鉴定黄水仙的DNA特异性位点及鉴定黄水仙的方法和应用

技术领域

本发明涉及分子鉴定技术领域，尤其涉及鉴定黄水仙的DNA特异性位点和鉴定黄水仙的方法和应用。

背景技术

黄水仙(Narcissus pseudonarcissus L.)原产欧洲，为石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus L.)著名观赏花卉。为满足国内人民群众日益增长的对观赏花卉的多样性需求，我国从国外大量进口黄水仙鳞茎。同时，为解决我国水仙品种单一、种性退化等问题，从国外引进优良水仙花种质资源已成为当前最为有效的方法之一。从2016年开始，我国进口黄水仙等鳞茎花卉的数量以超过5亿株，价值已超过1亿美元，且我国进口鳞茎花卉的数量和贸易额一直呈增长趋势。对进口黄水仙等鳞茎花卉的具体物种信息进行科学准确的鉴定，是进一步开展其他工作的基础与前提。

水仙属中，黄水仙N.pseudonarcissus与水仙N.tazetta var.chinensis M.Roem.鳞茎形态接近，由于其进口时多处于休眠的鳞球茎状态，通过肉眼观察和常规显微镜观察等形态学方法难以开展鉴定工作，故有必要通过分子生物学技术将黄水仙与水仙进行鉴别。

目前，尚无关于黄水仙分子鉴定的报道。关于水仙属植物的分类学研究多集中在常规的形态分类学以及数量分类学、细胞分类学、花粉形态学等方面。依靠传统的形态分类学方法在黄水仙的鉴别上存在局限性。近年来已有应用分子生物学方法研究水仙属植物亲缘关系的研究报道，研究结果多集中在水仙属植物进行系统进化研究方面。鉴于黄水仙进口货值和数量较大，因此有必要建立一套的黄水仙的分子鉴定技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定黄水仙的DNA特异性位点和鉴定黄水仙的方法和应用。

本发明采用的技术方案为：提供一种鉴定黄水仙的DNA特异性位点，所述DNA特异性位点的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一技术方案为：一种鉴定黄水仙的方法，包括以下步骤：利用PCR扩增待测样品的SEQ ID NO.1序列并进行测序，所述PCR扩增的引物为：SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3；

当测出序列的191bp碱基为A，194bp碱基为A，211bp碱基为T，216bp碱基为T，226bp碱基为T，227bp碱基为A，233bp碱基为T，243bp碱基为T，246bp碱基为A，251bp碱基为A，252bp碱基为A,，259bp碱基为A，267bp碱基为T，则判定待测样品为黄水仙。

优选的，上述鉴定黄水仙的方法中，所述待测样品为：黄水仙和水仙。

优选的，上述鉴定黄水仙的方法中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性6min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸6min；4℃保温。

本发明的又一技术方案为：提供一种DNA特异性位点在鉴定黄水仙中的应用，所述DNA特异性位点的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的有益效果在于：与传统的形态学鉴定方法和DNA指纹标记相比，本发明利用SEQ ID NO.1序列进行PCR扩增和测序，直接获得鉴定结果，不用依赖相关鉴定人员形态学鉴定经验，检测准确性高、可重复性高，鉴定时间短。

附图说明

图1为本发明具体实施方式的黄水仙的图片；

图2为本发明的具体实施方式的黄水仙及水仙属其他种SEQ ID NO.1序列的比对。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

实施例1

一种鉴定黄水仙的DNA特异性位点，所述DNA特异性位点为一段rDNA序列，所述rDNA序列的序列如SEQ ID NO.1所示:

tccgtaggtg aacctgcgga aggatcattg tcgaggcccg aacggacgat tgcgaacccgtagagccccc ccgctgggag aggcaagggc gcggcatccg ccgtctcccc tgccactgcc tccgcgggtgcccctaccgt cgtcgccctg cacgtcgtgc gggtcgagcg gcgggaacaa tttccggcgc agtacgcgccaaggagcagc tctgttcgga tggcgtagcg cgtggcgagc actgtatcgc aacgcgcgac gccatctttgtacgtctaac tttgcatgac tctcggcaac ggatatcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgtagcgaaacgcgatactt ggtgtgaatt gcagaatccc gtgaaccatc gagtctttga acgcaagttg cgcccgaggccgtctggcca agggcacgcc tgcctgggcg tcacgcctgc cgacgctcat tgcccccttc ccctgcctcgtgcggttcgg cggctggcat tgatgcggag agtggccccc cgcgcatcct tgcgtggcgg gttgaagtgcgggtcgccgg tctggcttga cgcggcgagc gatggactga cgcgcacgct gtcgccgatg tgacccgactcggtcgatgc acagaaggaa cctacgtcga tgggcgccac gcgggcgctc ctcgaaaaac gaccccaggtcaggcgggga cacccgctga gtttaagcat atcaataagc ggagga(SEQ ID NO.1)。上述rDNA序列的PCR扩增引物序列可为：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

分别从荷兰、日本等地收集的进口黄水仙鳞茎27个样品，和漳州、平潭等地收集的水仙鳞茎3个样品。黄水仙鳞茎照片参见附图1。

利用CTAB法提取上述水仙属植物的基因组DNA，利用Oro-F1及Oro-R1引物进行PCR扩增，PCR扩增使用2×Taq PCR Master Mix(TIANGEN，北京，中国)。

Oro-F1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID NO.2)；

Oro-R1：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO.3)；

PCR扩增体系为：2×PCR Mix，10μL；10μM浓度上游引物，1μL；10μM浓度下游引物，1μL；样品DNA，1μL；补充无菌水至20μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性6min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸6min；4℃保温。

将PCR产物送由生物公司纯化后测序(测序所用引物与PCR所用引物相同)，所得基因序列经校正后即为目的基因序列。用Bioedit 7.2.5序列比对软件进行多重序列比对。序列比对结果见附图2。

图2为本实施例的黄水仙及水仙SEQ ID NO.1的比对，图2中序列共30行，沿黑色箭头方向从上到下前27行为黄水仙，后3行为水仙。

黑色箭头分别标注黄水仙SEQ ID NO.1的序列特异位点，其中，黄水仙的SEQ IDNO.1在191bp碱基为A，194bp碱基为A，211bp碱基为T，216bp碱基为T，226bp碱基为T，227bp碱基为A，233bp碱基为T，243bp碱基为T，246bp碱基为A，251bp碱基为A，252bp碱基为A,，259bp碱基为A，267bp碱基为T。

与传统的形态学鉴定方法和DNA指纹标记相比，本发明利用SEQ ID NO.1序列鉴定黄水仙的方法，对黄水仙的基因组DNA进行PCR扩增和测序，直接获得鉴定结果，不用依赖相关鉴定人员形态学鉴定经验，检测准确性高、可重复性高，鉴定时间短。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州海关技术中心

<120> 鉴定黄水仙的DNA特异性位点及鉴定黄水仙的方法和应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 736

<212> DNA

<213> 黄水仙

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgga aggatcattg tcgaggcccg aacggacgat tgcgaacccg 60

tagagccccc ccgctgggag aggcaagggc gcggcatccg ccgtctcccc tgccactgcc 120

tccgcgggtg cccctaccgt cgtcgccctg cacgtcgtgc gggtcgagcg gcgggaacaa 180

tttccggcgc agtacgcgcc aaggagcagc tctgttcgga tggcgtagcg cgtggcgagc 240

actgtatcgc aacgcgcgac gccatctttg tacgtctaac tttgcatgac tctcggcaac 300

ggatatcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgtagcgaaa cgcgatactt ggtgtgaatt 360

gcagaatccc gtgaaccatc gagtctttga acgcaagttg cgcccgaggc cgtctggcca 420

agggcacgcc tgcctgggcg tcacgcctgc cgacgctcat tgcccccttc ccctgcctcg 480

tgcggttcgg cggctggcat tgatgcggag agtggccccc cgcgcatcct tgcgtggcgg 540

gttgaagtgc gggtcgccgg tctggcttga cgcggcgagc gatggactga cgcgcacgct 600

gtcgccgatg tgacccgact cggtcgatgc acagaaggaa cctacgtcga tgggcgccac 660

gcgggcgctc ctcgaaaaac gaccccaggt caggcgggga cacccgctga gtttaagcat 720

atcaataagc ggagga 736

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20