物素蛋白/过氧化物酶缀合物和适当的底物来测量生物素标记的抗体。特别地，使用酶标记物例如过氧化物酶的交叉阻断测定法称为“竞争性ELISA测定法”。可以用能够进行检测或测量的其他标记物质标记抗体。具体地，放射性标记，荧光标记等是已知的。

此外，当测试抗体具有源自不同于本发明的抗CD137抗体的种类的恒定区时，可以通过使用识别抗体的恒定区的标记抗体来测量结合至孔的抗体的量。或者，如果抗体源自相同种类但属于不同类别，则可以使用区分各个类别的抗体来测量结合至孔的抗体的量。

与在不存在候选竞争性抗体的情况下进行的对照实验中获得的结合活性相比，如果候选抗体能阻断抗CD137抗体的结合至少20％，优选至少20％至50％，甚至更优选至少50％，则候选竞争性抗体是与本发明的抗CD137抗体基本上结合相同表位的抗体或竞争结合相同表位的抗体。

在另一个实施方案中，本领域技术人员可以使用本领域已知的标准结合测定法例如BIAcore分析或流式细胞术来适当地确定测试抗体与另一种抗体竞争或交叉竞争结合的能力。

确定表位的空间构象的方法包括，例如，X射线晶体学和二维核磁共振(参见,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,G.E.Morris(ed.),Vol.66(1996))。

还可以基于测试抗体和CD137配体之间针对相同表位的竞争来评估测试抗体是否与CD137配体具有共同的表位。抗体和CD137配体之间的竞争可以通过如上所述的交叉阻断测定法等来检测。在另一个实施方案中，本领域技术人员可以使用本领域已知的标准结合测定法例如BIAcore分析或流式细胞术来适当地确定测试抗体与CD137配体竞争或交叉竞争结合的能力。

在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子的有利实例包括结合与人CD137表位相同的表位的抗原结合分子，所述人CD137表位被选自由以下抗体组成的组中的抗体结合：

识别包含SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC序列(SEQ ID NO:154)的区域的抗体，

识别包含DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC序列(SEQ ID NO:149)的区域的抗体，

识别包含LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC序列(SEQ ID NO:152)的区域的抗体，和

识别人CD137蛋白中包含LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC序列(SEQ ID NO:147)的区域的抗体。

根据所靶向的癌症抗原，本领域技术人员可以适当地选择与癌症抗原结合的重链可变区序列和轻链可变区序列，以用于包含在癌症特异性抗原结合结构域中的重链可变区和轻链可变区。当在多种不同的抗原中包含由抗原结合结构域结合的表位时，含有抗原结合结构域的抗原结合分子可以与具有该表位的各种抗原结合。

“表位”是指抗原中的抗原决定簇，是指本文公开的抗原结合分子中的各种结合结构域结合的抗原位点。因此，例如，可以根据其结构来定义表位。或者，可以根据识别表位的抗原结合分子的抗原结合活性来定义表位。当抗原是肽或多肽时，表位可以由形成表位的氨基酸残基指定。或者，当表位是糖链时，表位可由其特定的糖链结构确定。

线性表位是这样一种表位，该表位包含其一级氨基酸序列被识别的表位。这样的线性表位通常在其特定序列中包含至少三个，最通常至少五个，例如约8至10个或6至20个氨基酸。

与线性表位相反，“构象表位”是这样一种表位，其中包含该表位的一级氨基酸序列不是被识别表位的唯一决定簇(例如，构象表位的一级氨基酸序列不一定被定义表位的抗体识别)。与线性表位相比，构象表位可以包含更多数量的氨基酸。识别构象表位的抗体识别肽或蛋白质的三维结构。例如，当蛋白质分子折叠并形成三维结构时，形成构象表位的氨基酸和/或多肽主链变得对齐，并且该表位可被抗体识别。确定表位构象的方法包括，例如，X射线晶体学，二维核磁共振光谱，位点特异性自旋标记和电子顺磁共振光谱，但不限于此。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996),Vol.66,Morris(ed.)。

下面显示了通过测试抗原结合分子评估癌症特异性抗原中的表位结合的方法的实例。根据以下实施例，还可以通过另一结合结构域适当地进行评估靶抗原中的表位的结合的方法。

例如，对于如下所述实例，例如可以确认包含针对癌症特异性抗原的抗原结合结构域的测试抗原结合分子是否识别抗原分子中的线性表位。例如，出于上述目的，合成了包含形成癌症特异性抗原的细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。所述肽可以化学合成，或通过基因工程技术使用癌症特异性抗原的cDNA中编码对应于细胞外结构域的氨基酸序列的区域来获得。然后，评估含有针对癌症特异性抗原的抗原结合结构域的测试抗原结合分子对包含组成细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽的结合活性。例如，固定化的线性肽可以用作抗原，以通过ELISA评估抗原结合分子对肽的结合活性。或者，可以基于线性肽抑制抗原结合分子与癌症特异性抗原表达细胞结合的水平来评估对线性肽的结合活性。通过这些试验可以证明抗原结合分子对线性肽的结合活性。

可以如下确定上述包含针对抗原的抗原结合结构域的测试抗原结合分子是否识别构象表位。例如，包含针对癌症特异性抗原的抗原结合结构域的抗原结合分子在接触时牢固结合表达癌症特异性抗原的细胞，但基本上不结合包含形成癌症特异性抗原的细胞外结构域的氨基酸序列的固定线性肽。在此，“基本上不结合”是指通过使用抗原表达细胞作为抗原，通过ELISA或荧光激活细胞分选(FACS)，与表达抗原的细胞的结合活性相比，结合活性为80％以下，通常为50％以下，优选为30％以下，特别优选为15％以下。

在ELISA形式中，可以通过比较酶促反应产生的信号水平来定量评估包含抗原结合结构域的测试抗原结合分子对表达抗原的细胞的结合活性。具体地，将测试抗原结合分子添加至固定有表达抗原的细胞的ELISA板。然后，使用识别测试抗原结合分子的酶标记抗体检测与细胞结合的测试抗原结合分子。或者，当使用FACS时，制备一系列测试抗原结合分子的稀释液，并且可以确定针对表达抗原的细胞的抗体结合效价，以比较测试抗原结合分子对表达抗原的细胞的结合活性。

可以使用流式细胞仪检测测试抗原结合分子与悬浮在缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合。已知的流式细胞仪包括，例如，以下设备：

FACSCanto

FACSAria

FACSArray

FACSVantage

FACSCalibur

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter的商品名)。

用于分析上述包含抗原结合结构域的测试抗原结合分子对抗原的结合活性的合适方法包括例如以下方法。首先，使表达抗原的细胞与测试抗原结合分子反应，然后使用FACSCalibur(BD)将其用FITC标记的第二抗体染色。通过使用CELL QUEST软件(BD)进行分析获得的荧光强度，即几何平均值，反映了与细胞结合的抗体的量。即，可以通过测定几何平均值来测量由结合的测试抗原结合分子的量表示的测试抗原结合分子的结合活性。

可以基于两个分子对同一表位的竞争来评估包含本发明的抗原结合结构域的测试抗原结合分子是否与另一抗原结合分子具有共同的表位。抗原结合分子之间的竞争可以通过交叉阻断测定法等来检测。例如，竞争性ELISA测定法是优选的交叉阻断测定法。

具体地，在交叉阻断测定法中，在存在或不存在候选竞争者抗原结合分子的情况下,将包被微量滴定板的孔的抗原预温育，然后向其添加测试抗原结合分子。孔中与抗原结合的测试抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和力越大，测试抗原结合分子对抗原包被孔的结合活性越低。

通过抗原与孔结合的测试抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子而容易地测定。例如，可以使用抗生物素蛋白/过氧化物酶缀合物和适当的底物来测量生物素标记的抗原结合分子。特别地，使用酶标记物例如过氧化物酶的交叉阻断测定法称为“竞争性ELISA测定法”。还可以用能够进行检测或测量的其他标记物质标记抗原结合分子。具体地，放射性标记，荧光标记等是已知的。

与在竞争者抗原结合分子不存在的情况下进行的对照实验中的结合活性相比，当候选竞争抗原结合分子可以阻断包含抗原结合结构域的测试抗原结合分子的结合至少20％，优选至少20至50％，并且更优选至少50％时，则确定测试抗原结合分子基本上与竞争抗原结合分子结合相同表位结合，或竞争与相同表位的结合。

当已经鉴定了由包含本发明的抗原结合结构域的测试抗原结合分子结合的表位的结构时，可以通过比较两个抗原结合分子对通过将氨基酸突变引入形成表位的肽中而制备的肽的结合活性来评估测试和对照抗原结合分子是否具有共同的表位。

作为用于测量这种结合活性的方法，例如，通过以上述ELISA形式进行比较，可以测量测试和对照抗原结合分子对引入了突变的线性肽的结合活性。除了ELISA方法外，还可以通过使测试和对照抗原结合分子通过柱，然后定量洗脱液中洗脱的抗原结合分子，来测定针对与柱结合的突变肽的结合活性。已知例如以GST融合肽形式将突变体肽吸附到柱上的方法。

或者，当所鉴定的表位是构象表位时，可以通过以下方法评估测试和对照抗原结合分子是否具有共同的表位。首先，制备表达抗原结合结构域靶向的抗原的细胞和表达具有引入了突变的表位的抗原的细胞。将测试和对照抗原结合分子添加到通过将这些细胞悬浮在合适的缓冲液例如PBS中而制备的细胞悬浮液中。然后，用缓冲液适当洗涤细胞悬浮液，并向其中添加可以识别测试和对照抗原结合分子的FITC标记的抗体。使用FACSCalibur(BD)测定荧光强度和被标记抗体染色的细胞数量。使用合适的缓冲液适当稀释测试和对照抗原结合分子，并以所需浓度使用。例如，它们可以以10μg/ml至10ng/ml的浓度使用。通过使用CELL QUEST软件(BD)进行分析而测定的荧光强度，即几何平均值，反映了与细胞结合的标记抗体的量。即，可以通过测定几何平均值来测量由结合的标记抗体的量表示的测试和对照抗原结合分子的结合活性。

在一些实施方案中,本发明的抗原结合分子包含:

(a)重链可变结构域氨基酸序列，其在以下每个位置(均通过Kabat编号)包含针对该位置指示的一个或更多个以下氨基酸残基：

在氨基酸位置26的A、D、E、I、G、K、L、M、N、R、T、W或Y；

在氨基酸位置27的D、F、G、I、M或L；

在氨基酸位置28的D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置29的F或W；

在氨基酸位置30的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置31的F、I、N、R、S、T或V；

在氨基酸位置32的A、H、I、K、L、N、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置33的W；

在氨基酸位置34的F、I、L、M或V；

在氨基酸位置35的F、H、S、T、V或Y；

在氨基酸位置50的E、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、W或Y；

在氨基酸位置51的I、K或V；

在氨基酸位置52的K、M、R或T；

在氨基酸位置52b的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；

在氨基酸位置52c的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置53的A、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置54的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置55的E、F、G、H、L、M、N、Q、W或Y；

在氨基酸位置56的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置57的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置58的A、F、H、K、N、P、R或Y；

在氨基酸位置59的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置60的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置61的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置62的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置63的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置64的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置65的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置93的H或R；

在氨基酸位置94的F、G、H、L、M、S、T、V或Y；

在氨基酸位置95的I或V；

在氨基酸位置96的F、H、I、K、L、M、T、V、W或Y；

在氨基酸位置97的F、Y或W；

在氨基酸位置98的A、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置99的A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100a的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100b的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100c的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100d的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100e的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100f的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100g的A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置100h的A、D、E、G、H、I、L、M、N、P、S、T或V；

在氨基酸位置100i的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置101的A、D、F、I、L、M、N、Q、S、T或V；

在氨基酸位置102的A、D、E、F、G、H、IK、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

和/或

(b)轻链可变结构域氨基酸序列，其在以下每个位置(均通过Kabat编号)包含针对该位置指示的一个或更多个以下氨基酸残基：

在氨基酸位置24的A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置25的A、G、N、P、S、T或V；

在氨基酸位置26的A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置27的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27a的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27b的A、I、L、M、P、T或V；

在氨基酸位置27c的A、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；

在氨基酸位置27d的A、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置27e的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置28的G、N、S或T；

在氨基酸位置29的A、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、W或Y；

在氨基酸位置30的A、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W或Y；

在氨基酸位置31的I、L、Q、S、T或V；

在氨基酸位置32的F、W或Y；

在氨基酸位置33的A、F、H、L、M、Q或V；

在氨基酸位置34的A、H或S；

在氨基酸位置50的I、K、L、M或R；

在氨基酸位置51的A、E、I、K、L、M、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置52的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置53的A、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；

在氨基酸位置54的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置55的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；

在氨基酸位置56的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置89的A、G、K、S或Y；

在氨基酸位置90的Q；

在氨基酸位置91的G；

在氨基酸位置92的A、D、H、K、N、Q、R、S或T；

在氨基酸位置93的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；

在氨基酸位置94的A、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T或V；

在氨基酸位置95的P；

在氨基酸位置96的F或Y；

在氨基酸位置97的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T或V。

本发明的抗原结合分子可以通过本领域技术人员通常已知的方法来制备。例如，可以通过以下给出的方法来制备抗体，尽管用于制备本发明的抗体的方法不限于此。通过将编码多肽的分离的基因转移到合适的宿主中，用于制备抗体的宿主细胞和表达载体的许多组合是本领域已知的。所有这些表达系统都可以应用于本发明的抗原结合分子的分离。在使用真核细胞作为宿主细胞的情况下，可以适当地使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体地，动物细胞的实例可包括以下细胞：

(1)哺乳动物细胞，例如CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)，COS(猴肾细胞系)，骨髓瘤细胞(Sp2/O，NS0等)，BHK(幼仓鼠肾细胞系)，HEK293(带有剪切的腺病毒(Ad)5DNA的人类胚胎肾细胞系)，PER.C6细胞(用5型腺病毒(Ad5)E1A和E1B基因转化的人类胚胎视网膜细胞系)，Hela和Vero(Current Protocols in Protein Science(May,2001,Unit 5.9,表5.9.1))；

(2)两栖动物细胞，如非洲爪蟾卵母细胞；和

(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21和Tn5。

也可以使用大肠杆菌(mAbs 2012 Mar-Apr；4(2)：217-225)或酵母(WO2000023579)制备抗体。使用大肠杆菌制备的抗体未糖基化。另一方面，使用酵母制备的抗体被糖基化。

表达了编码抗体重链的DNA和编码抗体轻链的DNA，该编码抗体重链的DNA编码可变结构域中的一个或更多个氨基酸残基被不同目的氨基酸取代的重链。例如，通过获得用本领域已知方法针对特定抗原制备的编码抗体可变结构域的DNA，并适当地引入取代，使得编码结构域中特定氨基酸的密码子编码不同的目的氨基酸，可以得到具有编码可变结构域中的一个或更多个氨基酸残基被不同的目的氨基酸取代的重链或轻链的DNA。

或者，可以预先设计编码蛋白的DNA，该蛋白中通过本领域已知的方法针对特定抗原制备的抗体可变结构域中的一个或更多个氨基酸残基被不同的目的氨基酸取代，并且该DNA可以化学合成以获得编码重链的DNA，该重链中可变结构域中的一个或更多个氨基酸残基被不同的目的氨基酸取代。氨基酸取代位点和取代类型没有特别限制。优选用于氨基酸改变的区域的实例包括可变区中的溶剂暴露区和环。其中，优选CDR1、CDR2、CDR3、FR3和环。具体而言，优选H链可变结构域中的Kabat编号位置31至35、50至65、71至74和95至102，以及L链可变结构域中的Kabat编号位置24至34、50至56和89至97。更优选H链可变结构域中的Kabat编号位置31、52a至61、71至74，和97至101，L链可变结构域中的Kabat编号位置24至34、51至56，和89至96。

氨基酸改变不限于取代，并且可以是缺失、添加、插入或修饰或其组合。

编码重链的DNA也可以作为单独的部分DNA来制备，该重链的可变结构域中的一个或更多个氨基酸残基被不同的目的氨基酸取代。部分DNA的组合的实例包括但不限于：编码可变结构域的DNA和编码恒定结构域的DNA；编码Fab结构域的DNA和编码Fc结构域的DNA。同样，编码轻链的DNA也可以作为单独的部分DNA来制备。

这些DNA可以通过以下方法表达：例如，将编码重链可变结构域的DNA与编码重链恒定结构域的DNA整合到表达载体中以构建重链表达载体。同样，将编码轻链可变结构域的DNA与编码轻链恒定结构域的DNA整合到表达载体中以构建轻链表达载体。这些重链和轻链基因可以整合到单个载体中。

将编码目的抗体的DNA整合到表达载体中，以便在表达控制区例如增强子和启动子的控制下表达。接下来，用所得表达载体转化宿主细胞，并允许其表达抗体。在这种情况下，可以组合使用适当的宿主和表达载体。

载体的实例包括M13系列载体，pUC系列载体，pBR322，pBluescript和pCR-Script。除了这些载体之外，例如，pGEM-T，pDIRECT或pT7也可以用于cDNA亚克隆和切除的目的。

特别地，表达载体可用于将载体用于制备本发明抗体的目的。例如，当宿主是大肠杆菌，例如JM109，DH5 alpha，HB101或XL1-Blue时，表达载体必不可少地具有允许在大肠杆菌中高效表达的启动子，例如lacZ启动子(Ward等人，Nature(1989，341，544-546；和FASEBJ.(1992)6，2422-2427，其通过引用整体并入本文)，araB启动子(Better等人，Science(1988)240，1041-1043，其通过引用整体并入本文)，或T7启动子。这样的载体的实例包括上述载体以及pGEX-5X-1(由Pharmacia制造)，“QIAexpress系统”(由Qiagen NV制造)，pEGFP，和pET(在这种情况下，宿主优选是表达T7 RNA聚合酶的BL21)。

载体可包含用于多肽分泌的信号序列。在大肠杆菌的周质中产生的情况下，可以使用pelB信号序列(Lei，SP等人，J.Bacteriol.(1987)169，4397，其通过引用整体并入本文)作为多肽分泌的信号序列。可以通过使用例如脂质转染法，磷酸钙法或DEAE-葡聚糖法将载体转移至宿主细胞。

除了用于大肠杆菌的表达载体以外，用于产生本发明的多肽的载体的实例包括哺乳动物来源的表达载体(例如，pcDNA3(由Invitrogen Corp.制造)，pEGF-BOS(NucleicAcids.Res.1990,18(17),p.5322,其通过引用整体并入本文)，pEF和pCDM8)，昆虫细胞来源的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(由GIBCO BRL制造)和pBacPAK8)，植物来源的表达载体(例如pMH1和pMH2)，动物病毒来源的表达载体(例如pHSV，pMV和pAdexLcw)，逆转录病毒来源的表达载体(例如pZIPneo)，酵母来源的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒”(由Invitrogen Corp.制造)，pNV11和SP-Q01)和枯草芽孢杆菌来源的表达载体(例如pPL608和pKTH50)。

为了在动物细胞如CHO细胞，COS细胞，NIH3T3细胞或HEK293细胞中表达，载体必不可少地具有细胞内表达所需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人，Nature(1979)277，108，其通过引用整体并入本文)，MMTV-LTR启动子，EF1α启动子(Mizushima等人，NucleicAcids Res.(1990)18，5322，其通过引用整体并入本文)，CAG启动子(Gene.(1991)108，193，其通过引用整体并入本文)或CMV启动子，并且更优选具有用于筛选转化细胞的基因(例如，抗药性基因，其可以作为药物(新霉素，G418等)的标志物)。具有这种性质的载体的实例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。另外，为了增加基因拷贝数，可以将EBNA1蛋白与其共表达。在这种情况下，使用具有复制起点OriP的载体(Biotechnol Bioeng.2001Oct 20；75(2):197-203；and Biotechnol Bioeng.2005 Sep 20；91(6):670-7)。

旨在稳定表达基因并增加细胞内基因拷贝数的示例性方法涉及用具有DHFR基因作为其互补物的载体(例如pCHOI)转化核酸合成途径缺陷的CHO细胞并在基因扩增中使用甲氨蝶呤(MTX)。旨在瞬时表达基因的示例性方法涉及使用在其染色体上具有SV40T抗原基因的COS细胞以用具有SV40复制起点的载体(pcD等)转化细胞。也可以使用源自多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。为了增加宿主细胞系统中基因拷贝的数量，表达载体可以包含选择性标记，例如氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因，胸苷激酶(TK)基因，大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因或二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。

可以例如通过培养转化的细胞然后从分子转化的细胞内或其培养液中分离抗体来回收抗体。可以通过适当地组合使用以下方法来分离和纯化抗体：例如离心、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、Clq、FcRn、蛋白A和蛋白G柱、亲和层析法、离子交换层析法和凝胶过滤层析法。

上面提到的技术，例如旋钮入孔技术(WO1996/027011；Ridgway JB等人，ProteinEngineering(1996)9，617-621；和Merchant AM等人，Nature Biotechnology(1998)16，677-681)或通过引入电荷排斥来抑制H链之间不期望的缔合的技术(WO2006/106905)，可以应用于有效制备多特异性抗体的方法。

本发明进一步提供了一种制备本发明的抗原结合分子的方法，特别是提供了一种制备抗原结合分子的方法，该抗原结合分子包含：能够结合两种不同抗原(第一抗原和第二抗原)，但不同时结合CD3和CD137的抗体可变区(此可变区称为第一可变区)；以及结合不同于CD3和CD137的第三抗原的可变区(该可变区称为第二可变区)，该方法包括制备包含第一可变区的不同氨基酸序列的抗原结合分子文库的步骤。

其实例可以包括包含以下步骤的制备方法：

(i)制备各自结合CD3或CD137的在抗体可变区中的至少一个氨基酸被改变的抗原结合分子文库，其中改变后的可变区在至少一个氨基酸上彼此不同；

(ii)从制备的文库中选择抗原结合分子，该抗原结合分子包含对CD3和CD137具有结合活性但不同时结合CD3和CD137的可变区；

(iii)培养包含编码在步骤(ii)中选择的抗原结合分子的可变区的核酸和编码结合第三抗原的抗原结合分子的可变区的核酸的宿主细胞，以表达包含能够结合CD3和CD137，但不同时结合CD3和CD137的抗体可变区和结合第三抗原的可变区的抗原结合分子；和

(iv)从宿主细胞培养物中回收抗原结合分子。

在该制备方法中，步骤(ii)可以为以下选择步骤：

(v)从制备的文库中选择包含可变区的抗原结合分子，该可变区具有针对CD3和CD137的结合活性，但不同时结合各自在不同细胞上表达的CD3和CD137。

步骤(i)中使用的抗原结合分子没有特别限制，只要这些分子各自包含抗体可变区即可。抗原结合分子可以是抗体片段，例如Fv、Fab或Fab’，或者可以是含有Fc区的抗体。

在结合CD3或CD137的抗体可变区中，待改变的氨基酸选自例如其改变不会取消与抗原的结合的氨基酸。

在本发明中,可以单独使用一个氨基酸改变，也可以组合使用多个氨基酸改变。

在组合使用多个氨基酸改变的情况下，待组合的改变的数目不受特别限制，并且例如为2个以上且30以下、优选为2个以上且25个以下、2个以上且22个以下、2个以上且20个以下、2个以上且15个以下、2个以上且10个以下、2个以上且5个以下、或2个以上且3个以下。

要组合的多个氨基酸改变可以只加入到抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域，或者也可以适当分布到重链可变结构域和轻链可变结构域二者。

优选用于氨基酸改变的区域的实例包括可变区中的溶剂暴露区和环。其中，优选CDR1、CDR2、CDR3、FR3区和环。具体而言，优选H链可变结构域中的Kabat编号位置31至35、50至65、71至74和95至102，以及L链可变结构域中的Kabat编号位置24至34、50至56和89至97。更优选H链可变结构域中的Kabat编号位置31、52a至61、71至74和97至101，L链可变结构域中的Kabat编号位置24至34、51至56和89至96。

氨基酸残基的改变还包括：在结合CD3或CD137的抗体可变区中上述区域中氨基酸的随机改变；将已知对CD3或CD137具有结合活性的肽插入上述区域。通过从这样改变的抗原结合分子中选择能够结合CD3和CD137但不同时结合这些抗原的可变区，可以获得本发明的抗原结合分子。

可变区是否能够结合CD3和CD137，但不同时结合这些抗原，进一步，当CD3和CD137中任一种驻留在细胞上而另一种抗原单独存在，两种抗原各自单独存在，或者两种抗原都驻留在相同细胞上时，可变区是否能够同时结合CD3和CD137但不能同时结合各自在不同细胞上表达的这些抗原，可以也可以根据上述方法进行确认。

本发明进一步提供了编码本发明的抗原结合分子的核酸。本发明的核酸可以是任何形式，例如DNA或RNA。

本发明进一步提供了包含本发明的核酸的载体。载体的类型可以由本领域技术人员根据接收所述载体的宿主细胞适当地选择。例如，可以使用上述任何载体。

本发明进一步涉及用本发明的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以由本领域技术人员适当地选择。例如，可以使用上述任何宿主细胞。

本发明还提供了包含本发明的抗原结合分子和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的药物组合物可以通过用药学上可接受的载体补充本发明的抗原结合分子来根据本领域已知的方法配制。例如，药物组合物可以以含水的无菌溶液或悬浮液或任何其他药学上可接受的溶液的肠胃外注射液的形式使用。例如，可以将抗原结合分子以通常接受的药物实践所需的单位剂量与药理学上可接受的载体或介质适当组合来配制药物组合物，所述载体或介质特别是无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等。载体的具体实例可包括轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉和无机盐。确定这样的制剂中活性成分的量，使得可以获得在规定范围内合适的剂量。

注射用无菌组合物可以根据常规制药实践使用诸如注射用蒸馏水的载体来配制。注射用水溶液的实例包括生理盐水，含有葡萄糖和其他佐剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠)的等渗溶液。这些溶液可以与适当的增溶剂例如醇(特别是乙醇)或多元醇(例如丙二醇和聚乙二醇)或非离子表面活性剂例如聚山梨酯80(TM)或HCO-50组合使用。

油性溶液的实例包括芝麻油和大豆油。这些溶液可以与作为增溶剂的苯甲酸苄酯或苯甲醇组合使用。溶液可以进一步与缓冲液(例如磷酸盐缓冲溶液和乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如苯甲醇和苯酚)和抗氧化剂混合。如此制备的注射溶液通常装入适当的安瓿中。本发明的药物组合物优选肠胃外施用。其剂型的具体实例包括注射剂、鼻内施用剂，经肺施用剂和经皮施用剂。注射剂的实例包括静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射和皮下注射，通过它们可以全身或局部施用药物组合物。

施用方法可以根据患者的年龄和症状适当地选择。包含多肽或编码该多肽的多核苷酸的药物组合物的剂量可以在每剂量例如0.0001至1000mg/kg体重的范围内选择。或者，剂量可以在例如0.001至100000mg/患者体重的范围内选择，尽管剂量不必限于这些数值。尽管剂量和施用方法根据患者的体重、年龄、症状等而变化，但是本领域技术人员可以适当地选择剂量和方法。

本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其包括施用本发明的抗原结合分子的步骤，用于治疗癌症的本发明的抗原结合分子，本发明的抗原结合分子在制备癌症治疗剂中的用途，以及制备癌症治疗剂的方法，其包括使用本发明的抗原结合分子的步骤。

本文使用的氨基酸的三字母代码和相应的一字母代码定义如下：丙氨酸：Ala和A，精氨酸：Arg和R，天冬酰胺：Asn和N，天冬氨酸：Asp和D，半胱氨酸：Cys和C，谷氨酰胺：Gln和Q，谷氨酸：Glu和E，甘氨酸：Gly和G，组氨酸：His和H，异亮氨酸：Ile和I，亮氨酸：Leu和L，赖氨酸：Lys和K，甲硫氨酸：Met和M，苯丙氨酸：Phe和F，脯氨酸：Pro和P，丝氨酸：Ser和S，苏氨酸：Thr和T，色氨酸：Trp和W，酪氨酸：Tyr和Y，缬氨酸：Val和V。

本领域技术人员应理解，除非基于本领域技术人员的技术常识而产生技术冲突，否则本文描述的这些方面中的一个或两个或更多个方面的任意组合也包括在本发明中。

本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。

参照以下实施例进一步说明本发明。但是，本发明并不试图限于以下的实施例。

实施例

[实施例1]用于改善对肿瘤细胞的体外细胞毒性的源自亲本双Fab H183L072的亲和力成熟变体筛选

1.1亲和力成熟变体的序列

为了增加亲本双Fab H183L072(重链：SEQ ID NO：1；轻链：SEQ ID NO：57)的结合亲和力，使用H183L072作为模板通过在可变区上引入单个或多个突变来生成1，000多种双Fab变体。表达抗体Expi293(Invitrogen)，并通过蛋白质A纯化和随后的凝胶过滤(如果需要进行凝胶过滤的话)进行纯化。在表1.1和1.2中列出了具有多个突变的15个代表的变体的序列，并且在实施例1.2.2中使用下文所述的Biacore T200仪器(GE Healthcare)在25℃和/或37℃下评估了结合动力学。表1.3列出了通过可变区上的单个突变对人CD137和人CD3的亲和力变化的倍数。

[表1.1a]

用于亲和力测量的人CD3和CD137抗原的SEQ ID NO

[表1.1b]

抗体、包括VH、VL以及CDR1，2和3的可变区的名称和SEQ ID NO

[表1.2a]

抗原的氨基酸序列

[表1.2b]

可变区和CDR1,2和3的氨基酸序列

[表1.3a]

重链可变区中单个突变导致的对CD137亲和力的倍数变化

[表1.3b]

轻链可变区中单个突变导致的对CD137亲和力的倍数变化

[表1.3c]

重链可变区中单个突变导致的对CD3亲和力的倍数变化

[表1.3d]

轻链可变区中单个突变导致的对CD3亲和力的倍数变化

在表1.3a至1.3d中，在前两行中示出了根据Kabat编号的突变位置和在各个位置的原始氨基酸。当最左边一栏中显示的每个突变被引入每个位置时，这些值代表亲和力的倍数变化。

1.2.亲和力成熟变体的结合动力学信息

1.2.1人CD3和CD137的表达和纯化

人CD3复合物的γ和ε亚基(人CD3eg接头)通过29聚体接头连接，并将Flag标签融合到γ亚基的C末端(SEQ ID NO:84，表1.1a和1.2a)。使用FreeStyle293F细胞系(ThermoFisher)瞬时表达该构建体。使用装有Q HP树脂(GE Healthcare)的柱子浓缩表达人CD3eg接头的条件培养基，然后将其施加到FLAG-tag亲和层析。收集含有人CD3eg接头的级分，然后将其置于用1x D-PBS平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(GE Healthcare)上。然后合并含有人CD3eg接头的级分，并储存在-80℃下。

使用FreeStyle293F细胞系(Thermo Fisher)瞬时表达在其C末端带有六组氨酸(His-tag)和生物素受体肽(BAP)的人CD137胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO:201，表1.1a和1.2a)。将表达人CD137 ECD的条件培养基施加到HisTrap HP柱(GE Healthcare)，并用含咪唑(Nacalai)的缓冲液洗脱。收集含有人CD137 ECD的级分，然后将其置于用1x D-PBS平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(GE Healthcare)上。然后合并含有人CD137 ECD的级分，并储存在-80℃下。

1.2.2对人CD3和CD137的亲和力测量

使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)在25摄氏度下评估双Fab抗体(Dual-Ig)对人CD3的结合亲和力。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)，将抗人Fc(GE Healthcare)固定在CM4传感器芯片的所有流通池上。将抗体捕获到抗Fc传感器表面上，然后将重组人CD3或CD137注射到流通池上。在包含20mM ACES，150mM NaCl，0.05％吐温20、0.005％NaN3的ACES pH 7.4中制备所有抗体和分析物。每个周期用3M MgCl2再生传感器表面。通过使用Biacore T200评估软件2.0版(GE Healthcare)处理数据并将其拟合到1：1结合模型来确定结合亲和力。在相同条件下进行CD137结合亲和力测定，不同之处在于测定温度设定为37℃。双Fab抗体与重组人CD3和CD137的结合亲和力示于表1.4中。

1.3.双特异性和三特异性抗体制备

为了评估Dual-Ig变体的功效，生成了双特异性或三特异性抗体，其一条臂识别肿瘤抗原且另一条臂识别效应细胞(主要是T细胞)。靶向肿瘤抗原glypican-3(GPC3)的抗GPC3(重链：SEQ ID NO:206；轻链：SEQ ID NO:207)，或阴性对照匙孔血蓝蛋白(KLH)(本文称为Ctrl)抗体用作抗-靶标结合臂，而根据(Proc Natl Acad Sci USA.2013 Mar 26；110(13)：5145-5150)中所述的方法，使用Fab-臂交换(FAE)产生实施例1.1和1.2中描述的抗体。双特异性或三特异性抗体的分子形式与常规IgG为相同形式。例如，GPC3/H1643L581是一种能够结合GPC3、CD3和CD137的三特异性抗体。为了鉴定实施例1.1中所述的哪些Dual-Ig三特异性变体有助于改善归因于CD137活性的细胞毒性，我们将能够结合GPC3和CD3的双特异性抗体(表1.1)GPC3/CD3ε作为对照。产生的所有抗体均包含对Fcγ受体具有减弱的亲和力的沉默Fc。

[实施例2]评价源自亲本双Fab H183L072的亲和力成熟变体对肿瘤细胞的体外细胞毒性

2.1.体外评估亲和力成熟变体的CD3激动活性

为了评价由于亲和力成熟而导致的CD3激动活性，进行了NFAT-luc2 Jurkat萤光素酶测定。简而言之，将在细胞膜上表达人GPC3的4×10

2.2.体外评估亲和力成熟变体的CD137激动活性

为了评估哪种抗体变体由于亲和力成熟而可能导致强CD137激动活性，GloResponse

在图1.2中，抗体变体分为板1(图1.2上图)和板2(图1.2下图)。与用作阴性对照的GPC3/CD3ε相比，两个板中的所有变体均具有可检测到的CD137激动活性。亲和力成熟之前的亲本抗体，GPC3/H183L072也在两个板中用作对照。在图1.2中，在对CD137结合的亲和力成熟后，所有变体均显示出比亲本抗体GPC3/H183L072更强的CD137激动性抗体。因此，板1中的GPC3/H1643L581和GPC3/H868L581(图1.2上图)和板2中的GPC3/H2594L581和GPC3/H2591L581(图1.2下图)是导致更强的CD137激动活性的最佳变体。而板1中的GPC3/H1550L918和板2中的GPC3/H1610L581和GPC3/H1610L939等变体则显示出较弱的CD137活性。

综合来看，图1.1和1.2显示，板1中的GPC3/H1643L581、GPC3/H868L581和板2中的GPC3/H2591L581在Jurkat细胞中似乎具有相似的强活性，而在这些变体中GPC3/H1610L939具有较弱的活性。

2.3.亲和力成熟变体的体外细胞毒性评价

为了将CD3、CD137活化的观察扩展到体外细胞毒性，使用人外周血单核细胞对先前描述的亲和力成熟的变体进行了对SK-pca60细胞的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)活性的评估。

2.3.1.冷冻人PBMC的制备

将含有商购的PBMC的冷冻小瓶(STEMCELL Technologies.)置于37℃的水浴中以解冻细胞。然后将细胞分配到含有9mL培养基(用于培养靶细胞的培养基)的15mL falcon管中。然后将细胞悬液在室温下以1200rpm离心5分钟。轻轻吸出上清液，加入新鲜的温热培养基进行重悬并用作人PBMC溶液。

2.3.2.使用抗GPC3亲和力成熟的双Fab三特异性抗体测量TDCC活性

通过在PBMC存在下使用xCELLigence实时细胞分析仪(Roche Diagnostics)观察肿瘤细胞生长抑制率来评估细胞毒活性。图1.3显示了抗GPC3亲和力成熟的双Fab三特异性抗体的TDCC活性。将SK-pca60细胞系用作靶细胞。将靶细胞从培养皿中取出，通过将细胞调整为3.5x10

细胞生长抑制率(％)＝(A-B)x100/(A-1)

A表示未添加抗体(仅包含靶细胞和人PBMC)的孔中的细胞指数值的平均值，B表示靶孔的细胞指数值的平均值。以一式三份进行检查。

亲和力成熟的变体与上述实施例一样分入2个板，其中GPC3/H1643L581作为图1.3中用于参考的内部板对照。尽管大多数变体显示出相似的TDCC活性，但可以观察到，在这些变体中，H1643L581在两个板中在0.56nM和1.67nM的较低浓度下显示出相对较强的TDCC活性。图1.3a显示GPC3/H2591L581相对较弱，而图1.3b显示GPC3/H1610L939在0.56nM浓度下相对较弱。

2.3.3.使用抗GPC3亲和力成熟的双Fab三特异性抗体测量细胞因子释放

为了进一步确定抗体的体外效力，还针对细胞因子释放对它们进行了评估。在48小时收获与实施例2.3.2类似地进行TDCC测定的上清液，并评估细胞因子的存在。由于大多数抗体显示出与图1.1中GPC3/CD3ε类似的CD3激动活性，因此将GPC3/CD3ε添加到该测定中以评估由于与CD137的协同活性而导致的细胞因子释放。同样，将GPC3/H1643L581用作内部板对照。使用细胞计数珠阵列(CBA)人Th1/T2细胞因子试剂盒II(BD Biosciences#551809)评估总细胞因子释放。评估了IFNγ(图1.3c)、IL-2(图1.3d)和IL-6(图1.3e)。

如图1.3c和1.3d所示，GPC3/H2591L581和GPC3/H1643L581是板1中在5nM和1.67nM下导致高IFNγ和IL-2的前2个变体。在板2中，GPC3/H1610L939、GPC3/H2594L581和GPC3/H1643L581在5nM下显示出相对较强的细胞因子释放。但是，只有GPC3/H1643L581在1.67nM下显示较强的细胞因子释放。至于图1.3e中显示的IL-6水平，除了GPC3/H2591L581在0.56nM和0.19nM下显示出较低的IL-6水平外，所有变体均显示与板1中的GPC3/CD3ε相似的水平。类似地，在板2中，所有变体显示出与GPC3/H1643L581相似的细胞因子释放水平。综合来看，与GPC3/CD3ε相比，双Fab变体可以显示出改善的IFNγ和IL-2，而不会显著增加IL-6水平。

综合来看，亲和力成熟的变体显示出更强的CD137激动活性，这可以引起对应于细胞因子释放的TDCC活性。特别地，相对于GPC3/CD3ε，变体显示出改善的IFNγ和IL-2水平。

[实施例3]评估GPC3/CD3/人CD137(2+1)三特异性抗体和抗GPC3/Dual(1+1)三特异性抗体的脱靶细胞毒性。

3.1.抗GPC3/CD137xCD3(2+1)三特异性抗体的制备

为了研究靶标独立的细胞毒性和细胞因子释放，通过使用CrossMab和FAE技术生成了三特异性抗体(图2.1和2.2)。如上所述，用CrossMab产生四价IgG样分子，抗体A(mAbA)，其每条臂具有两个结合结构域，导致在一个分子中产生四个结合结构域。二价IgG,抗体B(mAb B)与常规IgG的形式相同。mAb A和mAb B的Fc区均是FcγR沉默的，对Fcγ受体的亲和力减弱，被去糖基化并适用于FAE。构建了六种三特异性抗体。六种三特异性抗体中每个Fv区的靶抗原示于表2.1中。mAb A、mAb B和mAb AB的每个结合结构域的命名规则示于图2.2中。产生各自的三特异性抗体mAb AB的一对mAb A和mAb B及其SEQ ID NO示于表2.2和表2.2中。在WO2005/035584A1中描述的抗体CD3D(2)_i121(缩写为AN121)用作抗CD3抗体。表2中所述的三特异性抗体通过上述方法表达和纯化。

[表2.1]

抗体每个臂的靶标

[表2.2]

表2.1中所述抗体的每个可变序列的SEQ ID NO

[表2.3]

表2.1和2.2中所述抗体的可变区的氨基酸序列

3.2.评估GPC3/CD137xCD3三特异性抗体的结合

使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)在37℃下评估三特异性抗体对人CD3和CD137的结合亲和力。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗人Fc抗体(GE Healthcare)固定在CM4传感器芯片的所有流通池上。将抗体捕获到抗Fc传感器表面上，然后将重组人CD3或CD137注射到流通池上。在包含20mM ACES、150mM NaCl、0.05％吐温20、0.005％NaN3的ACES pH 7.4中制备所有抗体和分析物。每个周期用3M MgCl

表2.4显示了三特异性抗体对重组人CD3和CD137的结合亲和力。

[表2.4]

通过Biacore测量的表2.1所述三特异性抗体对人CD137或CD3的结合亲和力

3.3.评估GPC3/CD137xCD3三特异性抗体和抗-GPC3/双Fab三特异性抗体对人CD137表达细胞的脱靶细胞毒性。

源自亲本双Fab H183L072的三特异性抗体GPC3/CD137xCD3、GPC3/CtrlxCD3 2+1形式或GPC3/H183L072 1+1形式导致在靶细胞(表达GPC3的SK-pca60)存在下Jurkat细胞的剂量依赖性活化(参考实施例15-5；图28)。还显示了在存在表达CHO的hCD137的情况下，使用GPC3/H183L072，只有2+1形式的三特异性形式导致Jurkat细胞活化，而1+1形式的三特异性形式不导致Jurkat细胞活化(参考实施例15-6；图29)。这表明2+1形式可能潜在地导致T细胞的肿瘤抗原独立的活化。

为了研究H183L072的亲和力成熟是否会导致潜在的脱靶细胞毒性，对亲和力成熟的变体进行了相同的评估，与三特异性2+1抗体形式进行比较，其中将表达hCD3的Jurkat细胞和表达hCD137的CHO细胞共培养。将5.0x10

3.4.评估来自PBMC的GPC3/CD137xCD3三特异性抗体和GPC3/双Fab三特异性抗体的脱靶细胞因子释放

还使用人PBMC溶液评估了三特异性形式的脱靶毒性的比较。简而言之，将如实施例2.3.1中所述制备的2.0×10

[实施例4]评估GPC3/CD3ε双特异性抗体和抗GPC3/双Fab(1+1)三特异性抗体的体内功效

4.1.抗GPC3/双Fab、GPC3/CD3ε和GPC3/CD137双特异性抗体的制备

如实施例1.3中所述产生用于体内功效研究的抗体。除了在实施例1中使用的抗GPC3/双Fab和GPC3/CD3ε之外，在实施例1.3中进行FAE之前，以与实施例1.1中产生的抗体(表1.1)相同的方式生成二价形式的抗CD137抗体以获得GPC3/CD137。对于人源化huNOG小鼠研究，抗体包含对Fcγ受体亲和力减弱的人Fc。而对于CD137/CD3双重人源化小鼠研究，抗体包含对Fcγ受体亲和力减弱的小鼠Fc。

4.2.CD137/CD3双人源化小鼠的产生

通过使用小鼠胚胎干细胞用人CD137基因组序列替换小鼠内源性Cd137基因组区域生成了人CD137敲入(KI)小鼠品系。将人CD3EDG替换小鼠建立为将其中的CD3复合物的所有三个组分-CD3e、CD3d和CD3g-替换为其人对应物CD3E、CD3D和CD3G的品系(ScientificRep.2018；8：46960)。通过将人CD137KI小鼠与人CD3EDG替换小鼠进行杂交，建立了CD137/CD3双人源化小鼠品系。

4.3.LLC1/hGPC3细胞系的制备

用pCXND3-hGPC3转染小鼠癌细胞系LL/2(LLC1)(ATCC)，并用500micro g/ml G418进行单细胞克隆分离。选择的克隆(LLC1/hGPC3)被证实了hGPC3的表达。

4.4.用hCD3/hCD137小鼠评估抗GPC3/双Fab三特异性抗体的体内功效

使用荷瘤模型评估实施例4.1中制备的抗体的体内功效。

为了进行体内功效评估，使用在实施例4.2中建立的CD3/CD137双重人源化小鼠，以下称为“hCD3/hCD137小鼠”。将稳定表达人GPC3的LLC1/hGPC3细胞移植到hCD3/hCD137小鼠中，并通过施用GPC3/H1643L0581、GPC3/CD137或GPC3/CD3ε抗体来治疗已确认肿瘤形成的hCD3/hCD137小鼠。

更具体地，在使用LLC1/hGPC3模型的GPC3/H1643L0581的药效测试中，进行了以下测试。将LLC1/hGPC3(1x10

结果，与GPC3/CD3ε组和GPC3/CD137组相比，GPC3/H1643L0581组的抗肿瘤活性更为明显(图3.1a)。

在另一项体内功效评估中，将LLC/hGPC3细胞移植到hCD3/hCD137小鼠的右胁腹中。在第9天，根据小鼠的肿瘤体积和体重将它们随机分组，并静脉内注射实施例4.1中制备的载体或抗体。每周测量肿瘤体积两次。为了进行IL-6分析，在治疗后2小时将小鼠放血。根据制造商的协议，使用Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Th1 Panel分析血浆样品。如图3.1b和3.1c所示，与GPC3/CD3ε组相比，GPC3/Dual组显示出更强的抗肿瘤活性和更少的IL-6产生。

4.5.用HuNOG小鼠评估抗GPC3/双Fab三特异性抗体的体内功效

在人肝sk-pca-13a癌症模型中测试了实施例4.1中制备的抗GPC3/双Fab抗体、GPC3/CD3ε双特异性抗体和GPC3/CD137双特异性抗体的抗肿瘤活性。还与GPC3/CD137双特异性抗体组合测试了GPC3/CD3ε双特异性抗体。将Sk-pca-13a细胞皮下移植到NOG人源化小鼠中。

为了获得sk-pca-13a细胞系，通过本领域技术人员众所周知的方法将人GPC3基因整合到人肝腺癌细胞系SK-HEP-1(ATCC No.HTB-52)的染色体中。

NOG雌性小鼠购自In-Vivo Science。为了进行人源化，对小鼠进行亚致死性辐射，然后在1天后注射100,000个人脐带血细胞(ALLCELLS)。16周后，将sk-pca-13a细胞(1x10

结果，抗GPC3/双Fab(GPC3/H1643L0581)显示出比GPC3/CD3ε更高的抗肿瘤活性(图3.2)。

[实施例5]H0868L0581/hCD137复合物的X射线晶体结构分析

5.1.制备用于共晶分析的抗体

选择H0868L581与hCD137蛋白进行共晶体分析。使用Expi293表达系统(ThermoFisher Scientific)将二价抗体瞬时转染并表达。收获培养物上清液，并使用MabSelectSuRe亲和层析(GE Healthcare)从上清液中纯化抗体，然后使用Superdex200(GEHealthcare)进行凝胶过滤层析。

5.2.人CD137的细胞外结构域(24-186)的表达和纯化

在存在Kifunensine的情况下，在HEK293细胞中表达通过因子Xa可切割接头与Fc融合的人CD137的细胞外结构域。通过亲和层析(HiTrap MabSelect SuRe柱，GEHealthcare)和尺寸排阻层析(HiLoad 16/600 Superdex 200pg柱，GE Healthcare)纯化来自培养基的CD137-FFc。Fc用因子Xa切割，所得的CD137细胞外结构域进一步用串联连接的凝胶过滤柱(HiLoad 16/600 Superdex 200pg，GE Healthcare)和蛋白A柱(HiTrapMabSelect SuRe 1ml，GE Healthcare)纯化，随后使用苯甲脒琼脂糖树脂(GE Healthcare)纯化。合并含有CD137细胞外结构域的级分，并在-80℃下储存。

5.3.H0868L0581及抗CD137对照抗体的Fab片段的制备

使用Expi293表达系统(Thermo Fisher Scientific)瞬时转染和表达用于晶体结构分析的抗体。收获培养物上清液，并使用MabSelect SuRe亲和层析(GE Healthcare)从上清液中纯化抗体，然后使用Superdex200(GE Healthcare)进行凝胶过滤层析。H0868L0581和已知抗CD137对照抗体(以下称为137Ctrl，重链SEQ ID NO:82，轻链SEQ ID NO:83)的Fab片段通过常规方法使用Lys-C(Roche)有限消化来制备，然后上样到蛋白A柱(MabSlectSuRe，GE Healthcare)以去除Fc片段，阳离子交换柱(HiTrap SP HP，GE Healthcare)和凝胶过滤柱(Superdex200 16/60，GE Healthcare)。合并含有Fab片段的级分，并在-80℃下储存。

5.4.H0868L0581 Fab、137Ctrl和人CD137复合物的制备

将纯化的CD137与GST标签融合的内切糖苷酶F1(内部的)混合以进行去糖基化，然后使用凝胶过滤柱(HiLoad 16/600 Superdex 200 pg，GE Healthcare)和蛋白A柱(HiTrapMabSelect SuRe 1ml，GE Healthcare)纯化CD137。将纯化的CD137与H0868L0581 Fab混合。通过凝胶过滤柱(Superdex 200Increase 10/300 GL，GE Healthcare)纯化该复合物，然后将纯化的H0868L0581 Fab和CD137复合物与137Ctrl混合。通过凝胶过滤层析(Superdex20010/300增加，GE Healthcare)，使用用25mM HEPES pH 7.3，100mM NaCl平衡的柱纯化三元复合物。

5.5.结晶

将纯化的复合物浓缩至约10mg/mL，并通过坐滴蒸汽扩散法在21℃下进行结晶。储液由0.1M Tris盐酸盐pH8.5、25.0％v/v聚乙二醇单甲基醚550组成。

5.6.数据收集与结构确定

X射线衍射数据通过X06SA在SLS处测量。在测量过程中，将晶体始终置于-178℃的氮气流中，以使其保持冷冻状态，并使用附接到光束线的Eiger X16M(DECTRIS)，每次旋转晶体0.25度,收集了总共1440个X射线衍射图像。使用autoPROC程序(Acta.Cryst.2011，D67：293-302)，XDS Package(Acta.Cryst.2010，D66：125-132)和AIMLESS(Acta.Cryst.2013，D69：1204-1214)确定细胞参数，标引衍射点并处理从衍射图像获得的衍射数据)，最后获得了高达3.705埃分辨率的衍射强度数据。晶体学数据统计如表2.5所示。

通过使用程序Phaser(J.Appl.Cryst.2007，40：658-674)进行分子置换来确定结构。搜索模型源自公开的晶体结构(PDB代码：4NKI和6MI2)。使用Coot程序(ActaCryst.2010，D66：486-501)构建模型，并使用程序Refmac5(Acta Cryst.2011，D67：355-367)和PHENIX(Acta Cryst.2010，D66：213-221)细化。来自77.585-3.705埃的衍射强度数据的晶体学可靠性因子(R)为22.33％，自由R值为27.50％。结构细化统计数据示于表2.5中。

X射线数据采集和细化统计

a；R

b；R因子＝∑hkl|F

C；R

5.7.H0868L0581 Fab和CD137相互作用位点的鉴定

以3.705埃的分辨率测定了H0868L0581 Fab、137Ctrl和CD137的三元复合物的晶体结构。在图3.3a和3.3b中，H0868L0581 Fab接触区的表位分别映射到CD137氨基酸序列和晶体结构中。该表位包括CD137的氨基酸残基，其包含位于距晶体结构中的H0868L0581 Fab的任何部分4.5埃距离内的一个或更多个原子。此外，图3.3a和3.3b中突出显示了3.0埃内的表位。

如图3.3a和3.3b所示，晶体结构表明，结合在H0868L0581 Fab的重链和轻链之间形成的口袋中的CD137的CRD1中的L24-N30，特别是L24-S29以CD137的N末端朝向口袋深度的方式被深埋。另外，H0868L0581 Fab的重链CDR识别CD137中CRD1中的N39-I44和CRD2中的G58-I64。CRD是被Cys-Cys形成的结构分开的结构域名称，其如在WO2015/156268中所述被称为CRD参考。

我们鉴定了识别人CD137的N末端区域(尤其是L24-N30)的抗人CD137抗体，并且还确定了针对该区域的抗体可以活化细胞上的CD137。

[参考实施例1]从双Fab噬菌体展示文库获得结合CD3ε和人CD137的Fab结构域

1.1.用GLS3000轻链构建重链噬菌体展示文库

使用参考实施例12中合成的抗体文库片段来构建用于噬菌体展示的双Fab文库。将双重文库制备为其中H链如参考实施例12所示多样化而L链固定为原始序列GLS3000(SEQID NO:85)的文库。通过将V11L/L78I突变加到FR上(框架)并进一步使CDR如表27所示(参考实施例12)多样化而由CE115HA000获得的H链文库序列，被委托给DNA合成公司DNA2.0，Inc.以获得抗体文库片段(DNA片段)。将获得的抗体文库片段插入噬菌粒中，用于通过PCR扩增的噬菌体展示。GLS3000被选为L链。通过电穿孔将构建的用于噬菌体展示的噬菌粒转移到大肠杆菌中以制备含有抗体文库片段的大肠杆菌。

通过感染编码FkpA伴侣基因的辅助噬菌体M13KO7TC/FkpA，从含有构建的噬菌粒的大肠杆菌制备展示Fab结构域的噬菌体文库，然后在0.002％阿拉伯糖存在下于25℃(该噬菌体文库称为DA文库)或在0.02％阿拉伯糖存在下于20℃(此噬菌体文库称为DX文库)温育过夜。M13KO7TC是一种辅助噬菌体，其在辅助噬菌体的pIII蛋白的N2结构域和CT结构域之间具有胰蛋白酶切割序列的插入片段(参见国际专利申请号2002-514413的国家公开)。在其他地方已经公开了将插入基因导入M13KO7TC基因的方法(参见国际专利申请号WO2015046554的国家公开)。

1.2.通过双轮选择获得结合CD3ε和人CD137的Fab结构域

从参考实施例1.1中构建的双Fab文库中鉴定了结合CD3ε和人CD137的Fab结构域。生物素标记的CD3ε肽抗原(氨基酸序列：SEQ ID NO:86)，通过二硫键接头进行生物素标记的CD3ε肽抗原(图4，称为C3NP1-27；氨基酸序列：SEQ ID NO:194，由Genscript合成)，与人IgG1 Fc片段融合的生物素标记的人CD137(称为人CD137-Fc)以及与人IgG1 Fc片段融合的SS生物素化人CD137(称为ss-人CD137-Fc)被用作抗原。通过使用EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素化试剂盒(PIERCE，目录号21445)将ss-人CD137-Fc制备成与人IgG1 Fc片段融合的人CD137。根据说明手册进行生物素化。

从携带构建的噬菌粒的大肠杆菌制备噬菌体用于噬菌体展示。将2.5M NaCl/10％PEG添加到已经产生噬菌体的大肠杆菌的培养液中，并且将如此沉淀的一组噬菌体用TBS稀释以获得噬菌体文库溶液。接下来，将BSA(最终浓度：4％)加入到噬菌体文库溶液中。淘选方法参照使用固定在磁珠上的抗原的一般淘选方法来进行(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2)，2-9；J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2)，191-203；Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20；和Mol.Cell Proteomics(2003)2(2)，61-9)。所用的磁珠是NeutrAvidin包被的磁珠(NeutrAvidin包被的Sera-Mag SpeedBeads)或链霉亲和素包被的磁珠(DynabeadsM-280 Streptavidin)。为了消除结合至磁珠本身或人IgG1 Fc区的抗体展示噬菌体，进行了磁珠和生物素标记的人Fc的扣除。

具体地，将噬菌体溶液与250pmol的人CD137-Fc和4nmol的游离人IgG1Fc结构域混合，并在室温下温育60分钟。在室温下，用2％脱脂乳/TBS和游离的链霉亲和素(Roche)封闭磁珠60分钟以上，并用TBS洗涤3次，然后与温育的噬菌体溶液混合。在室温下温育15分钟后，将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤3次，然后进一步用1mL TBS洗涤两次。加入5μL的100mg/mL胰蛋白酶和495μL的TBS，并在室温下温育15分钟，随后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。通过在37℃温和旋转培养菌株1小时，用噬菌体感染大肠杆菌菌株。将感染的大肠杆菌接种到225mm×225mm的板上。接下来，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体以制备噬菌体文库溶液。

在第一轮淘选过程中，结合人CD137的展示抗体的噬菌体被浓缩。在第二轮淘选中，将250pmol的ss-人CD137-Fc用作生物素标记的抗原，并用TBST洗涤3次，然后用TBS洗涤2次。在室温下用25mM DTT洗脱15分钟，然后用胰蛋白酶消化。

在第三轮和第六轮淘选中，将62.5pmol C3NP1-27用作生物素标记的抗原，并用TBST洗涤3次，然后用TBS洗涤2次。在室温下用25mM DTT洗脱15分钟，然后用胰蛋白酶消化。

在第四、第五和第七轮淘选中，将62.5pmol的ss-人CD137-Fc用作生物素标记的抗原，并用TBST洗涤3次，然后用TBS洗涤2次。在室温下用25mM DTT洗脱15分钟，然后用胰蛋白酶消化。

1.3.噬菌体展示的Fab结构域与CD3ε或人CD137的结合

根据一般方法(Methods Mol.Biol.(2002)178，133-145)，从通过上述方法获得的大肠杆菌的96个单个菌落中各自回收包含噬菌体的培养上清液。通过以下步骤对包含噬菌体的培养上清液进行ELISA：将链霉亲和素包被的微孔板(384孔，greiner，Cat#781990)用包含生物素标记的抗原(生物素标记的CD3ε肽或生物素标记的人CD137-Fc)的10μL TBS在4℃或室温下包被过夜。用TBST洗涤板的每个孔以除去未结合的抗原。然后，将孔用80μLTBS/2％脱脂乳封闭1小时或更长时间。除去TBS/2％脱脂乳后，将制备的培养上清液加入到每个孔中，并将板在室温下静置1小时，使得噬菌体展示的抗体与每个孔中包含的抗原结合。每个孔用TBST洗涤，然后将HRP/抗M13(GE Healthcare 27-9421-01)添加到每个孔中。将板温育1小时。用TBST洗涤后，将TMB单一溶液(ZYMED Laboratories，Inc.)添加到孔中。通过加入硫酸终止每个孔中溶液的显色反应。然后，基于450nm处的吸光度测定显色。结果如图5所示。

如图5所示，即使对人CD137的淘选过程进行了5次，所有克隆均显示出与人CD3ε的结合，但未显示出与人CD137的结合。这可能取决于用链霉亲和素包被的微孔板进行该噬菌体ELISA分析的较低灵敏度，因此也进行了用链霉亲和素包被的珠子的噬菌体ELISA。

1.4.噬菌体展示的Fab结构域与人CD137的结合(噬菌体珠ELISA)

首先，将链霉亲和素包被的磁珠MyOne-T1珠用包括0.5x封闭Ace，0.02％吐温和0.05％ProClin 300的封闭缓冲液洗涤3次，然后在室温下用该封闭缓冲液封闭60分钟或更长时间。用TBST洗涤一次后，将0.625pmol的ss-人类CD137-Fc添加到磁珠中，并在室温下温育10分钟或更长时间，然后将磁珠施加到96孔板的每个孔中(Corning，3792黑色圆底PS板)。将12.5μL每种Fab展示噬菌体溶液和12.5μL TBS添加到孔中，并将板在室温下静置30分钟，以使各Fab结合至各孔中生物素标记的抗原。然后将每个孔用TBST洗涤。将用包括0.5x封闭Ace，0.02％吐温和0.05％ProClin300的封闭缓冲液稀释的抗M13(p8)Fab-HRP添加到每个孔中。将板温育10分钟。用TBST洗涤3次后，将LumiPhos-HRP(Lumigen)加入到每个孔中。2分钟后，检测每个孔的荧光。测量结果示于图6中。

一些克隆显示出与人CD137的明显结合。该结果表明，还从该设计的具有噬菌体展示淘选策略的文库中获得了与人CD3ε和CD137都结合的一些Fab结构域。然而，与CD3ε肽相比，与人CD137的结合仍然很弱。使用与噬菌粒载体特异性结合的引物(SEQ ID NO：196和197)通过PCR扩增每个人CD137结合克隆的VH片段，并分析DNA序列。该结果表明，所有结合克隆都具有相同的VH序列，这意味着只有一个Fab克隆显示出与人CD137和CD3ε都结合。为了改善这一点，在下一实验中还将双轮选择应用于噬菌体展示策略。

[参考实施例2]通过双轮选择法从双Fab噬菌体展示文库获得结合CD3ε和人CD137的Fab结构域。

2.1.用GLS3000轻链构建重链噬菌体展示文库

通过感染编码FkpA伴侣(SEQ ID NO:91)的辅助噬菌体M13KO7TC/FkpA，从含有构建的噬菌粒的大肠杆菌制备展示Fab结构域的噬菌体文库，然后在0.002％阿拉伯糖存在下于25℃(该噬菌体文库称为DA文库)或在0.02％阿拉伯糖存在下于20℃(此噬菌体文库称为DX文库)温育过夜。M13KO7TC是一种辅助噬菌体，其在辅助噬菌体的pIII蛋白的N2结构域和CT结构域之间具有胰蛋白酶切割序列的插入片段(参见日本专利申请公开号2002-514413)。在其他地方已经公开了将插入基因导入M13KO7TC基因的方法(参见WO2015/046554)。

2.2.通过双轮选择获得结合CD3ε和人CD137的Fab结构域

从参考实施例2.1中构建的双Fab文库中鉴定了结合CD3ε和人CD137的Fab结构域。生物素标记的CD3ε肽抗原(氨基酸序列：SEQ ID NO:86)，通过二硫键接头进行生物素标记的CD3ε肽抗原(C3NP1-27：SEQ ID NO:194)以及与人IgG1 Fc片段融合的生物素标记的人CD137(称为人CD137-Fc)被用作抗原。

为了产生更多的结合人CD137和CD3ε的Fab结构域，在淘选第2轮和随后的淘选轮中，双轮选择也用于噬菌体展示淘选。

从含有构建的噬菌粒的大肠杆菌制备噬菌体用于噬菌体展示。将2.5M NaCl/10％PEG添加到已经产生噬菌体的大肠杆菌的培养液中，并且将如此沉淀的一组噬菌体用TBS稀释以获得噬菌体文库溶液。接下来，将BSA(最终浓度：4％)加入到噬菌体文库溶液中。淘选方法参照使用固定在磁珠上的抗原的一般淘选方法来进行(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2)，2-9；J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2)，191-203；Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20；和Mol.Cell Proteomics(2003)2(2)，61-9)。所用的磁珠是NeutrAvidin包被的磁珠(NeutrAvidin包被的Sera-Mag SpeedBeads)或链霉亲和素包被的磁珠(DynabeadsM-280 Streptavidin)。为了消除结合至磁珠本身或人IgG1 Fc区的抗体展示噬菌体，进行了磁珠和生物素标记的人Fc的扣除。

具体地，在第1轮淘选中，将磁珠在室温下用2％脱脂乳/TBS封闭60分钟或更长时间，并用TBS洗涤3次。将DA文库或DX文库的噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟或更长时间，然后回收上清液。将500pmol生物素标记的人IgG1 Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟或更长时间，然后回收上清液。将500pmol生物素标记的CD137-Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液添加到封闭的磁珠和8nmol的游离人IgG1中。

还添加Fc结构域，然后在室温下温育60分钟。将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤两次，然后进一步用1mL的TBS洗涤一次。加入0.5mL 1mg/mL胰蛋白酶后，将珠子在室温下悬浮15分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加到对数生长期(OD600：0.4-0.5)的大肠杆菌菌株ER2738中。通过在37℃温和旋转培养菌株1小时，用噬菌体感染大肠杆菌菌株。将感染的大肠杆菌接种到225mm×225mm的板上。接下来，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体以制备噬菌体文库溶液。

在该第1轮淘选过程中，浓缩了与人CD137结合的抗体展示噬菌体，因此从下一轮淘选过程中进行了双轮选择以回收结合CD3ε和人CD137的抗体展示噬菌体。

具体地，在第2轮淘选中，将磁珠在室温下用2％脱脂乳/TBS封闭60分钟或更长时间，并用TBS洗涤3次。将噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟或更长时间，然后回收上清液。将500pmol生物素标记的人IgG1 Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟或更长时间，然后回收上清液。将500pmol生物素标记的CD137-Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。

在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟。将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤三次，然后进一步用1mL的TBS洗涤两次。使用FabRICATOR(IdeS，用于IgG铰链区的蛋白酶，GENEVIS)(称为IdeS洗脱活动)来回收抗体展示噬菌体。在该过程中，添加含有80μL TBS缓冲液的10unit/μL Fabricator 20μL，将珠子在37℃下悬浮30分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。

在淘选过程的第一循环中，浓缩了与人CD137结合的抗体展示噬菌体，因此继续进行淘选过程的第二循环以在噬菌体感染和扩增之前回收还与CD3ε结合的抗体展示噬菌体。将500pmol生物素标记的CD3ε添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液，50微升的TBS和250微升的8％BSA封闭缓冲液添加到封闭的磁珠中，然后在37℃下温育30分钟，在室温下温育60分钟，在4℃下温育过夜，然后在室温下温育60分钟，以将抗体展示噬菌体从人CD137转移到CD3ε。

将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤三次，然后进一步用1mL的TBS洗涤两次。将补充有0.5mL 1mg/mL胰蛋白酶的珠子在室温下悬浮15分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。将从胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体添加到对数生长期(OD600：0.4-0.7)的大肠杆菌菌株ER2738中。通过在37℃温和旋转培养菌株1小时，用噬菌体感染大肠杆菌菌株。将感染的大肠杆菌接种到225mm×225mm的板上。接下来，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体以回收噬菌体文库溶液。

在第三和第四轮淘选中，使用TBST的洗涤次数增加到五次，然后使用TBS的洗涤次数增加到两次。在两轮选择的第二轮中，使用C3NP1-27抗原代替生物素标记的CD3ε肽抗原，并用DTT溶液洗脱以切割CD3ε肽与生物素之间的二硫键。精确地，在用TBS洗涤两次之后，添加500μL的25mM DTT溶液并将珠子在室温下悬浮15分钟，然后立即使用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。将0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶添加到回收的噬菌体溶液中，并在室温下温育15分钟。

2.3.具有获得的Fab结构域的IgG与人CD137和食蟹猴CD137的结合

从第3和第4轮从DA和DX文库的每个淘选输出池中选择96个克隆，并分析它们的VH基因序列。获得了29条VH序列，因此将它们全部转换为IgG形式。使用与噬菌粒载体特异性结合的引物(SEQ ID NO：196和197)通过PCR扩增每个克隆的VH片段。将扩增的VH片段整合到已经具有人IgG1CH1-Fc区的动物表达质粒中。所制备的质粒通过参考实施例9的方法用于在动物细胞中表达。GLS3000用作轻链，其表达质粒的制备如参考实施例12.2所示。

将制备的抗体进行ELISA以评估其与人CD137(SEQ ID NO:195)和食蟹猴(称为cyno)CD137(SEQ ID NO:92)的结合能力。图7显示了人和食蟹猴CD137之间的氨基酸序列差异。其中有8个不同的残基。

首先，将20μg链霉亲和素包被的磁珠MyOne-T1磁珠用包括0.5x封闭Ace，0.02％吐温和0.05％ProClin 300的封闭缓冲液洗涤3次，然后在室温下用该封闭缓冲液封闭60分钟或更长时间。用TBST洗涤一次后，将磁珠施加到白色圆底PS板(Corning，3605)的每个孔中，并将0.625pmol生物素标记的人CD137-Fc，生物素标记的cyno CD137-Fc或生物素标记的人Fc添加到磁珠中，并在室温下温育15分钟或更长时间。用TBST洗涤一次后，将25μL的每种50ng/μL纯化的IgG加入孔中，然后在室温下将板静置一小时，以使每种IgG与每个孔中的生物素标记的抗原结合。

然后将每个孔用TBST洗涤。将用TBS稀释的山羊抗人κ轻链碱性磷酸酶缀合物(BETHYL，A80-115AP)添加到每个孔中。将板温育1小时。用TBST洗涤后，将每个样品转移到96孔板(Corning，3792黑色圆底PS板)中，并向每个孔中添加APS-5(Lumigen)。2分钟后，检测每个孔的荧光。测量结果示于表3和图8中。其中，克隆DXDU01_3#094、DXDU01_3#072、DADU01_3#018、DADU01_3#002、DXDU01_3#019和DXDU01_3#051显示出与人和cyno CD137的结合。另一方面，显示出与人CD137的最强结合的DADU01_3#001没有显示与cyno CD137的结合。

[表3]

2.4.具有获得的Fab结构域的IgG与人CD3ε的结合

还对每种抗体进行ELISA以评估其与CD3ε的结合能力。

首先，将MyOne-T1链霉亲和素珠与0.625pmol生物素标记的CD3ε混合，并在室温下温育10分钟，然后向其中加入包括0.5x封闭Ace，0.02％吐温和0.05％ProClin 300/TBS的封闭缓冲液以封闭磁珠。将混合溶液分配到96孔板(Corning，3792黑色圆底PS板)的每个孔中，并在室温下温育60分钟或更长时间。然后用TBST洗涤一次磁珠，将100ng纯化的IgG添加到每个孔的磁珠中，然后将板在室温下静置一小时，以允许每种IgG与每个孔中的生物素标记的抗原结合。

然后用TBST洗涤每个孔，将用TBS稀释的山羊抗人κ轻链碱性磷酸酶缀合物(BETHYL，A80-115AP)添加到每个孔中。将板温育1小时。用TBST洗涤后，将APS-5(Lumigen)加入到每个孔中。2分钟后，检测每个孔的荧光。测量结果示于表4和图9中。所有克隆均显示出与CD3ε肽的明显结合。这些数据证明，与参考实施例1中进行的常规噬菌体展示淘选过程相比，通过设计的Dual Fab抗体噬菌体展示文库以及双轮选择过程，可以以更高的命中率有效地获得与CD3ε、人CD137和cyno CD137都结合的Fab结构域。

[表4]

2.5.评估具有获得的Fab结构域的IgG同时与CD3ε和人CD137的结合

选择六种抗体(DXDU01_3#094(#094)、DADU01_3#018(#018)、DADU01_3#002(#002)、DXDU01_3#019(#019)、DXDU01_3#051(#051)和DADU01_3#001(#001或dBBDu_126))进一步评估。将WO2005/035584A1中描述的抗人CD137抗体(重链为SEQ ID NO:93，轻链为SEQID NO:94)(缩写为B)用作对照抗体。对纯化的抗体进行ELISA评估它们同时与CD3ε和人CD137的结合能力。

首先，将MyOne-T1链霉亲和素珠子与0.625pmol生物素标记的人CD137-Fc或生物素标记的人Fc混合，并在室温下温育10分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS以封闭磁珠。将混合溶液分配到96孔板(Corning，3792黑色圆底PS板)的每个孔中，并在室温下温育60分钟或更长时间。然后用TBS洗涤一次磁珠。将100ng纯化的IgG与62.5、6.25或0.625pmol的游离CD3ε肽或62.5pmol的游离人Fc或TBS混合，然后添加到每个孔的磁珠中，将板在室温下静置一小时，以允许每种IgG与每个孔中的生物素标记的抗原结合。然后将每个孔用TBST洗涤。将用TBS稀释的山羊抗人κ轻链碱性磷酸酶缀合物(BETHYL，A80-115AP)添加到每个孔中。将板温育1小时。用TBST洗涤后，将APS-5(Lumigen)加入到每个孔中。2分钟后，检测每个孔的荧光。测量结果示于表10和图5中。

[表5]

在所有测试的抗体中均观察到游离CD3ε肽对人CD137-Fc的结合抑制，但在对照抗CD137抗体中未观察到，并且未观察到游离Fc结构域导致的抑制。该结果表明，在CD3ε肽存在的情况下，那些获得的抗体不能结合人CD137-Fc，换句话说，这些抗体不同时结合人CD137和CD3ε。因此证明，通过设计的文库和噬菌体展示双轮选择成功地获得了可以结合两种不同抗原CD137和CD3ε但不同时结合的Fab结构域。

[参考实施例3]通过双轮交替选择或四轮选择从双Fab文库获得与CD3ε、人CD137和cyno CD137结合的Fab结构域

3.1.以提高获得结合cyno CD137的Fab结构域的效率的淘选策略

在参考实施例2中成功获得了结合CD3ε、人CD137和cyno CD137的Fab结构域，但是与cyno CD137的结合比与人CD137的结合弱。改进它的一项重要策略是采用双轮选择的交替淘选，其中在不同的淘选轮中将使用不同的抗原。通过这种方法，对CD3ε、人CD137和cynoCD137的选择压力可以利用有利抗原组合(CD3ε与人CD137，CD3ε与人cyno CD137或将人CD137与cyno CD137)放到每轮的双Fab库中。改善它的另一种策略是三轮或四轮选择，其中我们可以在一轮淘选中使用所有必需的抗原。

在参考实施例2的双轮选择过程中，使用过夜温育以使抗体展示噬菌体从第一抗原转移至第二抗原。该方法效果很好，但是当对第一抗原的亲和力强于对第二抗原的亲和力时，几乎不会发生转移(例如，当该双重文库中第一抗原为CD3ε时)。为了解决该问题，还利用碱溶液进行了结合噬菌体的洗脱。表6中描述了每个淘选过程的活动名称和条件。

从参考实施例1.1中构建的双Fab文库中鉴定了结合CD3ε、人CD137和cyno CD137的Fab结构域。生物素标记的CD3ε肽抗原(氨基酸序列：SEQ ID NO:86)，通过二硫键接头生物素标记的CD3ε肽抗原(C3NP1-27；氨基酸序列：SEQ ID NO:194)，与人IgG1 Fc片段融合的生物素标记的CD3ε和与人IgG1 Fc片段融合的生物素标记的人CD3δ的异二聚体(称为CD3ed-Fc，氨基酸序列：SEQ ID NO:95，96)，与人IgG1 Fc片段融合的生物素标记的人CD137(称为人CD137-Fc)，与人IgG1 Fc片段融合的生物素标记的食蟹猴CD137(称为cyno CD137-Fc)和生物素标记的食蟹猴CD137(称为cyno CD137)被用作抗原。

[表6]

3.2.通过双轮选择和交替淘选获得结合CD3ε、人CD137和cyno CD137的Fab结构域

如表6所示，通过双轮选择和交替淘选，进行了命名为活动DU05的淘选条件，以获得结合CD3ε、人CD137和cyno CD137的Fab结构域。

在偶数轮中使用人CD137-Fc，在奇数轮中使用cyno CD137-Fc。双轮选择的详细淘选过程与参考实施例2中所示的相同。在DU05活动中，自第一轮淘选进行双轮选择。

3.3.通过碱洗脱双轮选择和交替淘选获得结合CD3ε、人CD137和cyno CD137的Fab结构域

在使用参考实施例2中所示不同抗原的先前双轮选择中，由于IdeS或DTT切割了抗原和生物素之间的接头区域，抗体展示噬菌体作为与第一抗原的复合物被洗脱，因此第一抗原也进入了双轮选择的第二循环，并与第二抗原竞争。为了抑制第一抗原的进入，还利用碱性缓冲液进行了洗脱，该缓冲液诱导结合抗体从抗原上解离，并且在常规噬菌体展示淘选中是非常流行的方法(称为活动DS01)。

第1轮淘选的详细淘选步骤与参考实施例2所示的相同。在第1轮中，利用生物素标记的人CD137-Fc进行了常规淘选。

在第1轮淘选中，与人CD137结合的Fab展示噬菌体被积累，因此从第2轮淘选，进行碱性洗脱双轮选择以获得结合CD3ε、人CD137和cyno CD137的Fab结构域。

具体地，在第2轮淘选中，将磁珠在室温下用2％脱脂乳/TBS封闭60分钟或更长时间，并用TBS洗涤3次。将噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟或更长时间，然后回收上清液。将500pmol生物素标记的人IgG1 Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟或更长时间，然后回收上清液。将500pmol生物素标记的CD3ε肽添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。

在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟。将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤三次，然后进一步用1mL的TBS洗涤两次。用0.1M三乙胺(TEA，Wako202-02646)回收抗体展示噬菌体。在该过程中，添加500μL的0.1M TEA并将珠子在室温下悬浮10分钟，然后立即使用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。加入100μL的1MTris-HCl(pH 7.5)以中和噬菌体溶液15分钟。

在淘选过程的第一循环中，浓缩了与CD3ε结合的抗体展示噬菌体，因此继续进行淘选过程的第二循环以在噬菌体感染和扩增之前回收还与CD137结合的抗体展示噬菌体。将500pmol生物素标记的人CD137-Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液、50μL的TBS和250μL的8％BSA封闭缓冲液添加到封闭的磁珠中，然后在室温下温育60分钟。

将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤三次，然后进一步用1mL的TBS洗涤两次。将补充有0.5mL 1mg/mL胰蛋白酶的珠子在室温下悬浮15分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。将从胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体添加到对数生长期(OD600：0.4-0.7)的大肠杆菌菌株ER2738中。通过在37℃温和旋转培养菌株1小时，用噬菌体感染大肠杆菌菌株。将感染的大肠杆菌接种到225mm×225mm的板上。接下来，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体以回收噬菌体文库溶液。

在第四轮和第六轮淘选的双轮选择的第二循环中，使用生物素标记的cynoCD137-Fc代替生物素标记的人CD137-Fc。通过第4轮至第6轮淘选，在双轮选择的第二循环中使用了250pmol生物素标记的人或cyno CD137-Fc。

3.4.通过四轮选择获得结合CD3ε、人CD137和cyno CD137的Fab结构域

在先前的双轮选择中，在一轮淘选中只能使用两种不同的抗原。为了突破这一限制，还进行了四轮选择(称为活动MP09和MP11，如表6所示)。

在MP09和MP11的第一轮淘选和MP09的第二轮淘选中，进行了双轮选择。

具体地，将磁珠在室温下用2％脱脂乳/TBS封闭60分钟或更长时间，并用TBS洗涤3次。将噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟或更长时间，然后回收上清液。将500pmol生物素标记的人IgG1Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟或更长时间，然后回收上清液。将268pmol生物素标记的cyno CD137-Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。

在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟。将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤三次，然后进一步用1mL的TBS洗涤两次。使用FabRICATOR(IdeS，用于IgG铰链区的蛋白酶，GENEVIS)(称为IdeS洗脱活动)来回收抗体展示噬菌体。在该过程中，添加含有80μL TBS缓冲液的10unit/μL Fabricator 20μL，将珠子在37℃下悬浮30分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。

在淘选过程的第一循环中，浓缩了与cyno CD137结合的抗体展示噬菌体，因此继续进行淘选过程的第二循环以在噬菌体感染和扩增之前回收还与CD3ε结合的抗体展示噬菌体。为了从噬菌体溶液中去除IdeS蛋白酶，加入40μL辅助噬菌体M13KO7(1.2E+13pfu)和200μL 10％PEG-2.5M NaCl，用TBS稀释沉淀的一组噬菌体以获得噬菌体文库溶液。将500pmol生物素标记的CD3ed-Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液和500μL 8％BSA封闭缓冲液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟。

将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤三次，然后进一步用1mL的TBS洗涤两次。添加含有80μL TBS缓冲液的10unit/μL Fabricator20μL，将珠子在37℃下悬浮30分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。加入5μL的100mg/mL胰蛋白酶和395μL的TBS，并在室温下温育15分钟。将从胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体添加到对数生长期(OD600：0.4-0.7)的大肠杆菌菌株ER2738中。通过在37℃温和旋转培养菌株1小时，用噬菌体感染大肠杆菌菌株。将感染的大肠杆菌接种到225mm×225mm的板上。接下来，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体以回收噬菌体文库溶液。

在MP09的第二轮淘选活动中，将生物素标记的人CD137-Fc用作第一循环淘选抗原，将经过胰蛋白酶洗脱的生物素标记的cyno CD137用作第二循环淘选抗原，如表6所示。

在MP09活动的第3轮和第4轮淘选以及MP11活动的第2轮和第3轮淘选中进行了四重淘选。

在MP09的第3轮淘选和MP11活动的第2轮淘选中，将磁珠在室温下用2％脱脂乳/TBS封闭60分钟或更长时间，并用TBS洗涤3次。将噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟或更长时间，然后回收上清液。将500pmol生物素标记的人IgG1 Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟或更长时间，然后回收上清液。将250pmol生物素标记的人CD137-Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。

在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟。将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤三次，然后进一步用1mL的TBS洗涤两次。使用FabRICATOR(IdeS，用于IgG铰链区的蛋白酶，GENEVIS)(称为IdeS洗脱活动)来回收抗体展示噬菌体。在该过程中，添加含有80μL TBS缓冲液的10unit/μL Fabricator 20μL，将珠子在37℃下悬浮30分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。

为了从噬菌体溶液中去除IdeS蛋白酶，加入40μL辅助噬菌体M13KO7(1.2E+13pfu)和200μL 10％PEG-2.5M NaCl，用TBS稀释沉淀的一组噬菌体以获得噬菌体文库溶液。将250pmol生物素标记的CD3ed-Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液和500μL 8％BSA封闭缓冲液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟。将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤三次，然后进一步用1mL的TBS洗涤两次。添加含有80μL TBS缓冲液的10unit/μL Fabricator 20μL，将珠子在37℃下悬浮30分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。

在四轮选择的第三循环中，加入40μL辅助噬菌体M13KO7(1.2E+13pfu)和200μL10％PEG-2.5M NaCl，用TBS稀释沉淀的一组噬菌体以获得噬菌体文库溶液。将250pmol生物素标记的cyno CD137-Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液和500μL 8％BSA封闭缓冲液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟。将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤三次，然后进一步用1mL的TBS洗涤两次。添加含有80μL TBS缓冲液的10unit/μL Fabricator 20μL，将珠子在37℃下悬浮30分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。

在四轮选择的第四循环中，加入40μL辅助噬菌体M13KO7(1.2E+13pfu)和200μL10％PEG-2.5M NaCl，用TBS稀释沉淀的一组噬菌体以获得噬菌体文库溶液。将500pmol生物素标记的CD3ed-Fc添加到新的磁珠中，并在室温下温育15分钟，然后添加2％脱脂乳/TBS。在室温下封闭60分钟或更长时间后，将磁珠用TBS洗涤3次。将回收的噬菌体溶液和500μL8％BSA封闭缓冲液添加至封闭的磁珠中，并在室温下温育60分钟。

将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)洗涤三次，然后进一步用1mL的TBS洗涤两次。添加含有80μL TBS缓冲液的10unit/μL Fabricator20μL，将珠子在37℃下悬浮30分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。加入5μL的100mg/mL胰蛋白酶和395μL的TBS，并在室温下温育15分钟。将从胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体添加到对数生长期(OD600：0.4-0.7)的大肠杆菌菌株ER2738中。通过在37℃温和旋转培养菌株1小时，用噬菌体感染大肠杆菌菌株。将感染的大肠杆菌接种到225mm×225mm的板上。接下来，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体以回收噬菌体文库溶液。

在MP09的第4轮淘选和MP11活动的第3轮淘选中，将生物素标记的人CD137-Fc用作第一循环抗原，并将生物素标记的cyno CD137-Fc用作第三循环抗原。

3.5.噬菌体展示的Fab结构域与人和cyno CD137的结合(噬菌体ELISA)

通过参考实施例3.2、3.3和3.4中的淘选过程来制备Fab展示噬菌体溶液。首先，将20μg链霉亲和素包被的磁珠MyOne-T1磁珠用包括0.4％封闭Ace，1％BSA,0.02％吐温和0.05％ProClin 300的封闭缓冲液洗涤3次，然后在室温下用该封闭缓冲液封闭60分钟或更长时间。用TBST洗涤一次后，将磁珠施加到96孔板(Corning，3792黑色圆底PS板)的每个孔中，并将0.625pmol生物素标记的人CD137-Fc，生物素标记的cyno CD137-Fc或生物素标记的CD3ε肽添加到磁珠中，并在室温下温育15分钟或更长时间。

用TBST洗涤一次后，将250nL每种Fab展示噬菌体溶液和24.75μL TBS添加到孔中，并将板在室温下静置一小时，以允许各Fab结合至各孔中生物素标记的抗原。然后，将每个孔用TBST洗涤。将用TBS稀释的抗M13(p8)Fab-HRP添加到每个孔中。将板温育10分钟。用TBST洗涤后，将LumiPhos-HRP(Lumigen)加入到每个孔中。2分钟后，检测每个孔的荧光。测量结果示于图11中。

在每个淘选输出噬菌体溶液中观察到与每种抗原、人CD137、cyno CD137和CD3ε的结合。该结果表明，使用碱性洗脱的双轮选择与先前使用IdeS洗脱方法的双轮选择一样有效，并且使用交替淘选的双轮选择也很好地获得了结合三种不同抗原的Fab结构域。尽管这些方法收集了结合三种不同抗原的Fab结构域，但是，与人CD137相比，与cyno CD137的结合仍较弱。另一方面，在MP09或MP11活动中，在同一选择轮点观察到与CD3ε、人CD137和cynoCD137的结合，并且它们与cyno CD137的结合高于其他活动。该结果表明，四轮选择可以更有效地浓缩结合三种不同抗原的Fab结构域。

3.6.具有获得的Fab结构域的IgG的制备

从每个淘选输出池中挑取96个克隆，并分析它们的VH基因序列。选择了32个克隆，因为它们的VH序列在所有分析池中出现了两次以上。通过PCR扩增它们的VH基因并转化为IgG形式。使用与文库中的H链特异性结合的引物(SEQ ID NO：196和197)通过PCR扩增每个克隆的VH片段。将扩增的VH片段整合到已经具有人IgG1CH1-Fc区的动物表达质粒中。所制备的质粒通过参考实施例9的方法用于在动物细胞中表达。这些样品称为克隆转化的IgG。GLS3000用作轻链。

每个淘选输出池的VH基因也被转换成IgG形式。从每个淘选输出池DU05、DS01和MP11的大肠杆菌中制备噬菌粒载体文库，并用NheI和SalI限制酶消化以直接提取VH基因。将提取的VH片段整合到已经具有人IgG1CH1-Fc区的动物表达质粒中。将制备的质粒导入大肠杆菌，并从每个淘选输出池中挑取192或288个菌落，并分析其VH序列。在MP09和11活动中，尽可能地挑取具有不同VH序列的克隆。从每个大肠杆菌菌落制备的质粒通过参考实施例9的方法用于在动物细胞中表达。这些样品称为批量转化的IgG。GLS3000用作轻链。

3.7.评估获得的抗体的CD3ε、人CD137和cyno CD137结合活性

将制备的批量转化的IgG抗体进行ELISA以评估其与CD3ε、人CD137和cyno CD137的结合能力。

首先，在室温下，用含有生物素标记的CD3ε肽、生物素标记的人CD137-Fc或生物素标记的cyno CD137-Fc的20μL TBS包被链霉亲和素包被的微孔板(384孔，Greiner)一个或多个小时。通过用TBST洗涤板的每个孔来去除未与板结合的生物素标记的抗原后，将孔用20μL封闭缓冲液(2％脱脂乳/TBS)封闭一小时或更多小时。从每个孔中除去封闭缓冲液。将20μL用2％脱脂乳/TBS稀释两次的每种含IgG的哺乳动物细胞上清液加到孔中，并将板在室温下静置一小时，以允许每种IgG与每个孔中的生物素标记的抗原结合。然后，将每个孔用TBST洗涤。将用TBS稀释的山羊抗人κ轻链碱性磷酸酶缀合物(BETHYL，A80-115AP)添加到每个孔中。将板温育1小时。用TBST洗涤后，通过添加Blue Phos终止溶液(KPL)终止用BluePhos微孔磷酸酶底物系统(KPL)添加的每个孔中溶液的显色反应。然后，通过在615nm处的吸光度测量显色。测量结果示于图12中。

从每个淘选过程中获得了许多显示出与CD3ε、人CD137和cyno CD137都结合的IgG克隆，因此证明了使用交替淘选的双轮选择，使用碱洗脱的双重选择和四轮选择均按预期工作。特别地，与其他两个淘选条件相比，结合人CD137的来自四轮选择的所有克隆中的大多数显示出相等水平的与cyno-CD137的结合。在那些淘选条件下，可能获得较少显示与CD3ε和人CD137都结合的克隆，这主要是因为在该活动中没有尽可能有意挑取彼此具有相同VH序列的克隆。选择并进一步评估了五十四个克隆，它们显示出与每种蛋白质的更好结合并且彼此具有不同的VH序列。

3.8.纯化的IgG抗体的CD3ε、人CD137和cyno CD137结合活性的评估

评价了纯化的IgG抗体的结合能力。使用了参考实施例3.5中的32个克隆转化的IgG和参考实施例3.6中选择的54个批量转化的IgG。

首先，将20μg链霉亲和素包被的磁珠MyOne-T1珠用包括0.4％封闭Ace，1％BSA,0.02％吐温和0.05％ProClin 300的封闭缓冲液洗涤3次，然后在室温下用该封闭缓冲液封闭60分钟或更长时间。用TBST洗涤一次后，将磁珠施加到白色圆底PS板(Corning，3605)的每个孔中，并将0.625pmol生物素标记的CD3ε肽、2.5pmol生物素标记的人CD137-Fc、2.5pmol生物素标记的cyno CD137-Fc或0.625pmol生物素标记的人Fc添加到磁珠中，并在室温下温育15分钟或更长时间。

用TBST洗涤一次后，将25μL的每种50ng/μL纯化的IgG加入孔中，然后在室温下将板静置一小时，以允许每种IgG与每个孔中的生物素标记的抗原结合。然后将每个孔用TBST洗涤。将用TBS稀释的山羊抗人κ轻链碱性磷酸酶缀合物(BETHYL，A80-115AP)添加到每个孔中。将板温育1小时。用TBST洗涤后，将每个样品转移到96孔板(Corning，3792黑色圆底PS板)中，并向每个孔中添加APS-5(Lumigen)。2分钟后，检测每个孔的荧光。测量结果示于图13中。许多克隆显示出相同水平的与人和cyno CD137的结合，并且还显示出与CD3ε的结合。

3.9.评估具有获得的Fab结构域的IgG同时与CD3ε和人CD137的结合

选择了参考实施例3.7中对CD3ε、人CD137和cyno CD137均显示出明显结合的37种抗体进行进一步评估。还评估了参考实施例2.3中获得的七种抗体(这7个克隆如表7所示重命名)。对纯化的抗体进行ELISA以评估其同时与CD3ε和人CD137结合的能力。参考实施例2.5中描述的命名为B的抗人CD137抗体被用作对照抗体。

[表7]

首先，将20μg链霉亲和素包被的磁珠MyOne-T1珠用包括0.4％封闭Ace，1％BSA，0.02％吐温和0.05％ProClin 300的封闭缓冲液洗涤3次，然后在室温下用该封闭缓冲液封闭60分钟或更长时间。用TBST洗涤一次后，将磁珠施加到黑色圆形底部PS板(Corning，3792)的每个孔中。加入1.25pmol生物素标记的人CD137-Fc，并在室温下温育10分钟。然后用TBS洗涤一次磁珠。将1250ng纯化的IgG与125、12.5或1.25pmol的游离CD3ε肽或TBS混合，然后添加到每个孔的磁珠中，将板在室温下静置一小时，以允许每种IgG与每个孔中的生物素标记的抗原结合。然后将每个孔用TBST洗涤。将用TBS稀释的山羊抗人κ轻链碱性磷酸酶缀合物(BETHYL，A80-115AP)添加到每个孔中。将板温育10分钟。用TBST洗涤后，将APS-5(Lumigen)加入到每个孔中。2分钟后，检测每个孔的荧光。测量结果示于图14和表8中。

[表8]

过量的游离CD3ε肽抑制了除对照抗CD137抗体B以外的所有测试克隆与人CD137的结合，这表明用双Fab文库获得的抗体不同时结合CD3ε和人CD137。

3.10.评估具有针对CD3ε和人CD137的获得的Fab结构域的IgG的人CD137表位

选择参考实施例3.8中的二十一种抗体以进一步评估(表10)。将纯化的抗体进行ELISA以评估其人CD137的结合表位。

为了分析表位，如WO2015/156268中所述，将片段化的人CD137与结构域被Cys-Cys形成的结构分开的抗体的Fc区的融合蛋白称为CRD参考(表9)。片段化的人CD137-Fc融合蛋白包含表9所示的氨基酸序列，通过PCR将编码全长人CD137-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:90)的多核苷酸中的各个基因片段整合到质粒载体中，以通过本领域技术人员已知的方法在动物细胞中表达。通过WO2015/156268中描述的方法将片段化的人CD137-Fc融合蛋白纯化为抗体。

[表9]

首先，将20μg链霉亲和素包被的磁珠MyOne-T1珠用包括0.4％封闭Ace，1％BSA,0.02％吐温和0.05％ProClin 300的封闭缓冲液洗涤3次，然后在室温下用该封闭缓冲液封闭60分钟或更长时间。用TBST洗涤一次后，将磁珠施加到黑色圆形底部PS板(Corning，3792)的每个孔中。加入1.25pmol生物素标记的人CD137-Fc，人CD137结构域1-Fc，人CD137结构域1/2-Fc，人CD137结构域2/3-Fc，人CD137结构域2/3/4-Fc，人CD137结构域3/4-Fc和人Fc并在室温下温育10分钟。然后用TBS洗涤一次磁珠。将1250ng纯化的IgG添加到每个孔的磁珠中，然后将板在室温下静置一小时，以允许每种IgG与每个孔中的生物素标记的抗原结合。然后将每个孔用TBST洗涤。将用TBS稀释的山羊抗人κ轻链碱性磷酸酶缀合物(BETHYL，A80-115AP)添加到每个孔中。将板温育10分钟。用TBST洗涤后，将APS-5(Lumigen)加入到每个孔中。2分钟后，检测每个孔的荧光。测量结果示于图15中。

每个克隆识别人CD137的不同表位结构域。仅识别结构域1/2(例如，dBBDu183，dBBDu205)，识别结构域1/2和结构域2/3(例如，dBBDu193，dBBDu 202，dBBDu222)，识别结构域2/3、2/3/4和3/4(例如，dBBDu139，dBBDu217)，识别广泛的人CD137结构域(dBBDu174)，和不结合每个分离的人CD137结构域(例如dBBDu126)的抗体。该结果表明，使用该设计的文库和双轮选择过程可以获得针对几种人CD137表位的许多双重结合抗体。

通过该ELISA分析无法确定dBBDu126的CD137结合表位区域，但可以猜测，它将识别其中人和食蟹猴具有不同残基的位置，因为dBBDu126不能与食蟹猴CD137交叉反应，如参考实施例2.3所述。如图7所示，人与食蟹猴之间有8个不同的位置，并且通过对cyno CD137/人CD137杂合分子的结合测定和结合复合物的晶体结构分析，75E(人体内75G)被鉴定为干扰dBBDu126结合cyno CD137的诱因。晶体结构还显示，dBBDu126主要识别人CD137的CRD3区。

[表10]

[参考实施例4]用设计的轻链文库对来自双Fab文库的结合CD3ε和人CD137的抗体结构域的亲和力成熟

4.1.用获得的重链构建轻链文库

在参考实施例3中获得了许多与CD3ε和人CD137都结合的抗体，但是它们对人CD137的亲和力仍然很弱，因此进行了亲和力成熟以改善其亲和力。

选择了13个VH序列：dBBDu_179、183、196、197、199、204、205、167、186、189、191、193和222进行亲和力成熟。其中，dBBDu_179、183、196、197、199、204和205具有相同的CDR3序列和不同的CDR1或2序列，因此将这7种噬菌粒混合以产生轻链Fab文库。尽管它们具有不同的CDR3序列，也将dBBDu_191、193和222三种噬菌粒混合以产生轻链Fab文库。轻链文库的清单示于表11中。

[表11]

用SEQ ID NO：198和199的引物通过PCR方法扩增参考实施例12中描述的合成的抗体VL文库片段。用SfiI和KpnI限制酶消化扩增的VL片段，并将其引入各自具有13个VH片段的噬菌粒载体中。通过电穿孔将构建的用于噬菌体展示的噬菌粒转移到大肠杆菌中以制备含有抗体文库片段的大肠杆菌。

通过感染编码FkpA伴侣基因的辅助噬菌体M13KO7TC/FkpA，然后在25℃下与0.002％的阿拉伯糖一起温育过夜，由含有构建的噬菌粒的大肠杆菌产生展示Fab结构域的噬菌体文库。M13KO7TC是一种辅助噬菌体，其在辅助噬菌体的pIII蛋白的N2结构域和CT结构域之间具有胰蛋白酶切割序列的插入片段(参见日本专利申请公开号2002-514413)。在其他地方已经公开了将插入基因导入M13KO7TC基因(参见WO2015/046554)。

4.2.通过双轮选择获得结合CD3ε和人CD137的Fab结构域

从参考实施例4.1中构建的双Fab文库中鉴定了结合CD3ε、人CD137和cyno CD137的Fab结构域。通过二硫键接头生物素标记的CD3ε肽抗原(C3NP1-27)，与人IgG1 Fc片段融合的生物素标记的人CD137(命名为人CD137-Fc)以及与人IgG1 Fc片段融合的生物素标记的食蟹猴CD137(命名为cyno CD137-Fc)用作抗原。

从携带构建的噬菌粒的大肠杆菌制备噬菌体用于噬菌体展示。将2.5M NaCl/10％PEG添加到已经产生噬菌体的大肠杆菌的培养液中，并且将如此沉淀的一组噬菌体用TBS稀释以获得噬菌体文库溶液。接下来，将BSA(最终浓度：4％)加入到噬菌体文库溶液中。淘选方法参照使用固定在磁珠上的抗原的一般淘选方法来进行(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2)，2-9；J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2)，191-203；Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20；和Mol.Cell Proteomics(2003)2(2)，61-9)。所用的磁珠是NeutrAvidin包被的磁珠(NeutrAvidin包被的Sera-Mag SpeedBeads)或链霉亲和素包被的磁珠(DynabeadsM-280 Streptavidin)。

具体地，将噬菌体溶液与100pmol的人CD137-Fc和4nmol的游离人IgG1Fc结构域混合，并在室温下温育60分钟。在室温下，用具有游离的链霉亲和素的2％脱脂乳/TBS(Roche)封闭磁珠60分钟以上，并用TBS洗涤3次，然后与温育的噬菌体溶液混合。在室温下温育15分钟后，将珠子用TBST(含有0.1％吐温20的TBS；TBS可从Takara Bio Inc.获得)10分钟洗涤3次，然后进一步用1mL TBS 10分钟洗涤两次。使用FabRICATOR(IdeS，用于IgG铰链区的蛋白酶，GENEVIS)(称为IdeS洗脱活动)来回收抗体展示噬菌体。

在该过程中，添加含有80μL TBS缓冲液的10unit/μL Fabricator 20μL，将珠子在37℃下悬浮30分钟，然后立即用磁力架分离珠子以回收噬菌体溶液。加入5μL的100mg/mL胰蛋白酶和400μL的TBS，并在室温下温育15分钟。将回收的噬菌体溶液添加到对数生长期(OD600：0.4-0.5)的大肠杆菌菌株ER2738中。通过在37℃温和旋转培养菌株1小时，用噬菌体感染大肠杆菌菌株。将感染的大肠杆菌接种到225mm×225mm的板上。接下来，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体以制备噬菌体文库溶液。

在第一轮淘选过程中，结合人CD137的抗体展示噬菌体被浓缩。在第二轮淘选中，将160pmol的C3NP1-27用作生物素标记的抗原，并用TBST 2分钟洗涤7次，然后用TBS 2分钟洗涤3次。在室温下用25mM DTT洗脱15分钟，然后用胰蛋白酶消化。

在第三轮淘选中，将16或80pmol生物素标记的cyno CD137-Fc用作抗原，并用TBST10分钟洗涤7次，然后用TBS 10分钟洗涤3次。与第1轮一样，使用IdeS进行洗脱。

在第四轮淘选中，将16或80pmol生物素标记的人CD137-Fc用作抗原，并用TBST 10分钟洗涤7次，然后用TBS 10分钟洗涤3次。与第1轮一样，使用IdeS进行洗脱。

4.3.具有获得的Fab结构域的IgG与人CD137和cyno CD137的结合

每个淘选输出池的Fab基因也被转换成IgG形式。将制备的哺乳动物表达质粒导入大肠杆菌，并从每个淘选输出池中挑取96个菌落，并分析其VH和VL序列。文库2中的大多数VH序列已集中到dBBDu_183，而文库6中的大多数VH序列已集中到dBBDu_193。从每个大肠杆菌菌落制备的质粒通过参考实施例9的方法用于在动物细胞中表达。

将制备的IgG抗体进行ELISA以评估其与CD3ε、人CD137和cyno CD137的结合能力。

首先，在室温下，用含有生物素标记的CD3ε肽、生物素标记的人CD137-Fc或生物素标记的cyno CD137-Fc的20μL TBS包被链霉亲和素包被的微孔板(384孔，Greiner)。通过用TBST洗涤板的每个孔来去除未与板结合的生物素标记的抗原后，将孔用20μL封闭缓冲液(2％脱脂乳/TBS)封闭一小时或更多小时。从每个孔中除去封闭缓冲液。将20μL用1％脱脂乳/TBS稀释两次的每种10ng/μL含IgG的哺乳动物细胞上清液加到孔中，并将板在室温下静置一小时，以允许每种IgG与每个孔中的生物素标记的抗原结合。然后将每个孔用TBST洗涤。将用TBS稀释的山羊抗人κ轻链碱性磷酸酶缀合物(BETHYL，A80-115AP)添加到每个孔中。将板温育1小时。用TBST洗涤后，通过添加Blue Phos终止溶液(KPL)终止用Blue Phos微孔磷酸酶底物系统(KPL)加入的每个孔中溶液的显色反应。然后，通过在615nm处的吸光度测量显色。测量结果示于图16中。

从每个淘选过程中获得了许多显示出与CD3ε、人CD137和cyno CD137都结合的IgG克隆。选择表现出更好结合的九十六个克隆并进一步评估。

4.4.评估具有获得的Fab结构域的IgG同时与CD3ε和人CD137的结合

选择在参考实施例4.3中显示出与CD3ε、人CD137和cyno CD137明显结合的九十六种抗体以进一步评估。对纯化的抗体进行ELISA以评估其同时与CD3ε和人CD137结合的能力。

首先，将20μg链霉亲和素包被的磁珠MyOne-T1磁珠用包括0.5x封闭Ace，0.02％吐温和0.05％ProClin 300的封闭缓冲液洗涤3次，然后在室温下用该封闭缓冲液封闭60分钟或更长时间。用TBST洗涤一次后，将磁珠施加到黑色圆形底部PS板(Corning，3792)的每个孔中。加入0.625pmol生物素标记的人CD137-Fc，并在室温下温育10分钟。然后用TBST洗涤一次磁珠。将250ng纯化的IgG与62.5、6.25或0.625pmol的游离CD3ε或62.5pmol的游离人IgG1 Fc结构域混合，然后添加到每个孔的磁珠中，将板在室温下静置一小时，以允许每种IgG与每个孔中的生物素标记的抗原结合。然后将每个孔用TBST洗涤。将用TBS稀释的山羊抗人κ轻链碱性磷酸酶缀合物(BETHYL，A80-115AP)添加到每个孔中。将板温育10分钟。用TBST洗涤后，将APS-5(Lumigen)加入到每个孔中。2分钟后，检测每个孔的荧光。测量结果示于图17和表12中。过量的游离CD3ε肽抑制了大多数测试克隆与人CD137的结合，这表明用双Fab文库获得的抗体不同时结合CD3ε和人CD137。

[表12]

4.5.评估具有获得的Fab结构域的IgG与CD3ε、人CD137和cyno CD137的结合

使用Biacore T200确认了参考实施例4.4中获得的每种IgG与人CD3ed、人CD137和cyno CD137的结合。通过参考实施例4.4中的结果选择了十六种抗体。通过胺偶联在传感器芯片CM3(GE Healthcare)上固定适量的确定蛋白A(GE Healthcare)。所选抗体被芯片捕获以允许与作为抗原的人CD3ed、人CD137和cyno CD137相互作用。使用的运行缓冲液为20mmol/l ACES，150mmol/l NaCl，0.05％(w/v)吐温20，pH 7.4。所有测量均在25℃下进行。使用运行缓冲液稀释抗原。

对于人CD137，评估了所选抗体在4000、1000、250、62.5和15.6nM抗原浓度下的结合。将稀释的抗原溶液和为空白的运行缓冲液以30μL/min的流速加载180秒，以使每种浓度的抗原都能与捕获在传感器芯片上的抗体相互作用。然后，运行缓冲液以30μL/min的流速运行300秒，并观察抗原与抗体的解离。接下来，为了再生传感器芯片，以30μL/min的流速加载10mmol/L pH 1.5的甘氨酸HCl 10秒，以30micro L/min的流速加载50mmol/L NaOH 10秒。

对于cyno CD137，评估了所选抗体在4000、1000和250nM抗原浓度下的结合。将稀释的抗原溶液和为空白的运行缓冲液以30μL/min的流速加载180秒，以允许每种抗原都与捕获在传感器芯片上的抗体相互作用。然后，运行缓冲液以30μL/min的流速运行300秒，并观察抗原与抗体的解离。接下来，为了再生传感器芯片，以30μL/min的流速加载10mmol/LpH 1.5的甘氨酸HCl 10秒，以30micro L/min的流速加载50mmol/L NaOH10秒。

对于人CD3ed，评估了所选抗体在1000、250和62.5nM抗原浓度下的结合。将稀释的抗原溶液和为空白的运行缓冲液以30μL/min的流速加载120秒，以允许每种抗原都与捕获在传感器芯片上的抗体相互作用。然后，运行缓冲液以30μL/min的流速运行180秒，并观察抗原与抗体的解离。接下来，为了再生传感器芯片，以30μL/min的流速加载10mmol/L pH1.5的甘氨酸HCl 30秒，以30micro L/min的流速加载50mmol/L NaOH 30秒。

基于通过测量获得的传感图计算了动力学参数，例如缔合速率常数ka(1/Ms)和离解速率常数kd(1/s)。由这些常数算出解离常数KD(M)。使用Biacore T200评估软件(GEHealthcare)计算每个参数。结果示于表13中。

[表13]

[参考实施例5]抗人GPC3/双Fab三特异性抗体的制备及其人CD137激动剂活性的评估

5.1.抗人GPC3/抗人CD137双特异性抗体和抗人GPC3/双Fab三特异性抗体的制备

通过以下过程制备带有人IgG1恒定区的抗人GPC3/抗人CD137双特异性抗体和抗人GPC3/双Fab三特异性抗体。将WO2005/035584A1中描述的编码抗人CD137抗体(H链为SEQID NO:93，L链为SEQ ID NO:94)(缩写为B)的基因用作对照抗体。这些抗体的抗人GPC3侧共有重链可变区H0000(SEQ ID NO:139)和轻链可变区GL4(SEQ ID NO:140)。

参考实施例4和表13中所述的十六种双重Ig Fab用作候选双重Ig抗体。对于这些分子，使用由Schaefer等人(Schaefer，Proc.Natl.Acad.Sci.，2011，108，11187-11192)报告的CrossMab技术来调节H和L链之间的缔合并有效地获得双特异性抗体。更具体地，这些分子是通过将Fab的VH和VL结构域与人GPC3交换而产生的。为了促进异源缔合，将Knobs-into-Holes技术用于抗体H链的恒定区。Knobs-into-Holes技术是这样一种技术，其通过用一条较大的侧链(旋钮)取代一条H链的CH3区中存在的氨基酸侧链并用较小的侧链(孔)取代另一条H链的CH3区域中的氨基酸侧链以便将旋钮放入孔中来促进H链的异二聚化，从而能够制备目的异二聚化抗体(Burmeister，Nature，1994，372，379-383)。

在下文中，已经引入了旋钮修饰的恒定区将被表示为Kn，并且已经引入了孔修饰的恒定区将被表示为H1。此外，WO2011/108714中描述的修饰用于减少Fcγ结合。具体地，引入了用Ala替换234、235和297位(EU编号)氨基酸的修饰。从抗体H链的C末端去除446位的Gly和447位的Lys(EU编号)。组氨酸标签被添加到Kn Fc区域的C末端，并且FLAG标签被添加到H1 Fc区域的C末端。通过引入上述修饰制备的抗人GPC3 H链为GC33(2)H-G1dKnHS(SEQID NO:141)。制备的抗人CD137 H链是BVH-G1dHIFS(SEQ ID NO:142)。抗体L链GC33(2)L-k0(SEQ ID NO:143)和BVL-k0(SEQ ID NO:144)通常分别用在抗人GPC3侧和抗CD137侧。双抗体的H链和L链也显示在表13中。每个双抗体克隆的VH融合到G1dHIFS(SEQ ID NO:156)CH区，每个双抗体克隆的VL融合到k0(SEQ ID NO:157)CL区域,与BVH-G1dHIFS和BVL-k0相同。表达具有表15所示组合的抗体以获得目的双特异性抗体。具有接收到

5.2.评估抗人GPC3/双Fab三特异性抗体的体外GPC3依赖性CD137激动剂作用

使用ELISA试剂盒(R&D systems，DY206)，根据细胞因子的产生来评估对人CD137的激动活性。为了避免抗人GPC3/双Fab抗体的CD3ε结合结构域的作用，使用了B细胞株HDLM-2，其既不表达CD3ε也不表达GPC3，而是组成性地表达CD137。HDLM-2以8×10

结果(图18和表14)，八种抗GPC3/双Fab抗体中的七种以及抗GPC3/抗CD137抗体取决于抗体浓度显示HDLM-2产生的IL-6活化。在表14中，与Ctrl相比的激动活性是指在存在Ctrl的情况下，hIL-6分泌的增加水平超过了背景水平。基于该结果，认为这些双Fab抗体对人CD137具有激动活性。

[表14]

[参考实施例6]抗人GPC3/双Fab三特异性抗体的人CD3ε激动剂活性的评估

6.1.抗人GPC3/抗人CD3ε双特异性抗体和抗人GPC3/双Fab三特异性抗体的制备

在参考实施例5.1中制备了带有人IgG1恒定区的抗人GPC3/Ctrl双特异性抗体和抗人GPC3/双Fab三特异性抗体，还制备了抗人GPC3/抗人CD3ε双特异性抗体作为相同构建体。参考实施例10中制备的CE115VH(SEQ ID NO145)和CE115VL(SEQ ID NO146)用于抗人CD3ε抗体重链和轻链。抗体具有表15中所示组合。这些抗体通过在FreeStyle293细胞(Invitrogen)中瞬时表达而表达，并根据“参考实施例9”纯化。

[表15]

6.2.评估抗人GPC3/双Fab三特异性抗体的体外GPC3依赖性CD3激动剂作用

通过使用GloResponseTM NFAT-luc2 Jurkat细胞系(Promega，CS#176401)作为效应细胞来评估对人CD3的激动活性。Jurkat细胞是源自人急性T细胞白血病的人T淋巴细胞的永生细胞系，它在自身上表达人CD3。在NFAT luc2_jurkat细胞中，萤光素酶的表达是由CD3激活信号诱导的。将在细胞膜上表达人GPC3的SK-pca60细胞系(参考实施例13)用作靶细胞。

将5.00E+03个SK-pca60细胞(靶细胞)和3.00E+04个NFAT-luc2 Jurkat细胞(效应细胞)均添加到白底的96孔测定板(Costar，3917)的每个孔中，然后在每个孔中加入10μL浓度为0.1、1或10mg/L的每种抗体，并在5％二氧化碳的存在下于37℃温育24小时。根据所附说明，用Bio-Glo萤光素酶测定系统(Promega，G7940)检测表达的萤光素酶。2104 EnVIsion用于检测。结果示于图19中。

大多数Dual Fab克隆均显示出明显的CD3ε激动剂活性，其中一些克隆显示出与CE115抗人CD3ε抗体相同水平的活性。这表明，将CD137结合活性添加到双Fab结构域中不会诱导CD3ε激动剂活性的丧失，而且双Fab结构域不仅显示出与两种不同抗原(人CD3ε和CD137)的结合，而且还显示仅通过一个结构域的人CD3ε和CD137的激动剂活性。

一些具有重链dBBDu_186的双Fab结构域显示出比其他的更弱的CD3ε激动剂活性。在参考实施例4.5中的biacore分析中，这些抗体也显示出对人CD3ε的较弱亲和力。这证明了来自该Dual Fab文库的双Fab的CD3ε激动剂活性仅取决于其与人CD3ε的亲和力，这意味着该文库设计中保留了CD3ε激动剂活性。

[参考实施例7]在PBMC T细胞细胞因子释放测定中评估双Fab抗体的人CD3ε/人CD137协同活性。

7.1.抗体制备

将WO2005/035584A1中描述的抗CD137抗体(缩写为B)，参考实施例5.1中描述的Ctrl抗体和参考实施例7中描述的抗CD3εCE115抗体用作单一抗原特异性对照。选择表13中描述的双Fab，H183L072(重链：SEQ ID NO:104，轻链：SEQ ID NO:124)用于进一步评估，并通过在FreeStyle293细胞(Invitrogen)中瞬时表达来表达，并根据“参考实施例9”进行纯化。

7.2.PBMC T细胞测定

为了研究双Fab抗体对CD3ε和CD137活化的协同作用，使用细胞计数珠阵列(CBA)人Th1/T2细胞因子试剂盒II(BD Biosciences#551809)评估了总细胞因子释放。关于CD137活化，评估了T细胞的IL-2(白介素2)、IFNγ(干扰素γ)和TNFα(肿瘤坏死因子-α)，从冷冻购买(STEMCELL)的冷冻人外周血单核细胞(PBMC)中分离了所述T细胞。

7.2.1.冷冻人PBMC的制备和T细胞的分离

将含有PBMC的冷冻小瓶置于37℃的水浴中以解冻细胞。然后将细胞分配到含有9mL培养基(用于培养靶细胞的培养基)的15mL falcon管中。然后将细胞悬液在室温下以1200rpm离心5分钟。轻轻吸出上清液，加入新鲜的温热培养基进行重悬并用作人PBMC溶液。按照制造商的说明，使用Dynabeads Untouched人T细胞试剂盒(Invitrogen#11344D)分离T细胞。

7.2.2.细胞因子释放测定

将参考实施例7.1中制备的30μg/mL和10μg/mL的抗体在maxisorp 96孔板(Thermofisher#442404)上包被过夜。将1.00E+05个T细胞添加到每个含有抗体的孔中，并在37℃下温育72小时。将板以1200rpm离心5分钟，并收集上清液。根据制造商的说明进行CBA，结果示于图20中。

仅双Fab H183L072抗体显示T细胞分泌IL-2。单独的抗CD137(B)和抗CD3ε抗体(CE115)都不能导致从T细胞诱导IL-2。此外，单独的抗CD137抗体不会导致检测到任何细胞因子。与抗CD3ε抗体相比，双Fab抗体导致TNFα水平增加和IFNγ的相似分泌。这些结果表明，双Fab抗体可以引起CD3ε和CD137的协同活化，用于T细胞的功能活化。

[参考实施例8]抗GPC3/双Fab三特异性抗体的细胞毒性的评估。

8.1.抗GPC3/双Fab和抗GPC3/CD137双特异性抗体的制备

使用参考实施例6中所述的抗GPC3或Ctrl抗体以及双Fab(H183L072)或抗CD137抗体来生成四种抗体，根据(Proc Natl Acad Sci U S A.2013Mar26；110(13)：5145-5150)中所述的方法使用Fab-臂交换(FAE)的抗GPC3/双Fab，抗GPC3/CD137，Ctrl/H183L072和Ctrl/CD137抗体。所有四种抗体的分子形式与常规IgG的分子形式相同。抗GPC3/H183L072是能够结合GPC3、CD3和CD137的三特异性抗体，抗GPC3/CD137是能够结合GPC3和CD137的双特异性抗体，Ctrl/H183L072和Ctrl/CD137被用作对照。生成的所有四种抗体均由对Fcγ受体亲和力减弱的沉默Fc组成。

8.2.T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)分析

如参考实施例10.5.2中所述，使用xCELLigence实时细胞分析仪(RocheDiagnostics)通过细胞生长抑制率评估细胞毒活性。将表达GPC3的1.00E+04个SK-pca60或SK-pca13a(均为表达GPC3的转染细胞系)用作靶(简称为T)细胞(分别为参考实施例13和10)，并与如参考实施例7.2.1所述制备的5.00E+04个冷冻人PBMC效应(简称为E)细胞共同培养。这意味着在肿瘤细胞上添加了5倍量的效应细胞，因此这里将其描述为ET 5。每个孔以0.4、5和10nM添加抗GPC3/H183L072抗体和GPC3/CD137抗体，而以10nM添加Ctrl/H183L072抗体和Ctrl/CD137抗体。细胞因子活性的测量与参考实施例10.5.2中所述类似地进行。反应在37℃在5％二氧化碳气体的条件下进行。在添加PBMC 72小时后，使用参考实施例10.5.2中所述的方程确定细胞生长抑制(CGI)率(％)，并且如图21所示绘制在图中。在参考实施例6.2中显示了Jurkat细胞上的CD3活化的抗GPC3/H183L072双Fab抗体，而不是未显示CD3活化的对照/H183L072双Fab抗体和抗GPC3/CD137抗体,在两种靶细胞系中在所有浓度下均导致表达GPC3的细胞具有强的细胞毒活性，这表明双Fab三特异性抗体可导致细胞毒活性。

[参考实施例9]抗体表达载体的制备以及抗体的表达和纯化

使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene Corp.)，PCR或In fusionAdvantage PCR克隆试剂盒(Takara Bio Inc.)等，通过本领域技术人员通常已知的方法进行氨基酸取代或IgG转化，以构建表达载体。通过本领域技术人员通常已知的方法对获得的表达载体进行测序。将制备的质粒瞬时转移至人胚胎肾癌细胞衍生的HEK293H细胞系(Invitrogen Corp.)或FreeStyle293细胞(Invitrogen Corp.)以表达抗体。使用rProteinA Sepharose TM Fast Flow(GE Healthcare Japan Corp.)，通过本领域技术人员通常已知的方法从获得的培养上清液中纯化每种抗体。至于纯化抗体的浓度，使用分光光度计在280nm处测量吸光度，并且使用消光系数来计算抗体浓度，所述消光系数由通过PACE获得的值计算(Protein Science 1995；4：2411-2423)。

[参考实施例10]抗人和抗食蟹猴CD3ε抗体CE115的制备

10.1.使用由表达人CD3的细胞和表达食蟹猕猴CD3细胞免疫的大鼠制备杂交瘤

用表达人CD3εγ或食蟹猴CD3εγ的Ba/F3细胞如下免疫每只SD大鼠(雌性，免疫开始时为6周龄，Charles River Laboratories Japan,Inc.)：在第0天(将引发日期定义为第0天)，将5×10

融合后的第二天，(1)将融合细胞悬浮在半流体培养基(Stemcell Technologies，Inc.)中。杂交瘤被选择性地培养并且也被定殖。

融合九天或十天后，挑取杂交瘤细胞集落并以1个集落/孔接种到含有HAT选择性培养基(10％FBS/RPMI1640、2vol％HAT 50x浓缩液(Sumitomo Dainippon Pharma Co.,Ltd.)和5vol％BM-Condimed H1(Roche Diagnostics K.K.))的96孔板中。培养3-4天后，回收每个孔中的培养上清液，并测量培养上清液中的大鼠IgG浓度。使用表达人CD3εγ的贴壁Ba/F3细胞或不表达人CD3εγ的贴壁Ba/F3细胞，通过细胞ELISA筛选确认含有大鼠IgG的培养上清液，以筛选出产生特异性结合人CD3εγ的抗体的克隆(图22)。还使用表达食蟹猴CD3εγ的贴壁Ba/F3细胞，通过细胞ELISA评估了该克隆与猴CD3εγ的交叉反应性(图22)。

10.2.抗人和抗猴CD3ε嵌合抗体的制备

使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen N.V.)从每种杂交瘤细胞中提取总RNA，并使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences)合成cDNA。所制备的cDNA用于PCR以将抗体可变区基因插入克隆载体。根据其中包含的使用说明书中描述的方法，使用BigDye终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Inc.)和DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNASequencer(Applied Biosystems，Inc.)确定每个DNA片段的核苷酸序列。根据Kabat编号确定CE115H链可变结构域(SEQ ID NO:162)和CE115L链可变结构域(SEQ ID NO:163)的CDR和FR。

编码包含与人抗体IgG1链恒定结构域连接的大鼠抗体H链可变结构域的嵌合抗体H链的基因，以及编码包含与人抗体κ链恒定结构域连接的大鼠抗体L链可变结构域的嵌合抗体L链的基因被整合到动物细胞的表达载体中。所制备的表达载体用于CE115嵌合抗体的表达和纯化(参考实施例9)。

10.3.EGFR_ERY22_CE115的制备

接下来，将针对癌抗原(EGFR)的IgG用作骨架，以一个Fab被替换为CD3ε-结合结构域的形式制备分子。在该操作中，与上述情况一样，使用对FcgR(Fcγ受体)的结合活性减弱的沉默Fc作为骨架IgG的Fc。构成西妥昔单抗(cetuximab)可变区的西妥昔单抗-VH(SEQ IDNO:164)和西妥昔单抗-VL(SEQ ID NO:165)用作EGFR结合结构域。通过缺失C末端Gly和Lys而由IgG1衍生的G1d，通过引入D356K和H435R突变而由G1d衍生的A5和通过引入K439E突变而由G1d衍生的B3被用作抗体H链恒定结构域，并且根据参考实施例9的方法各自与西妥昔单抗-VH组合以制备西妥昔单抗-VH-G1d(SEQ ID NO:166)，西妥昔单抗-VH-A5(SEQ ID NO:167)和西妥昔单抗-VH-B3(SEQ ID NO:168)。当将抗体H链恒定结构域命名为H1时，对应于具有西妥昔单抗-VH作为可变域的抗体H链的序列由西妥昔单抗-VH-H1表示。

在本上下文中，氨基酸的改变由例如D356K表示。第一个字母(对应于D356K中的D)是指代表变化前氨基酸残基的单字母代码的字母。字母后的数字(对应于D356K中的356)表示此变化残基的EU编号位置。最后一个字母(对应于D356K中的K)是指代表变化后氨基酸残基的单字母代码的字母。

通过针对EGFR的Fab的VH结构域和VL结构域之间的交换制备EGFR_ERY22_CE115(图23)。具体地，使用本领域技术人员通常已知的方法，例如PCR，使用以与前述方法相同的方式添加了适当序列的引物，制备了具有编码EGFR ERY22_Hk(SEQ ID NO:169)，EGFRERY22_L(SEQ ID NO:170)，CE115_ERY22_Hh(SEQ ID NO:171)或CE115_ERY22_L(SEQ IDNO:172)的各个多核苷酸的插入序列的一系列表达载体。

将表达载体按以下组合转移至FreeStyle 293-F细胞，其中每个目标分子均被瞬时表达：

目标分子：EGFR_ERY22_CE115

由插入表达载体中的多核苷酸编码的多肽：EGFR ERY22_Hk，EGFR ERY22_L，CE115_ERY22_Hh和CE115_ERY22_L

10.4.EGFR_ERY22_CE115的纯化

将获得的培养上清液添加至Anti FLAG M2柱(Sigma-Aldrich Corp.)，洗涤该柱，然后用0.1mg/mL FLAG肽(Sigma-Aldrich Corp.)洗脱。将含有目标分子的级分加入HisTrap HP柱(GE Healthcare Japan Corp.)，洗涤该柱，然后用浓度梯度的咪唑洗脱。通过超滤浓缩含有目标分子的级分。然后，将该级分加入Superdex 200柱(GE HealthcareJapan Corp.)。从洗脱液中仅回收单体级分以获得每个纯化的目标分子。

10.5.使用人外周血单核细胞测量细胞毒活性

10.5.1.人外周血单核细胞(PBMC)溶液的制备

使用预填充有100μL的1,000单位/mL肝素溶液(用于注射的Novo-Heparin 5,000单位，Novo Nordisk A/S)的注射器，从每个健康志愿者(成人)中收集50mL外周血。外周血用PBS(-)稀释2倍，然后分成四个等份，然后将其添加到预填充有15mL Ficoll-Paque PLUS并预先离心的Leucosep淋巴细胞分离管(目录号227290，Greiner Bio-One GmbH)中。将分离管离心(2,150rpm，10分钟，室温)后，分离单核细胞级分层。用含有10％FBS的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(Sigma-Aldrich Corp.；下文称为10％FBS/D-MEM)洗涤一次单核细胞级分中的细胞。然后，用10％FBS/D-MEM将细胞调节至4×10

10.5.2.细胞毒活性的测量

使用xCELLigence实时细胞分析仪(Roche Diagnostics)根据细胞生长抑制率评估细胞毒活性。使用的靶细胞是通过迫使SK-HEP-1细胞系表达人EGFR而建立的SK-pca13a细胞系。将SK-pca13a从培养皿中解离并以100μL/孔(1×10

细胞生长抑制率(％)＝(A-B)×100/(A-1)，其中

A代表未补充抗体(仅靶细胞和人PBMC)的孔的平均细胞指数值，B代表补充有每种抗体的孔的平均细胞指数值。该测试一式三份进行。

用由人血制备的PBMC作为效应细胞，测定了含有CE115的EGFR_ERY22_CE115的细胞毒活性。结果，证实了非常强的活性(图24)。

[参考实施例11]用于制备结合CD3和第二抗原的抗体的抗体改变

11.1.能够结合第二抗原的肽的插入位点和长度的研究

进行了研究以获得能够通过一个可变区(Fab)结合癌抗原并且通过另一个可变区结合第一抗原CD3和第二抗原，但不能同时结合CD3和第二抗原的双结合Fab分子。根据参考实施例9，将GGS肽插入CD3ε结合抗体CE115的重链环上，以制备每个在一个Fab中具有EGFR结合结构域，在另一个Fab中具有CD3结合结构域的异二聚化抗体。

具体地，制备了在CDR2的K52B和S52c之间插入了GGS的EGFR ERY22_Hk/EGFRERY22_L/CE115_CE31 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:169/170/173/172)，在该位置插入了GGSGGS肽(SEQ ID NO:175)的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE32ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:169/170/174/172)，以及在该位置插入了GGSGGSGGS肽(SEQ IDNO:177)的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE33 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(SEQ IDNO:169/170/176/172)。同样，制备了在FR3的G72和D73(环)之间插入了GGS的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE34ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:169/170/178/172)，在该位置插入了GGSGGS肽(SEQ ID NO:175)的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE35ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:169/170/179/172)，以及在该位置插入了GGSGGSGGS肽(SEQ ID NO:177)的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE36ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:169/170/180/172)。此外，制备了在CDR3的A99和Y100之间插入了GGS的EGFRERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE37 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:169/170/181/172)，在该位置插入了GGSGGS肽的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE38 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:169/170/182/172)，以及在该位置插入了GGSGGSGGS肽的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE39 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(SEQ ID NO:169/170/183/172)。

11.2.确认插入了GGS肽的CE115抗体与CD3ε的结合

使用Biacore T100确认了每种制备的抗体对CD3ε的结合活性。通过链霉亲和素将生物素化的CD3ε表位肽固定在CM5芯片上，并将所制备的抗体作为分析物注入其中，并分析其结合亲和力。

结果示于表16中。CE35、CE36、CE37、CE38和CE39对CD3ε的结合亲和力等同于亲本抗体CE115。这表明可以将结合第二抗原的肽插入其环中。在插入了GGGSGGSGS的CE36或CE39中，结合亲和力没有降低。这表明向这些位点插入多达至少9个氨基酸的肽不会影响针对CD3ε的结合活性。

[表16]

这些结果表明，可以通过使用这种插入了肽的CE115获得结合第二抗原的抗体，以制备能够结合CD3和第二抗原但不同时结合这些抗原的抗体。

在该上下文中，可以通过以下步骤制备文库：根据本领域已知的方法，例如定点诱变(Kunkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)82,488-492)或重叠延伸PCR，随机改变用于插入或取代的肽的氨基酸序列，并比较根据上述方法的每种变化形式的结合活性等，以确定即使改变了氨基酸序列以及该位点氨基酸的类型和长度后仍允许发挥目标活性的插入或取代位点。

[参考实施例12]用于获得结合CD3和第二抗原的抗体的文库设计

12.1.用于获得结合CD3和第二抗原的抗体的抗体文库(也称为双Fab文库)

在选择CD3(CD3ε)作为第一抗原的情况下，获得结合CD3(CD3ε)和任意第二抗原的抗体的方法的实例包括以下6种方法：

1.一种方法，其涉及将结合第二抗原的肽或多肽插入结合第一抗原的Fab结构域(该方法包括WO2016076345A1中的实施例3或4所示的肽插入,或Angew Chem Int EdEngl.2013 Aug 5；52(32)：8295-8)中说明的G-CSF插入方法)，其中结合肽或多肽可以从肽或多肽展示文库中获得,或者可以使用天然蛋白质的全部或一部分；

2.一种方法，其涉及制备抗体文库，使得各种氨基酸出现允许改变如WO2016076345A1中的实施例5所示Fab环的更大长度(延伸)的位置，并通过将对抗原的结合活性用作指标,从抗体文库获得具有针对任意第二抗原的结合活性的Fab；

3.一种方法，其涉及通过使用从先前已知结合CD3的Fab结构域通过定点诱变制备的抗体来鉴定保持对CD3的结合活性的氨基酸，并通过将对抗原的结合活性用作指标,从出现鉴定的氨基酸的抗体文库中获得对任意第二抗原具有结合活性的Fab；

4.方法3，其进一步涉及制备抗体文库，使得各种氨基酸出现允许改变Fab环的更大长度(延伸)的位置，并通过将对抗原的结合活性用作指标,从抗体文库获得对任意第二抗原具有结合活性的Fab：

5.方法1、2、3或4，其进一步涉及改变抗体，使得糖基化序列(例如，NxS和NxT，其中x是除P以外的氨基酸)添加到由糖链受体识别的糖链(例如，高甘露糖型糖链被添加到其中，并因此被高甘露糖受体识别；已知高甘露糖型糖链是通过在抗体表达时添加kifunensine而获得的(mAbs.2012 Jul-Aug；4(4):475-87))；以及

6.方法1、2、3或4，其进一步涉及通过插入Cys、Lys或非天然氨基酸，通过共价键将各自结合第二抗原的结构域(多肽，糖链和以TLR激动剂为代表的核酸)添加到发现可以改变为各种氨基酸的环或位点，或将这些位点替换为Cys、Lys或非天然氨基酸(此方法以抗体药物缀合物为代表，是通过共价键与Cys、Lys或非天然氨基酸缀合的方法(描述于mAbs 6：1,34-45；2014年1月/2月；WO2009/134891 A2；和Bioconjug Chem.2014年2月19日；25(2)：351-61)。

结合第一抗原和第二抗原但不同时结合这些抗原的双重结合Fab是通过使用这些方法中的任何一种获得的，并且可以通过本领域技术人员通常已知的方法，例如常见的L链、CrossMab或Fab臂交换，与结合任意第三抗原的结构域组合。

12.2.利用定点诱变制备CD3(CD3ε)结合抗体的单氨基酸改变抗体

选择VH结构域CE115HA000(SEQ ID NO:184)和VL结构域GLS3000(SEQ ID NO:185)作为CD3(CD3ε)结合抗体的模板序列。根据参考实施例9，对每个结构域在推测参与抗原结合的位点进行氨基酸改变。此外，pE22Hh(通过改变L234A，L235A，N297A，D356C，T366S，L368A和Y407V，缺失C端GK序列以及添加DYKDDDDK序列(SEQ ID 200)而由天然IgG1CH1及其后续序列衍生的序列；SEQ ID NO:186)被用作H链恒定结构域，而κ链(SEQ ID NO：187)被用作L链恒定结构域。改变位点显示在表17中。为了进行CD3(CD3ε)结合活性评估，获得各种单氨基酸改变抗体作为单臂抗体(缺乏Fab结构域之一的天然存在的IgG抗体)。具体地，在H链改变的情况下，与恒定结构域pE22Hh和Kn010G3(从位置216到C末端具有C220S、Y349C、T366W和H435R改变的天然存在的IgG1氨基酸序列；SEQ ID NO:188)连接的改变的H链被用作H链，并且在3’侧与κ链连接的GLS3000被用作L链。在L链改变的情况下，在3’侧与κ链连接的改变的L链被用作L链，并且在3’侧与pE22Hh连接的CE115HA000和Kn010G3被用作H链。这些序列在FreeStyle 293细胞中表达和纯化(采用参考实施例9的方法)。

[表17]

12.3.评估单氨基酸改变抗体与CD3的结合

使用Biacore T200(GE Healthcare Japan Corp.)评估在12.2节中构建、表达和纯化的每个单氨基酸改变的形式。通过胺偶联法将适量的CD3ε同型二聚体蛋白质固定在Sensor芯片CM4(GE Healthcare Japan Corp.)上。然后，将具有适当浓度的抗体作为分析物注入其中，并使其与传感器芯片上的CD3ε同型二聚体蛋白质相互作用。然后，通过注入10mmol/L甘氨酸-HCl(pH 1.5)来再生传感器芯片。该测定在25℃下进行，并且将HBS-EP+(GE Healthcare Japan Corp.)用作运行缓冲液。从测定结果中，使用在测定中获得的结合量和传感图的单循环动力学模型(1：1结合RI＝0)计算解离常数K

12.3.1.H链的改变

表18显示了结合的每个H链改变形式的量与结合的相应未改变抗体CE115HA000的量之比的结果。具体地，当将结合的包含CE115HA000的抗体的量定义为X并且将结合的H链单氨基酸改变形式的量定义为Y时，使用了Z(结合量之比)＝Y/X的值。如图25所示，在Z小于0.8的传感图中，观察到非常少量的结合，这表明可能无法正确计算解离常数K

当表18中所示的Z为0.8或更大时，相对于相应的未改变抗体CE115HA000，认为改变形式维持结合。因此，设计为使这些氨基酸出现的抗体文库可以用作双Fab文库。

[表18]

[表19]

12.3.2.L链的改变

表20显示了结合的每个L链改变形式的量与结合的相应未改变抗体GLS3000的量之比的结果。具体地，当将结合的包含GLS3000的抗体的量定义为X并且将结合的L链单氨基酸改变形式的量定义为Y时，使用了Z(结合量之比)＝Y/X的值。如图25所示，在Z小于0.8的传感图中，观察到非常少量的结合，这表明可能无法正确计算解离常数K

当表20中所示的Z为0.8或更大时，相对于相应的未改变抗体GLS3000，认为改变形式维持结合。因此，设计为使这些氨基酸出现的抗体文库可以用作双Fab文库。

[表20]

[表21]

12.4.评估单氨基酸改变抗体与ECM(细胞外基质)的结合

ECM(细胞外基质)是一种细胞外成分，位于体内各个部位。因此，已知与ECM强烈结合的抗体在血液中具有较差的动力学(半衰期较短)(WO2012093704A1)。因此，优选选择不增强ECM结合的氨基酸作为出现在抗体文库中的氨基酸。

通过参考实施例1.2中描述的方法，以H链或L链改变的形式获得每种抗体。接下来，根据参考实施例14的方法评价其ECM结合。将每种改变形式的ECM结合值(ECL反应)除以在同一板中或在同一执行日期获得的抗体MRA(H链：SEQ ID NO:189，L链：SEQ ID NO:190)的ECM结合值，得到的结果示于表22(H链)和表23(L链)中。如表22和表23所示，证实一些改变具有增强ECM结合的趋势。

在表22(H链)和23(L链)所示的值中，考虑到通过多种改变来增强ECM结合的效果，双Fab文库采用了高达10倍的有效值。

[表22]

[表23]

12.5.增强文库多样性的肽的插入位点和长度的研究

参考实施例11表明，可以使用GGS序列将肽插入每个位点，而不会取消与CD3(CD3ε)的结合。如果双Fab文库可以进行环延伸，则所得文库可能包含更多类型的分子(或具有更大的多样性)，并允许获得与多种第二抗原结合的Fab结构域。因此，鉴于由于肽插入引起的结合活性的推定降低，将用于增强对CD3ε的结合活性的V11L/D72A/L78I/D101Q改变添加到CE115HA000序列中，该序列进一步与pE22Hh连接。如参考实施例11中那样，通过将GGS接头插入该序列来制备分子，并评估其CD3结合。GGS序列被插入到Kabat编号位置99和100之间。抗体分子被表达为单臂抗体。具体地，将上述含有GGS接头的H链和Kn010G3(SEQ ID NO：188)用作H链，将与κ序列(SEQ ID NO：187)连接的GLS3000(SEQ ID NO：185)用作L链。根据参考实施例9表达和纯化这些序列。

12.6.确认插入了GGS肽的CE115抗体与CD3的结合

使用Biacore，通过参考实施例11中描述的方法，证实了插入了GSS肽的改变抗体与CD3ε的结合。如表24所示，结果表明可以将GGS接头插入环中。特别地，GGS接头能够插入对抗原结合很重要的H链CDR3区，并且由于任意的3-、6-和9-氨基酸插入，与CD3g的结合得以维持。尽管这项研究是使用GGS接头进行的，但其中出现除GGS以外的各种氨基酸的抗体文库是可以接受的。

[表24]

12.7.使用NNS核苷酸序列研究文库插入H链CDR3

(12.6)段显示可以使用GGS接头插入3、6或9个氨基酸，并推断通过使用以噬菌体展示法为代表的常规抗体获得方法，可以制备具有3、6或9个氨基酸插入的文库以获得与第二抗原结合的抗体。因此，使用NNS核苷酸序列(其允许每种类型氨基酸都出现)，研究了即使在6-氨基酸插入位点出现了多种氨基酸，对CDR3的6-氨基酸插入是否能维持与CD3的结合。考虑到结合活性的推定的降低，使用NNS核苷酸序列设计了引物，使得6个氨基酸被插入到比CE115HA000具有更高CD3ε结合活性的CE115HA340序列(SEQ ID NO:193)的CDR3的99位和100位(Kabat编号)之间。抗体分子被表达为单臂抗体。

具体地，将上述改变的H链和Kn010G3(SEQ ID NO:188)用作H链，并且将与κ序列(SEQ ID NO:187)连接的GLS3000(SEQ ID NO:185)用作L链。根据参考实施例9表达和纯化这些序列。通过参考实施例12.6中记载的方法评价所得到的改变抗体的结合。结果示于表25中。结果表明，即使各种氨基酸出现在氨基酸延伸的位点，对CD3(CD3ε)的结合活性也得以维持。表26示出了通过参考实施例10中描述的方法进一步评估非特异性结合中增强的存在或不存在的结果。结果，如果CDR3的延伸环富含具有带正电荷的侧链的氨基酸，则与ECM的结合增强。因此，期望在环中不应该出现三个或更多个具有带正电荷的侧链的氨基酸。

[表25]

[表26]

12.8.双Fab文库的设计与构建

基于参考实施例12中所述的研究，如下设计了用于获得结合CD3和第二抗原的抗体的抗体文库(双Fab文库)：

步骤1：选择保持与CD3(CD3ε)结合能力的氨基酸(确保与CD3结合的CE115HA000量的80％或更多)；

步骤2：选择与改变前相比，使ECM结合保持在MRA的10倍以内的氨基酸；和

步骤3：在H链CDR3的99位和100位(Kabat编号)之间插入6个氨基酸。

仅通过执行步骤1就可以使Fab的抗原结合位点多样化。因此，所得的文库可以用于鉴定与第二抗原结合的抗原结合分子。仅通过执行步骤1和3就可以使Fab的抗原结合位点多样化。因此，所得的文库可以用于鉴定与第二抗原结合的抗原结合分子。即使没有步骤2的文库设计，也可以对获得的分子进行测定并评估ECM结合。

因此，对于双Fab文库，将通过将V11L/L78I突变加到FR(框架)并进一步使CDR如表27所示多样化而由CE115HA000获得的序列被用作H链，并且通过使CDR如表28所示多样化而由GLS3000获得的序列被用作L链。这些抗体文库片段可以通过本领域技术人员通常已知的DNA合成方法来合成。双Fab文库可以制备为(1)文库，其中H链被如表27所示多样化，而L链固定为原始序列GLS3000或为参考实施例12中所述的具有增强的CD3ε结合的L链的，(2)文库，其中H链固定为原始序列(CE115HA000)或为参考实施例1中所述的具有增强的CD3ε结合的H链，而L链被如表28所示多样化的，和(3)文库，其中H链被如表27所示多样化，而L链被如表28所示多样化。通过将V11L/L78I突变加到FR上(框架)并进一步使CDR如表27所示多样化而由CE115HA000获得的H链文库序列，被委托给DNA合成公司DNA2.0，Inc.以获得抗体文库片段(DNA片段)。将获得的抗体文库片段插入噬菌粒中，用于通过PCR扩增的噬菌体展示。GLS3000被选为L链。通过电穿孔将构建的用于噬菌体展示的噬菌粒转移到大肠杆菌中以制备具有抗体文库片段的大肠杆菌。

根据表28，我们为GLS3000设计了新的多样化文库，如表29所示。L链文库序列衍生自GLS3000，并且如表29(DNA文库)所示多样化。DNA文库由DNA合成公司构建。然后将包含各种GLS3000衍生序列的L链文库和包含各种CE115HA000衍生序列的H链文库插入噬菌粒中以构建噬菌体展示文库。

[表27]

[表28]

[表29]

[参考实施例13]实验细胞系

通过本领域技术人员熟知的方法将人GPC3基因整合到小鼠结肠直肠癌细胞系CT-26(ATCC No.CRL-2638)的染色体中，以获得高表达CT26-GPC3细胞系。使用QIFI试剂盒(Dako)根据制造商推荐的方法测定人GPC3的表达水平(2.3×10

通过本领域技术人员熟知的方法将人CD137基因整合到中国仓鼠卵巢细胞系CHO-DG44的染色体中,以获得高表达CHO-hCD137细胞系。使用PE抗人CD137(4-1BB)抗体(BioLegend，目录号309803)根据制造商的说明，通过FACS分析确定人CD137的表达水平。

NCI-H446和Huh7细胞系分别保持在RPMI1640(Gibco)和DMEM(低葡萄糖)中。两种培养基均补充有10％的胎牛血清(Bovogen Biologicals)，100单位/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素，并将细胞在37℃在5％CO

[参考实施例14]评估抗体与ECM(细胞外基质)的结合

参照WO2012093704A1，通过以下过程评估每种抗体与ECM(细胞外基质)的结合：用TBS将不含酚红的ECM(BD Matrigel#356237)稀释至2mg/mL，并以5μL/孔滴加至在冰上冷却的ECL分析板(L15XB-3，MSD KK，高结合度)的每个孔的中心。然后，将板用板密封件盖住，并在4℃下静置过夜。使固定有ECM的板达到室温。将ECL封闭缓冲液(补充有0.5％BSA和0.05％吐温20的PBS)以150μL/孔添加到其中，并将板在室温下静置2小时或更长时间，或者在4℃下静置过夜。然后,将每个抗体样品用PBS-T(补充有0.05％吐温20的PBS)稀释至9μg/mL。用ECLDB(补充有0.1％BSA和0.01％吐温20的PBS)将第二抗体稀释至2μg/mL。将20μL的抗体溶液和30μL的第二抗体溶液加入到含有以10μL/孔分配的ECLDB的圆底板的每个孔中，并在避光的条件下在室温下搅拌1小时。通过倒置含有ECL封闭缓冲液的ECM板来去除ECL封闭缓冲液。向该板中，以50μL/孔添加上述抗体和第二抗体的混合溶液。然后，将板在避光的条件下在室温下静置1小时。通过倒置板除去样品，然后以150μL/孔向其中加入READ缓冲液(MSD K.K.)，随后使用Sector Imager 2400(MSD K.K.)检测磺基标签的发光信号。

[参考实施例15]评估抗GPC3/CD3/人CD137三特异性抗体和抗GPC3/双Fab抗体的脱靶细胞毒性

(15-1)抗GPC3/CD3/人CD137三特异性抗体的制备

为了研究靶标独立的细胞毒性和细胞因子释放，通过使用CrossMab和FAE技术生成了三特异性抗体(图2.1)。如上所述，用CrossMab产生四价IgG样分子，抗体A(mAb A)，其每条臂具有两个结合结构域，从而在一个分子中产生四个结合结构域。二价IgG，抗体B(mAbB)与常规IgG的形式相同。mAb A和mAb B的Fc区均是FcγR沉默的，对Fcγ受体的亲和力减弱，被去糖基化并适用于FAE。构建了六种三特异性抗体。六种三特异性抗体中每个Fv区的靶抗原示于表30中。mAb A、mAb B和mAb AB的每个结合结构域的命名规则示于图2.2中。产生各自的六种三特异性抗体mAb AB的一对mAb A和mAb B及其SEQ ID NO分别示于表31和表32中。在WO2005/035584A1中描述的抗体CD3D(2)_i121(缩写为AN121)用作抗CD3ε抗体。通过上述方法表达并纯化所有六种三特异性抗体。

[表30]

抗体每条臂的靶标

[表31]

[表32]

(15-2)评估GPC3/CD3/人CD137三特异性抗体的结合

在37℃下评估三特异性抗体对人CD3和CD137的结合亲和力。

使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)在37℃下评估三特异性抗体对人CD3和CD137的结合亲和力。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗人Fc抗体(GE Healthcare)固定在CM4传感器芯片的所有流通池上。将抗体捕获到抗Fc传感器表面上，然后将重组人CD3或CD137注射到流通池上。在包含20mM ACES、150mM NaCl、0.05％吐温20、0.005％NaN3的ACES pH 7.4中制备所有抗体和分析物。每个周期用3M MgCl

三特异性抗体对重组人CD3和CD137的结合亲和力示于表33中。

[表33]

(15-3)评估GPC3/CD137xCD3三特异性抗体和抗GPC3/双Fab与人CD137和CD3的同时结合

进行了Biacore串联阻断测定，以表征三特异性抗体或双Fab抗体对CD3和CD137的同时结合。该测定是在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上在25℃下于ACES pH 7.4缓冲液中进行的，该缓冲液包含20mM ACES、150mM NaCl、0.05％吐温20、0.005％NaN3。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗人Fc抗体(GE Healthcare)固定在CM4传感器芯片的所有流通池上。将抗体捕获到抗Fc传感器表面上，然后将8μM CD3注射到流通池上，然后在存在8μMCD3的情况下同样注射8μM CD137。第二次注射的结合反应增加表明与不同互补位的结合，因此是同时的结合相互作用；而第二次注射的结合反应没有增强或下降表明与相同或重叠或相邻的互补位结合，因此是非同时的结合相互作用。

该测定的结果示于图26中，其中GPC3/CD137xCD3三特异性抗体而非抗GPC3/双Fab抗体显示出同时与CD3和CD137结合的特征。

(15-4)评估GPC3/CD137xCD3三特异性抗体和抗GPC3/双Fab抗体与表达人CD137的CHO细胞或Jurkat细胞的结合

图27显示了通过FACS分析确定的三特异性抗体和Dual-Fab抗体与参考实施例13中产生的hCD137转染的亲代CHO细胞的结合或与在Jurkat细胞上表达的hCD3(参考实施例6-2)的结合。简而言之，将三特异性抗体和双Fab抗体与每种细胞系在室温下温育2小时，然后用FACS缓冲液(PBS中含有2％FBS，2mM EDTA)洗涤。然后加入山羊F(ab’)2抗人IgG，小鼠ads-PE(Southern Biotech，目录号2043-09)，并在4℃下温育30分钟，并用FACS缓冲液洗涤。在FACS Verse(Becton Dickinson)上进行数据采集，然后使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。

图27显示相对于Ctrl抗体(灰色填充)，50nM抗GPC3/H183L072(黑线)抗体特异性结合hCD137转染子上的hCD137(图27a)，但是未观察到CHO亲代细胞的结合(图27b)。类似地，相对于Ctrl/CtrlxCD3三特异性对照抗体(浅灰色填充)，2nM抗GPC3/CD137xCD3(深灰色填充)和抗GPC3/CD137xCtrl(黑线)三特异性抗体显示出与转染细胞上hCD137的特异性结合(图27c)。在CHO亲本细胞中未观察到非特异性结合(图27d)。

相对于各自对照(浅灰色填充)，图27e中的50nM抗GPC3/H183L072(黑线)抗体和图27f中的GPC3/CD137xCD3(深灰色填充)或GPC3/CD137xCtrl(黑线)三特异性抗体均显示结合表达在Jurkat细胞上的CD3。

(15-5)评估GPC3/CD137xCD3三特异性抗体和抗GPC3/双Fab三特异性抗体的T细胞对人GPC3表达细胞的CD3活化

为了研究三特异性抗体和抗GPC3/双Fab抗体的两种形式是否都能以靶标依赖性方式活化效应细胞，如参考实施例6-2中所述进行了NFAT-luc2Jurkat萤光素酶测定。将5.00E+03个SK-pca60细胞(参考实施例13)用作靶细胞，并在0.1、1和10nM三特异性抗体或双Fab抗体存在下与2.50E+04个NFAT-luc2 Jurkat细胞共培养24小时。24小时后，根据制造商的说明，使用Bio-Glo萤光素酶测定系统(Promega，G7940)检测萤光素酶活性。使用GloMax(注册商标)Explorer System(Promega#GM3500)检测发光(单位)，并使用GraphpadPrism 7绘制捕获的值。如图28所示，只有包含抗GPC3和抗GPC3结合的三特异性抗体(例如GPC3/CD137xCD3，GPC3/CtrlxCD3或抗GPC3/H183L072)在存在靶细胞的情况下导致Jurkat细胞的剂量依赖性活化。值得注意的是，即使参考实施例(15-4)中通过FACS分析得出的抗GPC3/H183L072抗体在Jurkat细胞上的结合较弱，抗GPC3/H183L072抗体也可以引发与GPC3/CD137xCD3或GPC3/CtrlxCD3抗体相似程度的Jurkat活化。总之，三特异性抗体和抗GPC3/双Fab抗体均可导致效应细胞的靶标依赖性活化。

(15-6)评估GPC3/CD137xCD3三特异性抗体和抗GPC3/双Fab抗体的T细胞对人CD137表达细胞的CD3活化。

为了研究三特异性抗体形式和抗GPC3/双Fab抗体是否都可以导致表达hCD137的细胞与表达hCD3的效应细胞交联，如参考实施例(15-5)中所述，在0.1、1和10nM三特异性抗体存在下，将5.00E+03个表达hCD137的CHO与2.50E+04个NFAT-luc2 Jurkat细胞共培养24小时。图29显示与亲代CHO细胞共培养时，所有三特异性抗体均未导致Jurkat细胞的非特异性活化。但是，在表达hCD137的CHO细胞存在下，观察到GPC3/CD137xCD3和Ctrl/CD137xCD3三特异性抗体均可活化Jurkat细胞。与表达hCD137的CHO细胞共培养时，抗GPC3/H183L072抗体不会导致Jurkat细胞活化。10nM的抗GPC3/H183L072抗体显示10nM的GPC3/CD137xCD3三特异性抗体的发光的约0.96％，1nM的抗GPC3/H183L072抗体显示1nM的GPC3/CD137xCD3三特异性抗体的发光的约1.93％。与参考实施例15-5中评估的针对GPC3阳性细胞的CD3活化相比时，使用10nM或1nM的抗GPC3/H183L072抗体时，针对CD137阳性细胞检测到约1.36％或1.89％的发光，尽管与针对GPC3阳性细胞的发光相比，10nM和1nM的GPC3/CD137xCD3三特异性抗体针对CD137阳性细胞分别显示出约127.77％和107.22％的发光。

综合来看，这表明同时结合CD3和CD137的三特异性形式GPC3/CD137xCD3可导致针对表达hCD137的细胞的Jurkat细胞活化，独立于靶标或肿瘤抗原结合，从而不像不同时结合CD3和CD137抗GPC3/双Fab形式，产生脱靶细胞毒性。参考实施例8、15-5和15-6中显示的那些结果证明，只有不同时结合CD3和CD137的抗体才能特异性杀死靶抗原表达细胞。

(15-7)评估来自PBMC的Ctrl/CD137xCD3三特异性抗体和Ctrl/双Fab抗体的脱靶细胞因子释放

还使用人PBMC溶液评估了三特异性抗体形式和双Fab抗体的脱靶毒性的比较。简而言之，将如参考实施例(7-2-1)中所述制备的2.00E+05个PBMC与80、16和3.2nM的三特异性抗体或双Fab抗体在不存在靶细胞的情况下温育48小时。如参考实施例(7-2-2)中所述，使用细胞因子释放测定法测量上清液中的IL-2、IFNγ和TNFα。如图30所示，Ctrl/CD137xCD3三特异性抗体而不是Ctrl/双Fab抗体可导致从PBMC的IL-2、IFNγ和TNFα释放。80nM Ctrl/双Fab抗体显示80nM Ctrl/CD137xCD3三特异性抗体的IL-2浓度的约50％，而使用16nM抗体时，IL-2浓度低于10％。至于IFNγ和TNFα，在每种抗体浓度下，Ctrl/双Fab抗体均显示低于Ctrl/CD137xCD3三特异性抗体的IL-2浓度的10％。

这些结果表明，在没有靶细胞的情况下，Ctrl/CD137xCD3三特异性形式导致PBMC的非特异性活化。最后，数据显示，双Fab形式可以赋予靶标特异性效应细胞活化而不会产生脱靶毒性。

[工业适用性]

本发明提供了能够结合CD3和CD137(4-1BB)但不同时结合CD3和CD137的抗原结合分子。本发明的抗原结合分子通过与三种不同抗原的结合而表现出由这些抗原结合分子诱导的增强的T细胞依赖性细胞毒活性。