快速检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片

技术领域

本发明涉及快速检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片，属于生物技术领域。

背景技术

COVID-19现在对全球健康仍旧构成严重威胁，目前常用的诊断SARS-CoV-2感染的方法是通过RT-PCR检测鼻拭子样本中的病毒RNA，这种方法简单可靠，但是样本采集过程中需要操作细节，耗时数小时以上，且无法追踪病毒感染的免疫反应。

最近对SARS-CoV-2的研究表明，病毒感染后血清中出现SARS特异性抗体8-9，如IgG、IgM和IgA。研究表明，不同人群在不同时间点的中和抗体动态水平表现出不同的临床特征，抗体(IgG、IgM)自COVID-19感染后第4天开始出现，16发病后20天内血清阳性率达100.0％，至41～53天仍为100.0％。年龄在31岁以上的患者中的抗体水平高于16-30岁的患者，而女性患者在疾病早期和病情严重时IgG抗体的生成倾向于强于男性患者，女性患者的平均IgG抗体水平往往高于男性患者。因此，血清中的病毒特异性抗体可作为有效的诊断生物标志物，用于病毒感染筛查和评估患者出院和注射疫苗后的适应性免疫反应。此外，循环血中的病毒抗原(spike(S)蛋白18-20和核衣壳(N)蛋白21-23)也可用于COVID-19相关病毒血症的预后研究。

目前SARS-CoV-2特异性抗体和病毒抗原的检测方法主要有电子晶体管生物传感器法、金纳米粒子侧流法、酶联免疫吸附法。电子晶体管生物传感器在SARS-CoV-2抗原蛋白检测中具有较高的灵敏度，但其实际应用受到非常复杂的制造工艺的限制；金纳米粒子侧流法用于快速检测SARS-CoV-2 IgG/IgM抗体，但灵敏度有限，可进行定量检测；酶联免疫吸附法(ELISA)能提供定量检测，但其操作过程复杂，检测时间长。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供快速检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片，该生物芯片由带有检测条形码阵列的GOQDs功能化底物、捕获抗体/抗原阵列微打印PDMS层和精确定量样品检测PDMS层组成，用于高通量、快速、灵敏、同时定量检测血清中SARS-CoV-2抗原蛋白和IgG/IgM抗体。

快速检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片的制作方法，包括如下步骤：

(1)制备带有检测条形码阵列的GOQDs基层；

(2)利用基底(如硅片)和ICP刻蚀工艺制作基底模具；

(3)利用步骤(2)获得的基底模具制备PDMS层，其上打孔产生抗体/抗原阵列的出入口，打孔后将其与步骤(1)中获得的GOQDs基层结合形成间隔编码微流控生物芯片，将捕获抗体/抗原特异性探针加载到获得的间隔编码微流控生物芯片的与芯片上微通道相连的入口中，将抗体/抗原探针阵列微打印在微通道内的基层上，获得加载捕获抗体/抗原的间隔编码微流控生物芯片；

(4)再制作一个厚度为0.5-1mm的PDMS层和一个厚度为2-3mm的PDMS层，将两个PDMS层对齐后置于75-80℃烘烤50-60min，形成精确定量样品检测PDMS层；

(5)步骤(3)获得加载捕获抗体/抗原的间隔编码微流控生物芯片和步骤(4)获得的精确定量样品检测PDMS层结合，即可形成快速检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片。

进一步的，步骤(1)中所述的制备带有检测条形码阵列的GOQDs功能化底物的方法，包括如下步骤：

S1取玻璃基板清洗后使用3-氨基丙基三甲氧基西兰(APTES)溶液处理，清洗后获得经过APTES处理后的玻璃基板；

S2将步骤S1中获得的经过APTES处理后的玻璃基板放入GOQDs溶液中自组装GOQDs，完成后冲洗去除多余GOQDs，在带有GOQDs的玻璃基板上微打印抗体/抗原检测探针条形码阵列，获得带有检测条形码阵列的GOQDs基层。

进一步的，上述3-氨基丙基三甲氧基西兰(APTES)溶液的浓度为1-5％，上述GOQDs溶液的浓度1-5mg/mL。

进一步的，步骤(2)中所述的基底模具为具有20-30个宽度为5-50μm的平行条带状凸起的硅片模具。

进一步的，步骤(3)中所述的制备PDMS芯片层的方法包括如下步骤：

将步骤(2)中获得硅片模具放入三甲基氯硅烷(TMCS)中浸泡15-20min，将Sylgard184A和Sylgard 184B按照重量比为10:1的比例混合后加载到经过TMCS处理过的硅片模具上，气泡抽真空后，放入70-80℃中固化60min，将PDMS层从硅片模具上剥离，获得PDMS层。

本申请还可以获得一种依据上述制备方法制备的快速检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片。

进一步的，上述微流控生物芯片在快速检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体中的应用。

进一步的，上述应用的应用方法，包括如下步骤：

将待测样品导入微流控生物芯片的微腔中，室温孵育3～20min，用1％的BSA从间隔编码微流控生物芯片上剥离精确定量样品检测PDMS层，1％BSA溶液冲洗间隔编码微流控生物芯片，将300μL荧光共轭检测抗体复合物加载分散到整个间隔编码微流控生物芯片表面，使用1％BSA、1×PBS、0.5×PBS和去离子水依次冲洗，干燥后使用荧光扫描仪(如GenePix-4400)扫描间隔编码微流控生物芯片获得并分析目标抗体/抗原浓度。

进一步的，上述荧光共轭检测抗体复合物的浓度为5-20μg/ml。

有益效果：

本申请制备的微流控生物芯片综合了纳米材料和微流控芯片的优点，能够同时检测60个样本的多种SARS-CoV-2抗原或IgG/IgM抗体，每个患者的样本量仅为2μL，超低检出限约为0.3pg/mL，定性检测时间短于10min，实现高通量、快速、灵敏、定量检测血清中SARS-CoV-2抗原蛋白和IgG/IgM抗体。该芯片的应用不仅有助于COVID-19患者的快速诊断，而且为感染者、药物治疗和疫苗接种者提供了有价值的筛选途径。

附图说明

图1 SARS-CoV-2病毒和微流控生物芯片的示意图。

图2微流控生物芯片示意图。

图3芯片制造工艺图。

图4传感生物芯片的构建及检测机理验证图。

图5生物传感芯片上抗Covid-19抗原和抗体IgM/IgG的检测流程示意图。

图6微流控生物芯片检测SARS-CoV-2抗体/抗原的特异性和敏感性。

图7检测时间对微流控生物芯片检测限和定量检测量的影响。

图8 S抗原浓度为5至500ng/mL的(a)5min，(b)10min，(c)20min和(d)40min处观察到的荧光强度条形图。

图9 S-IgG浓度为5至500ng/mL时，在(a)5min、(b)10min、(c)20min和(d)40min时观察到的荧光强度条形图。

图10 S-IgM浓度为5至500ng/mL时，在(a)5min、(b)10min、(c)20min和(d)40min时观察到的荧光强度条形图。

图11(a)S-抗原、(b)N-抗原、(c)S-IgG、(d)N-IgG、(e)S-IgM和(f)N-IgM的再现性试验。

图12(a)S-抗原、(b)N-抗原、(c)S-IgG、(d)N-IgG、(e)S-IgM和(f)N-IgM的荧光强度重复试验。

图13 1％牛血清白蛋白与健康血清混合样品的检测结果。

图14 1％BSA中生物标志物检测浓度与健康血清中生物标志物检测浓度的偏差。

图15健康人血清中SARS-CoV-2s抗原、S-IgG和S-IgM的检测。

图16 SARS-CoV-2s抗原荧光强度分布结果图。

图17 SARS-CoV-2s-IgG荧光强度分布结果图。

图18 SARS-CoV-2s-IgM荧光强度分布结果图。

图19酶联免疫吸附测定方法图解。

图20 SARS-CoV-2抗原/抗体的ELISA检测图。

图21应用微流控芯片和ELISA方法检测SARS-CoV-2s抗原和S-IgG的结果比较图。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1制备快速高通量检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片

一、制备快速高通量检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片

(1)取玻璃基板清洗后使用3-氨基丙基三甲氧基西兰(APTES)溶液处理，清洗后获得经过APTES处理后的玻璃基板；将上述获得的经过APTES处理后的玻璃基板放入GOQDs溶液中自组装GOQDs，完成后冲洗去除多余GOQDs，在带有GOQDs的玻璃基板上微打印抗体/抗原检测条形码阵列，制备获得带有检测条形码阵列的GOQDs基层，如图2中的(a)所示。

(2)利用硅片和ICP刻蚀工艺制作硅片模具，模具为具有20个宽度为20μm的平行条带状凸起的硅片模具。

(3)将步骤(2)中获得硅片模具放入三甲基氯硅烷(TMCS)中浸泡15-20min，将Sylgard 184A和Sylgard 184B按照重量比为10:1的比例混合后加载到经过TMCS处理过的硅片模具上，气泡抽真空后，放入70-80℃中固化60min，将PDMS层从硅片模具上剥离，获得PDMS层，将抗体/抗原阵列微打印在PDMS层上(如图2中的(b)所示)，将其与步骤(1)中获得的GOQDs基层结合形成间隔编码微流控生物芯片(如图3所示)，将捕获抗体/抗原加载到步骤(3)获得的间隔编码微流控生物芯片的与芯片上微通道相连的入口中。

3-氨基丙基三甲氧基西兰(APTES)溶液的浓度为1-5％，上述GOQDs溶液的浓度1-5mg/mL。

(4)再制作一个厚度为0.5-1mm的PDMS层和一个厚度为2-3mm的PDMS层(制作方法同步骤(3)中PDMS层的制作方法)，将两个PDMS层对齐后置于75-80℃烘烤50-60min，形成精确定量样品检测PDMS层(图2中的(c)所示)。

(5)步骤(3)获得的加载有捕获抗体/抗原的间隔编码微流控生物芯片和步骤(4)获得的精确定量样品检测PDMS层结合，即可形成快速检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片。

SARS-CoV-2是一种由抗原蛋白(表面棘突(S)、膜(M)和核衣壳(N)蛋白)和RNA病毒基因组组成的新型粒子，如图1中的a所示，它通过S蛋白与人类细胞的相互作用入侵人类，并通过RNA病毒基因组在人类细胞中复制自身。一旦被SARS-CoV-2感染，其适应性免疫系统将产生SARS-CoV-2抗体(IgG/IgM)，以防止SARS-CoV-2的入侵。所设计的用于检测SARS-CoV-2抗原蛋白和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片示意图如图1中的b所示，具有60个样品同时检测的能力，小样品体积为2μL，检测时间短于10分钟，检测下限约为0.3pg/ml。

对于SARS-CoV-2抗原检测，靶抗原被捕获和检测抗体夹住，如图1中的c所示。要进行抗SARS-CoV-2 IgG/IgM检测，在功能化底物上微印特异性抗原，首先捕获目标抗体，使用荧光标记的山羊抗人二级抗体IgG和IgM特异性结合IgG/IgM，并给出如图1中的d所示的荧光信号。

二.检测微流控生物芯片制造情况

为了确认在制造和检测过程的每一步成功接合，在微流控生物芯片上进行AFM和拉曼(图4)表征。图4中的(a)载玻片的AFM图像，图4中的(b)指GOQDs组装玻璃的AFM图像，图4中的(c)GOQDs底物上固定的捕获抗体的AFM图像，图4中的(d)GOQDs底物上固定的抗体捕获的抗原的AFM图像。图4中的(e)-图4中的(h)分别是从载玻片、GOQDs组装玻璃、GOQDs底物上固定的捕获抗体、GOQDs底物上固定的抗体捕获的抗原中检测到的相应拉曼光谱。

玻璃基板具有相对较小的粗糙度，该粗糙度甚至由于分子薄GOQDs层的沉积而减小，如图4中的(a)和图4中的(b)所示。但是在固定捕获抗体和抗原后，其变得更粗糙，如图4中的(c)和图4中的(d)所示。为了确认每一步的成功接合，拉曼光谱在这些衬底上进行，如图4中的(e)-图4中的(h)所示。它在裸玻片上呈现576和1092cm-1处的代表性峰，并且在固定GOQDs后出现1400和1641cm-1处的峰。在1400和1641cm-1处的拉曼峰表明GOQDs在玻片上成功组装。最后，固定化捕获抗体后，拉曼光谱在1096cm-1和1407cm-1处出现了具有代表性的捕获抗体峰，表明捕获抗体的成功固定。在1196和1513cm-1处抗原的代表性峰值表明抗原被成功捕获

结果表明，成功制备了用于SARS-CoV-2igg/IgM/抗原检测的微流控生物芯片，并建立了其工作传感机制。

实施例2微流控生物芯片检测SARS-CoV-2igg/IgM/抗原

将目标抗体/抗原样品导入微流控生物芯片的微腔中。室温孵育3～20min后，从1％BSA中的微流控生物芯片间隔编码底物上剥离准确定量样品检测PDMS层，用1％BSA冲洗底物。对于抗原检测，将300μL荧光共轭检测抗体复合物(浓度10μg/ml)加载到底物上并分散在整个底物区域。检测抗体与抗原的反应时间为2～20min。抗体检测采用300μL荧光标记的山羊抗人IgG二级抗体，浓度为10μg/ml，室温孵育2-20分钟。最后，用1％BSA、1×PBS、0.5×PBS和去离子水洗涤带检测荧光信号条形码阵列的底物，然后span干燥。用GenePix-4400扫描具有检测荧光信号的底物，分析目标抗体/抗原浓度。生物传感芯片上SARS-CoV-2IgM/IgG/抗原的图示检测过程如图5所示。

实施例3特异性和灵敏度和检测

将2μL不同浓度(1-10

将浓度在1-105pg/ml之间的人S-IgM、S-IgG、N-IgM和N-IgG分别装载在每个样品室中，并在微流控生物芯片上放置完整的捕获抗原阵列，以执行其特异性和敏感性。实际上，S抗原是用来捕获S-IgM和S-IgG的，N抗原是用来捕获N-IgM和N-IgG的，但是它们的信号被荧光标记的次级IgM和IgG分开。图6中的(d)显示它们都与相应的捕获抗原和二级抗体发生特异性反应，因为成对的捕获抗原-抗体比不匹配的捕获抗原-抗体呈现更高的荧光信号。荧光强度与抗体浓度的依赖关系如图6中的(e)-(h)所示，进一步分析表明，对于所有四种抗体，荧光强度与目标抗体浓度在对数标度上具有相似的线性关系。两个靶抗原和四个靶抗体的检出限根据代表性方程LOD＝(3S_b1)/S 29,30计算，并在表1中列出，S抗原、N抗原、S-IgM、S-IgG、N-IgM和N-IgG的检出限分别为0.23pg/mL、0.35pg/mL、0.21pg/mL、0.32pg/mL、0.31pg/mL和0.29pg/mL。结果表明，所研制的微流控生物芯片对SARS-CoV-2抗体/抗原检测具有良好的特异性和敏感性。

表1计算检出限

实施例4 SARS-CoV-2抗体/抗原检测限及检测时间

SARS-CoV-2抗体/抗原检测时间是影响流感流行爆发的重要因素。同时，需要临界检测限来区分健康和感染患者。为确定SARS-CoV-2抗体/抗原的有效检测时间，我们对研制的微流控生物芯片具有类似的特异性和敏感性，对上述SARS-CoV-2抗体/抗原检测具有相似的特异性和敏感性，因此我们进行了不同检测时间的S抗原、S-IgG和S-IgM检测。血清中浓度为5至500ng/mL的S抗原、S-IgG和S-IgM样品在5min、10min、20min和40min时间内检测到的荧光强度结果如图8所示，该图用于根据代表式LOD＝(3S U b1)/S 29,30确定检测限。S抗原和S-IgG/IgM的检测限由～0.3pg/ml增加到～4ng/ml，检测时间从40min下降到5min，如图图7中(a)-(c)所示，这是SARS-CoV-2抗体/抗原与底物和荧光标记检测抗体的部分反应所致。为进一步验证最短的有效检测时间，合理灵敏度，选择相对较低的S抗原、S-IgG和S-IgM样品浓度为5ng/ml，用5-40min的微流控生物芯片进行检测。图7中(d)-(f)结果表明，SARS-CoV-2抗体/抗原5ng/ml可在5min内定性鉴别，10-40min内定量鉴别。

实施例5微流控生物芯片的重现性

对SARS-CoV-2抗体/抗原(100ng/ml)在1％BSA中的同一样品进行5次重复试验，检测到的样品荧光强度如SI图12所示。检测到的浓度变化较小，所有六种生物标志物的相对标准偏差(RSD)小于3％，如图11中的(a)-(f)所示，表明所提出的SARS-CoV-2抗体/抗原检测微流控生物芯片具有良好的重现性。

实施例6

在实际应用中，所有的生物标志物都与大量的生物物质混合在血清或其他体液中，要求高性能的检测平台具有良好的规格和灵敏度。在进行血清样品分析之前，有必要使用混合目标样品对平台进行测试。首先将S抗原蛋白和N抗原蛋白混合到1％BSA或健康血清中，形成3个不同浓度的样品，将4种靶向IgG/IgM抗体混合到1％BSA或健康血清中，形成3个样品，如表2所示。

表2每个样本中重组SARS-CoV-2抗原/抗体的混合浓度

测量靶抗原的荧光定量分析，如图13(a)-(c)所示。混合BSA和健康血清中靶抗体的荧光定量分析如图13(d)-(f)所示。根据图6中的关系式得出的试验浓度如图13(g)-(l)所示，回收率为90.36％～109.98％。此外，加标1％BSA中检测到的生物标记物浓度与加标健康血清中的生物标记物浓度一致，并且显示出小于5％的轻微偏差，如图14所示。这些结果为微流控生物芯片的实际应用提供了依据。

实施例7

为了证明微流控生物芯片的高通量和统计灵敏度，我们对不同浓度的SARS-CoV-2抗原/抗体进行了多重检测。在2μL样品量5min范围内检测SARS-CoV-2s抗原、S-IgG和S-IgM。在每个生物芯片上对每种抗原/抗体共60份样品进行检测，其中12个阴性对照(0ng/mL)和16个阳性模拟样品，分别为5、50和100ng/mL三种不同浓度样品。

图15中荧光强度与SARS-CoV-2s抗原、S-IgG和S-IgM(a)S抗原、(b)S-IgG、(c)S-IgM)浓度的关系。(d)—(f)阴性样本和阳性样本之间的统计比较。p<0.05，两组间差异有统计学意义。试验结果如图15(a)-(c)所示，该图显示不同样品的清晰荧光信号，且与所制备模拟样品的浓度一致。S抗原、S-IgG和S-IgM的定量荧光强度分别如图16-18所示。图15(d)-(f)显示了检测到的荧光强度的统计分析。阴性对照与阳性模拟样本差异显著，t检验的阳性对照组与阳性对照组比较差异有显著性(p<0.0001)。模拟S抗原、S-IgG、S-IgM在0.001～100ng/mL范围内，回收率为90.36％～109.98％。因此，研制的微流控生物芯片为SARS-CoV-2抗原/抗体的检测和分析提供了一种新的高通量、快速的同时检测分析方法。

实施例8与商业酶联免疫吸附试验(ELISA)对比试验

1、SARS-CoV-2igg/IgM/抗原的ELISA检测。

将SARS-CoV-2抗体或抗原固定在ELISA平板的每个孔上。然后将100μL的靶抗原/抗体样品引入ELISA平板的每个孔中。在室温下培养2小时后，从每个孔中取出样品，用1％BSA冲洗底物5次。然后添加100μL相应的酶联抗体/抗原，以结合附着在固体载体上的抗原/抗体。孵育2小时后，从每个孔中去除相应的酶联抗体/抗原，并用1％BSA冲洗底物5次。最后加入底物溶液，催化引起颜色变化，可以测量。(选用ELISA对比是因为该方法也是使用蛋白质生物标记物分析的方法。)

2、微流控生物芯片检测SARS-CoV-2igg/IgM/抗原

如实施例2的方法进行检测。

3、结果

SARS-CoV-2s抗原和S-IgG的ELISA检测程序如图19所示，耗时约4.5小时。SARS-CoV-2s抗原和S-IgG的ELISA检测结果如图20所示，用SARS-CoV-2s抗原和S-IgG(S抗原在图20中的(a)中，S-IgG在图20的(b)中)生成校准曲线和阴性对照线。误差线是由重复测量产生的。来自96孔板的化学发光信号，用于检测各种浓度的分析物(c中的S-抗原和d中的S-IgG))。

ELISA检测对健康血清和1％BSA样品的检测限均为1ng/ml，线性范围为1-100ng/ml。在ELISA检测范围内，我们的生物芯片与市售ELISA检测结果的比较如图21所示，具体分析数据如表3所示，回收率为97.19-103.01％。

表3应用微流控生物芯片和ELISA方法检测健康人血清中加标物的结果

实施例9 SARS-CoV-2抗体不同检测方法的比较

表4 SARS-CoV-2抗体不同检测方法的比较

针对不同的检测方法进行了比较，并总结在表4中。大多数检测方式检测单一生物标志物，检测范围窄，检出限高，定性检测时间大于15min。所提出的微流控生物芯片平台具有5个数量级的相对较大的检测范围，同时检测4个或更多(本发明的生物芯片设计中最多20个)生物标记物，每个样品2μL，高通量(每个生物芯片60个样品)，定性检测不到10min，定量检测不到40min，超低检测限约为0.3pg/mL，从根本上降低了SARS-CoV-2抗原/抗体的检测成本、耗时和传播概率。因此，与已报道的SARS-CoV-2抗原/抗体检测方法相比，所提出的微流控生物芯片策略更适合当前SARS-CoV-2大流行的需要。

本发明开发了一种微流控免疫分析方法，可同时对多种SARS-CoV-2抗原和抗体进行快速(少于10分钟)、高通量(每芯片60个样本)、可靠和超灵敏的检测。该平台融合了纳米材料的优点，将高密度生物分子与微流体结合，实现了高效、低体积、高集成度的生物传感平台。该微流控生物芯片不仅对SARS-CoV-2感染的快速筛查具有巨大的潜在价值，而且为疫苗接种后的有效疫苗筛选提供了有价值的工具。