一种评价或辅助评价海马组织衰老的标志物

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种评价或辅助评价海马组织衰老的标志物。

背景技术

衰老是机体生理功能随时间逐渐恶化的过程，其中中枢神经系统是受衰老影响最大的系统之一，目前衰老也是大多数神经退行性疾病的主要风险因素。随着年龄的增长，神经退行性疾病(例如阿尔茨海默氏病(AD)和帕金森氏病(PD))的患病率迅速上升，并成为亟待解决的科学问题。患者脑功能逐渐衰退，表现为学习记忆，认知，感觉和运动协调等能力的衰退。这些疾病往往以不可逆的形式发展，至今尚无有效的药物治疗，给个人和社会造成沉重负担。与年龄相关的海马功能下降表现为认知能力的损害，并增加了对神经退行性疾病的易感性。海马在空间和情景学习和记忆中起着至关重要的作用。因此，寻找海马衰老标志物，全面了解驱动海马衰老的潜在机制，可以为延缓脑衰老和脑功能的下降提供重要的调控分子，进而为延缓脑衰老及相关神经退行性疾病的干预策略提供重要的理论依据，具有科学和临床意义。

发明内容

本发明一个目的是提供如下应用：

本发明提供了如下1)-8)中至少一种物质在如下A-D中的应用：

A)检测海马组织的衰老程度；

B)评估或预测海马功能退行或衰老导致的相关疾病；

C)制备检测海马组织衰老程度的产品；

D)制备评估或预测海马功能退行或衰老导致的相关疾病的产品；

1)检测SA-β-Gal酶活性的物质；

2)检测Aggresome表达量的物质；

3)检测β-Amyloid(简称为Aβ)(4G8)蛋白或其转录本表达量的物质；

4)检测γH2A.X表达量的物质；

5)检测HP1γ表达量的物质；

6)检测胞质dsDNA表达量的物质；

7)检测LINE-1 ORF2-p蛋白或其转录本表达量的物质；

8)检测H3K9me3表达量的物质。

上述海马组织可为从哺乳动物或人分离的海马组织样本或海马组织的石蜡切片或海马组织的冰冻切片。

上述SA-β-Gal、Aggresome、β-Amyloid(4G8)、γH2A.X、胞质dsDNA、H3K9me3、HP1γ和LINE-1 ORF2-p中至少一个作为标志物在检测海马组织的衰老程度和/或评估或预测海马功能退行或衰老导致的相关疾病中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其包括如下1)-8)中至少一种：

1)检测SA-β-Gal酶活性的物质；

2)检测Aggresome表达量的物质；

3)检测β-Amyloid(简称为Aβ)(4G8)蛋白或其转录本表达量的物质；

4)检测γH2A.X表达量的物质；

5)检测HP1γ表达量的物质；

6)检测胞质dsDNA表达量的物质；

7)检测LINE-1 ORF2-p蛋白或其转录本表达量的物质；

8)检测H3K9me3表达量的物质。

所述产品具有如下a或b的功能：a、检测海马组织的衰老程度，b、评估或预测海马功能退行或衰老导致的相关疾病。

上述中，

所述检测SA-β-Gal酶活性的物质包括用于SA-β-Gal染色的试剂；所述试剂具体包括“能催化底物X-Gal生成蓝色沉淀而被检测到的物质”，在本发明的实施例为表1所示的β-半乳糖苷酶染色液(含有X-gal)。

所述检测Aggresome表达量的物质包括能与Aggresome聚集体特异结合的物质；在本发明的实施例中，物质包括Aggresome染料。

所述检测β-Amyloid(4G8)蛋白或其转录本表达量的物质包括能与β-Amyloid(4G8)蛋白或编码基因转录本特异结合的物质；在本发明的实施例中，具体为免疫荧光染色所需试剂，包括鼠抗β-Amyloid(4G8)。

所述检测γH2A.X表达量的物质包括能与γH2A.X特异结合的物质；在本发明的实施例中，具体为免疫组化染色所需试剂，包括鼠抗γH2A.X。

所述检测HP1γ表达量的物质包括能与HP1γ特异结合的物质；在本发明的实施例中，具体为免疫组化染色所需试剂，包括兔抗HP1γ。

所述检测胞质dsDNA表达量的物质包括能与胞质dsDNA特异结合的物质；在本发明的实施例中，具体为免疫荧光染色所需试剂，包括鼠抗dsDNA；

所述检测LINE-1ORF2-p表达量的物质包括能与LINE-1ORF2-p蛋白或编码基因转录本特异结合的物质；在本发明的实施例中，具体为免疫荧光染色所需试剂，包括鸡抗LINE1-ORF2-p；

所述检测H3K9me3表达量的物质包括能与H3K9me3特异结合的物质；在本发明的实施例中，具体为免疫荧光染色所需试剂，包括兔抗H3K9me3。

上述产品还包括记载如下至少一种方法的可读载体：

1)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中SA-β-Gal酶活性，SA-β-Gal酶活性高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于SA-β-Gal酶活性低的待测海马组织；

2)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中Aggresome表达量，Aggresome表达量高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于Aggresome表达量低的待测海马组织；

3)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中β-Amyloid(4G8)表达量，β-Amyloid(4G8)表达量高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于β-Amyloid(4G8)表达量低的待测海马组织；

4)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中γH2A.X表达量，γH2A.X表达量高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于γH2A.X表达量低的待测海马组织；

5)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中HP1γ表达量，HP1γ表达量低的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于HP1γ表达量高的待测海马组织；

6)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中胞质dsDNA表达量，胞质dsDNA表达量高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于胞质dsDNA表达量低的待测海马组织；

7)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中LINE-1 ORF2-p表达量，LINE-1ORF2-p表达量高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于LINE-1 ORF2-p表达量低的待测海马组织；

8)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中H3K9me3表达量，H3K9me3表达量低的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于H3K9me3表达量高的待测海马组织。

本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测海马组织衰老程度的方法。

本发明提供的方法，为如下1)-8)中至少一种：

1)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中SA-β-Gal酶活性，SA-β-Gal酶活性高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于SA-β-Gal酶活性低的待测海马组织；

2)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中Aggresome表达量，Aggresome表达量高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于Aggresome表达量低的待测海马组织；

3)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中β-Amyloid(4G8)表达量，β-Amyloid(4G8)表达量高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于β-Amyloid(4G8)表达量低的待测海马组织；

4)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中γH2A.X表达量，γH2A.X表达量高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于γH2A.X表达量低的待测海马组织；

5)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中HP1γ表达量，HP1γ表达量低的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于HP1γ表达量高的待测海马组织；

6)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中胞质dsDNA表达量，胞质dsDNA表达量高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于胞质dsDNA表达量低的待测海马组织；

7)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中LINE-1 ORF2-p表达量，LINE-1ORF2-p表达量高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于LINE-1 ORF2-p表达量低的待测海马组织；

8)所示的方法包括如下步骤：检测待测海马组织中H3K9me3表达量，H3K9me3表达量低的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于H3K9me3表达量高的待测海马组织。

上文中，所述高于为统计学上的高于，低于为统计学上的低于。

所述哺乳动物为食蟹猴。

所述哺乳动物为食蟹猴时，年老指18-21岁，年轻指4-6岁。所述人时，年老指大于70岁，年轻指小于20岁。

SA-β-Gal(senescence associatedβgalactosidase):即衰老相关β半乳糖苷酶，是细胞溶酶体中的水解酶，SA-β-gal的活性在衰老的细胞中大幅增加，而它本身可以催化底物X-gal生成蓝色沉淀而被检测到。

Aggresome:在哺乳动物细胞中，聚集蛋白可通过微管依赖性逆行转运而浓缩聚集沉积到核周部位，称为聚集体。聚集体是当泛素-蛋白酶体机制被易于聚集的蛋白淹没时形成的包涵体。通常，聚集体是对某些细胞应激(例如高热，病毒感染或暴露于活性氧)反应而形成的。聚集体似乎可以通过隔离有毒的聚集蛋白来提供细胞保护功能，并且还可以促进它们通过自噬最终从细胞中消除。在脑组织中聚集体通过将蛋白质集中在一个位置而具有神经保护功能，从而有助于通过自噬将其去除。

β-Amyloid(4G8)(基因ID:102120297，更新于2020年10月26日)

γH2A.X：组蛋白是染色质核小体的组成成分，主要有H1、H2A、H2B、H3和H4五种，其中H2A的变体H2A.X的羧基端含有一个保守的色氨酸残基(Ser139),在DNA双链断裂时发生磷酸化反应，磷酸化的H2A.X标记为γH2A.X，因此γH2A.X在DNA损伤修复，基因组稳定性维持方面发挥重要作用。

胞质dsDNA：双链DNA是由两条DNA单链通过碱基互补作用而构成的DNA分子，正常情况下存在于细胞核内，但由于衰老等细胞核内基因组不稳定，DNA损伤修复功能下降，导致细胞核内出现断裂的双链DNA，他们能游离到胞质中，激活先天免疫反应cGAS-STING信号通路。

H3K9me3：组蛋白是染色质核小体的组成成分，主要有H1、H2A、H2B、H3和H4五种，H3K9是指组蛋白H3上的第九个赖氨酸，该赖氨酸可以被甲基化，加一个甲基就是me1(mono-methylation)，两个甲基me2(di-methylation)，三个甲基me3(tri-methylation)即为H3K9me3。组蛋白发生了化学修饰，如甲基化，乙酰化等修饰或者染色质三维结构发生改变，从而影响了基因的表达，这种现象被称为“表观遗传”改变。

HP1γ(基因ID:102146395，更新于2021年2月12日)。

LINE-1ORF2-p(基因ID:102143050，更新于2020年6月24日)。

本发明的发明人通过SA-β-Gal染液检测，Aggresome染料检测，免疫组化和免疫荧光检测，发现SA-β-Gal、Aggresome、β-Amyloid(4G8)(基因ID:102120297，更新于2020年10月26日)、γH2A.X、胞质dsDNA、H3K9me3、HP1γ和LINE-1ORF2-p(基因ID:102143050，更新于2020年6月24日)中的至少一个可以作为标志物区分衰老海马组织和年轻海马组织。利用上述标志物可以评估脑衰老相关疾病，还可以检测人类脑功能等。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为SA-β-Gal染色鉴定衰老海马组织衰老相关的β半乳糖苷酶活性的情况。

图2为Aggresome染色鉴定衰老海马组织蛋白聚集体的表达和定位情况。

图3为免疫组化染色鉴定衰老海马组织分子标志物γH2A.X的表达和定位情况。

图4为免疫组化染色鉴定衰老海马组织分子标志物HP1γ的表达和定位情况。

图5为免疫荧光染色鉴定衰老海马组织分子标志物β-Amyloid(简称为Aβ)(4G8)的表达和定位情况。

图6为免疫荧光染色鉴定衰老海马组织分子标志物胞质dsDNA的表达和定位情况。

图7为免疫荧光染色鉴定衰老海马组织分子标志物LINE-1ORF2-p的表达和定位情况。

图8为免疫荧光染色鉴定衰老海马组织分子标志物H3K9me3的表达和定位情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，X-gal购自Amresco；Aggresome染料(

下述实施例中的猴子均为食蟹猴，食蟹猴实验是基于《非人类灵长类动物的伦理对待准则》进行的，并已通过中国科学院动物研究所的伦理审批。

下述实施例中的食蟹猴，年老指18-21岁，年轻指4-6岁，来自东南亚，在经过认证的北京灵长类动物研究中心中以25℃，12h的光照和黑暗周期饲养。

实施例1、衰老海马组织β半乳糖苷酶活性的检测

一、海马组织收集

麻醉食蟹猴并用生理盐水灌注，灌注完成且脑组织变白后，将每个脑的右半球固定在4％多聚甲醛中以进行组织学分析。根据脑区将每个脑的左半球分开，并在液氮中冷冻。海马位于颞叶内侧。在冰上小心地挑选出海马组织，将它们按顺序分成几部分，放入冻存管中，然后将其储存在液氮中(在分离冻存的组织时用于实验开始时技术有限，一只雌性年轻个体被排除)。

选用8个年轻食蟹猴的海马组织和8个年老食蟹猴的海马组织作为实验对象。

二、海马组织冰冻切片制备

将冻存管中存储的海马组织放入由75％(体积百分含量)乙醇和4％多聚甲醛(g：ml，质量体积比，溶质为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，溶剂为超纯水)组成的混合溶液(4％多聚甲醛将100％乙醇稀释为75％得到的溶液)中，并在4℃摇床上摇晃3小时。将溶液换为4％多聚甲醛溶液(g：ml，质量体积比，溶质为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，溶剂为超纯水)，并在4℃摇床上摇晃过夜。将溶液换为5％蔗糖溶液(g：ml，质量体积比，溶质为蔗糖，溶剂为1xPBS溶液(pH值为7.3，PBS粉末购自中杉金桥，货号ZLI-9063)，并在4℃摇床上摇晃3小时。然后将溶液换为30％蔗糖溶液(g：ml，质量体积比，溶质为蔗糖，溶剂为1xPBS溶液)，并在4℃摇床上摇晃过夜，直到组织完全下沉。使用Leica CM3050S冷冻切片机将OCT(optimalcutting temperature compound)嵌入的脱水处理后的海马组织冰冻切片，厚度为10μm，收集在载玻片上，并保持在–80℃直至使用。

三、SA-β-Gal染色检测

SA-β-Gal染色：

衰老相关β-半乳糖苷酶染色是一种基于衰老时SA-β-Gal(senescence-associated-β-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法。以年老食蟹猴海马和年轻食蟹猴海马为供试组织进行SA-β-Gal染色：

1、上述二制备的海马组织冰冻切片从-80冰箱中取出；

2、1xPBS溶液(pH值为7.3，PBS粉末购自中杉金桥，货号ZLI-9063)清洗去除OCT；

3、2％(体积百分含量，稀释在pH 7.3的1xPBS溶液中)甲醛+0.2％(体积百分含量，稀释在pH 7.3的1xPBS溶液中)异戊醛固定，不超过5分钟；

4、PBS清洗2次；

5、加入如下表1配方的染色液，37度避光孵育72小时。

上述染色液配方如下表1所示：

表1为β-半乳糖苷酶染色液配方

柠檬酸/磷酸钠缓冲液配方：63.15mL 200mM磷酸钠和36.85mL 100mM柠檬酸混合调PH至6.0配制成柠檬酸/磷酸钠缓冲液。

6、1xPBS缓冲液PH7.3清洗2次；

7、蔡司900激光共聚焦显微镜下观察成像。

以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况，并进一步对SA-β-Gal染色阳性区域面积(单位为平方毫米)进行定量统计分析。

染色结果来自7个年轻和8个年老的食蟹猴个体的海马冰冻切片(含有β-半乳糖苷酶)。

检测结果和定量结果见图1，左图为检测结果，右图为定量结果(每组柱形图中，左边为年轻，右边为年老)，DG为海马齿状回区域、CA1为海马CA1区域，CA3为海马CA3区域，结果表明，与年轻海马组织相比，年老海马组织中SA-β-Gal染色阳性区域面积显著增加。

上述结果表明，SA-β-Gal酶活性可以作为检测海马衰老程度的标志物，具体如下：检测待测海马组织中SA-β-Gal酶活性，SA-β-Gal酶活性高(SA-β-Gal染色阳性区域面积大)的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于SA-β-Gal酶活性低(SA-β-Gal染色阳性区域面积小)的待测海马组织。

检测待测海马组织中SA-β-Gal酶活性采用的物质包括：含有底物X-gal的β-半乳糖苷酶染色液。

实施例2、衰老海马组织Aggresome的检测

一、海马组织石蜡切片制备

1、固定在4％多聚甲醛溶液(g：ml，质量体积比，溶质为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，溶剂为超纯水)中的海马组织在一系列梯度酒精(70％-100％)中脱水；

2、将组织包埋在石蜡中；

3、使用旋转切片机切成5μm的厚度；

4、将切片放在显微镜载玻片上，在56℃下干燥2小时，然后在室温(RT)下保存。

上述海马组织分别源于8个年轻食蟹猴个体和8个年老的食蟹猴个体，具体收集方法与实施例1的一相同。

二、海马组织Aggresome染色

1、依次用100％，100％和100％(体积百分含量)的二甲苯和100％，100％，90％，90％，80％，70％(体积百分含量)的梯度乙醇将上述一得到的海马组织石蜡切片脱蜡并水化；

2、将切片用0.3％(体积百分含量)Triton X-100通透7分钟；

3、与Aggresome染料(

4、将切片在1％(体积百分含量)乙酸中脱色30分钟；

5、接下来，将切片在室温下用PBS(1x、pH值7.3)洗涤3次(每次10分钟)；

6、用Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific)复染。

使用共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss 900)获得图像。

染色结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的海马石蜡切片。检测结果和定量结果见图2，左图为检测结果，右图为定量结果(每组柱形图中，左边为年轻，右边为年老)，DG为海马齿状回区域、CA1为海马CA1区域，CA3为海马CA3区域，纵坐标为Aggresome染色阳性的细胞比例。结果表明，与年轻海马组织相比，年老海马组织中Aggresome染色阳性的细胞比例显著增加。

上述结果表明，Aggresome可以作为检测海马衰老程度的标志物，具体如下：检测待测海马组织中Aggresome表达量(表达量用染色阳性的细胞比例衡量)，Aggresome表达量高(染色阳性的细胞比例高)的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于Aggresome表达量低(染色阳性的细胞比例低)的待测海马组织。

检测待测海马组织中Aggresome染色阳性的细胞比例采用的物质包括：含有Aggresome染色相关试剂。

实施例3、衰老海马组织分子标志物γH2A.X、HP1γ、β-Amyloid(4G8)、dsDNA、H3K9me3或LINE-1ORF2-p的检测

一、海马组织免疫组化染色

1.依次用100％，100％和100％(体积百分含量)的二甲苯和100％，100％，90％，90％，80％，70％(体积百分含量)的梯度乙醇将海马组织石蜡切片脱蜡并水化；

2.将切片置于1x柠檬酸盐缓冲液,PH6.0(购自中杉金桥，货号ZLI-9065)中加热5次，每次3分钟，进行抗原修复；

3.冷却至室温后，将切片在1xPBS溶液(pH值为7.3，PBS粉末购自中杉金桥，货号ZLI-9063)中漂洗3次；

4.用0.4％(体积百分含量，稀释在1xPBS溶液(pH值为7.3，PBS粉末购自中杉金桥，货号ZLI-9063)中)Triton X-100溶液透化2小时；

5.然后再次在1xPBS,PH7.3中漂洗3次。然后将切片与3％(体积百分含量)H2O2孵育10分钟以灭活内源性过氧化物酶；

6.然后将切片用10％(体积百分含量)驴血清封闭1h；

7.与一抗在4℃下孵育过夜，一抗为鼠抗γH2A.X或兔抗HP1γ(不同标志物对应不同抗体)；

8.第二天，将切片与结合了HRP的对应的二抗(驴抗兔IgG(H+L)二抗或驴抗小鼠IgG(H+L)二抗)在室温下孵育1小时；

9.根据制造商的说明使用DAB试剂盒(购自中杉金桥，货号ZLI-9018)显色；

10.切片在流水中重洗数次；

11.用苏木精染色液(购自中杉金桥，货号ZLI-9620)染色5分钟，流水稍洗去苏木精染色液1-3秒；

12. 1％(体积百分含量)盐酸乙醇1-3秒，水洗10-30秒；

13.最后将切片在一系列中级醇(50％，70％，80％，90％，100％和100％)和二甲苯中脱水；

14.使用中性树胶封片。

上述海马组织分别源于8个年轻食蟹猴个体和8个年老的食蟹猴个体，具体收集方法与实施例1的一相同。

使用PerkinElmer Vectra Polaris系统拍摄成像。

染色结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的海马石蜡切片。检测结果和定量结果见图3-4，图3为免疫组化染色鉴定衰老海马组织分子标志物γH2A.X的表达和定位情况，图4为免疫组化染色鉴定衰老海马组织分子标志物HP1γ的表达和定位情况；每个图左图均为检测结果，右图均为定量结果(每组柱形图中，左边为年轻，右边为年老)，DG为海马齿状回区域、CA1为海马CA1区域，CA3为海马CA3区域，图3和图4的纵坐标分别为γH2A.X和HP1γ染色阳性的细胞比例。结果表明，与年轻海马组织相比，年老海马组织中γH2A.X染色阳性的细胞比例显著增加(图3)，HP1γ染色阳性的细胞比例显著降低(图4)。

二、海马组织免疫荧光染色

1.依次用100％，100％和100％(体积百分含量)的二甲苯和100％，100％，90％，90％，80％，70％(体积百分含量)的梯度乙醇将海马组织石蜡切片脱蜡并水化；

2.将切片置于1x柠檬酸盐缓冲液,PH6.0(购自中杉金桥，货号ZLI-9065)中加热5次，每次3分钟，进行抗原修复；

3.冷却至室温后，将切片在1xPBS溶液(pH值为7.3，PBS粉末购自中杉金桥，货号ZLI-9063)中漂洗3次；

4.用0.4％(体积百分含量)Triton X-100的浓度、pH值PBS透化2小时；

5.然后将切片用10％(体积百分含量)驴血清(购自Jackson，货号017-000-121)封闭1h；

6.与一抗在4℃下孵育过夜，一抗为鼠抗β-Amyloid(4G8)、鼠抗dsDNA、兔抗H3K9me3或鸡抗LINE1-ORF2-p(不同标志物对应不同抗体)；

7.第二天，将切片与荧光二抗(驴抗小鼠IgG(H+L)二抗、驴抗兔IgG(H+L)二抗或驴抗鸡IgG(H+L)二抗)在室温下孵育1小时；

8. 1xPBS缓冲液PH7.3洗涤3次，之后进行Hoechst 33342染色；

9.切片用1xPBS缓冲液PH7.3洗涤3次，用

10.使用共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss 900)获得图像。

上述海马组织分别源于8个年轻食蟹猴个体和8个年老的食蟹猴个体，具体收集方法与实施例1的一相同。

染色结果来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的海马石蜡切片。检测结果和定量结果见图5-8，图5为免疫荧光染色鉴定衰老海马组织分子标志物β-Amyloid(4G8)的表达和定位情况，图6为免疫荧光染色鉴定衰老海马组织分子标志物胞质dsDNA的表达和定位情况，图7为免疫荧光染色鉴定衰老海马组织分子标志物LINE-1ORF2-p的表达和定位情况，图8为免疫荧光染色鉴定衰老海马组织分子标志物H3K9me3的表达和定位情况；左图均为检测结果，右图均为定量结果(每组柱形图中，左边为年轻，右边为年老)，DG为海马齿状回区域、CA1为海马CA1区域，CA3为海马CA3区域，图5-图8的纵坐标分别为β-Amyloid(4G8),胞质定位的dsDNA,LINE-1ORF2-p和H3K9me3染色阳性的细胞比例。结果表明，与年轻海马组织相比，年老海马组织中β-Amyloid(4G8)，胞质定位的dsDNA和LINE-1ORF2-p染色阳性的细胞比例显著增加(图5-图7)，H3K9me3染色阳性的细胞比例显著降低(图8)。

上述结果表明，γH2A.X、HP1γ、胞质dsDNA、LINE-1ORF2-p或H3K9me3均可以作为检测海马衰老程度的标志物，具体如下：

检测待测海马组织中γH2A.X表达量，γH2A.X表达量高(染色阳性的细胞比例高)的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于γH2A.X表达量低(染色阳性的细胞比例低)的待测海马组织。检测待测海马组织中γH2A.X表达量采用的物质包括：用于免疫荧光染色检测的鼠抗γH2A.X。

检测待测海马组织中HP1γ表达量，HP1γ染色阳性的细胞比例低的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于HP1γ染色阳性的细胞比例高的待测。检测待测海马组织中HP1γ染色阳性的细胞比例采用的物质包括：用于免疫荧光染色检测的兔抗HP1γ。

检测待测海马组织中β-Amyloid(4G8)染色阳性的细胞比例，β-Amyloid(4G8)染色阳性的细胞比例高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于β-Amyloid(4G8)染色阳性的细胞比例低的待测。检测待测海马组织中β-Amyloid(4G8)染色阳性的细胞比例采用的物质包括：用于免疫荧光染色检测的鼠抗β-Amyloid(4G8)。

检测待测海马组织中胞质定位的dsDNA染色阳性的细胞比例，胞质定位的dsDNA染色阳性的细胞比例高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于胞质定位的dsDNA染色阳性的细胞比例低的待测。检测待测海马组织中胞质定位的dsDNA染色阳性的细胞比例采用的物质包括：用于免疫荧光染色检测的鼠抗dsDNA。

检测待测海马组织中LINE-1ORF2-p染色阳性的细胞比例，LINE-1ORF2-p染色阳性的细胞比例高的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于LINE-1ORF2-p染色阳性的细胞比例低的待测。检测待测海马组织中LINE-1ORF2-p染色阳性的细胞比例采用的物质包括：用于免疫荧光染色检测的鸡抗LINE-1ORF2-p。

检测待测海马组织中H3K9me3染色阳性的细胞比例，H3K9me3染色阳性的细胞比例低的待测海马组织的衰老程度大于或候选大于H3K9me3染色阳性的细胞比例高的待测。检测待测海马组织中H3K9me3染色阳性的细胞比例采用的物质包括：用于免疫荧光染色检测的兔抗H3K9me3。

上述结果表明，SA-β-Gal、Aggresome、β-Amyloid(4G8)、γH2A.X、胞质dsDNA、H3K9me3、HP1γ和LINE-1ORF2-p均为衰老海马组织标志物。