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一种有限自我复制mRNA分子系统、制备方法及应用

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本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种有限自我复制mRNA分子系统、制备方法及应用。本发明的有限自我复制mRNA分子系统包括编码甲病毒属突变型复制酶的第一mRNA，以及至少一个编码目标蛋白的第二mRNA，通过在突变型复制酶的nsP2亚单元产生特异突变调整，使该有限自我复制mRNA分子系统能够实现有限自我复制，避免产生细胞毒性；通过将突变型复制酶及不同的目标蛋白构建不同的mRNA，第一mRNA编码的突变型复制酶能够同时有限复制多个不同的目标蛋白，实现多重目标蛋白的持续表达。

著录项

公开/公告号CN113846113A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-12-28

原文格式PDF
申请/专利权人臻赫医药(杭州)有限公司;
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申请/专利号CN202111080355.2
发明设计人王刚;于寅;黄健;易桦林;
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申请日2021-09-15
分类号C12N15/54(20060101);C12N15/10(20060101);C12N5/10(20060101);C12N15/87(20060101);C12N15/26(20060101);C12N15/12(20060101);C12N15/37(20060101);C12N15/38(20060101);C12N15/44(20060101);C12N15/49(20060101);C12N15/34(20060101);C12N15/55(20060101);A61K39/00(20060101);A61K39/39(20060101);A61K48/00(20060101);A61P35/00(20060101);A61P37/02(20060101);
代理机构44374 深圳国新南方知识产权代理有限公司;
代理人周纯
地址 310000 浙江省杭州市余杭区余杭经济开发区临平大道502号1号楼309室
入库时间 2023-06-19 13:27:45

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2022-09-13

授权

发明专利权授予

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种有限自我复制mRNA分子系统、制备方法及应用。

【背景技术】

信使RNA(mRNA)疗法是一种全新的治疗方式，具有广泛的临床应用潜力，包括针对传染源的疫苗以及针对癌症或遗传疾病的治疗、再生疗法和免疫疗法。与基于蛋白质的生物制剂相比，信使RNA疗法的优势包括信使RNA可以通过机体自身的细胞合成蛋白，不需要复杂的蛋白质合成及纯化工艺或生产线；可以将细胞内和膜结合蛋白作为治疗靶点；可以快速无细胞GMP条件下工业化生产，研发到产品的周期短等。

但是信使RNA疗法的应用受到结构不稳定、先天免疫原性、体内递送低效等因素的限制，该技术发展的方向在于：第一，它必须避免先天免疫系统排斥，先天免疫系统会将治疗性信使RNA误认为非自身核酸，从而产生排斥，这对于信使RNA治疗药物的重复给药尤其重要，因为免疫记忆可能会限制药物产品的有效性。目前有研究认为通过化学修饰信使RNA的核苷酸碱基可以降低先天免疫排斥，从而提高信使RNA的翻译为蛋白的效率，但是如何进行核苷修饰，修饰的比例和如何进行核苷酸修饰组合尚不清楚。第二，普通信使RNA不稳定，容易降解且表达持续的时间不长，有研究表明普通信使RNA在细胞中仅能表达24小时。自我复制的信使RNA，因其可以自我复制，可以放大信使RNA的蛋白翻译指令，可以增强和延长信使RNA蛋白的表达。现有技术中采用的自我复制信使RNA分子系统源自甲病毒的基因组骨架，其中编码病毒RNA复制酶部分骨架是完整的，编码病毒的结构蛋白骨架被取代为编码目标蛋白序列。该信使RNA分子系统有如下缺陷：首先，相对于非自我复制的信使RNA，自我复制信使RNA核苷酸序列要长很多，细胞负担重，体外转录合成信使RNA有技术难度，工业化生产成本高；其次，自我复制信使RNA分子系统实质为能够自我复制的RNA假病毒，其病毒属性明显，例如无法预测其复制的次数，存在无限复制的可能(体内假病毒繁殖)，例如，水泡性口炎病毒抗原和狂犬病病毒抗原被包装为上述的自我复制RNA时存在从而放大其毒性的可能；第三，上述的信使RNA分子系统的细胞毒性大，而且由于无法对其进行核苷修饰而导致细胞或者机体的免疫反应大大超过非自我复制信使RNA。

因此，有必要提供一种有限自我复制的信使RNA分子系统。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种有限自我复制mRNA分子系统、制备方法及应用，以解决现有技术中mRNA无法实现有限自我复制的技术问题。

本发明第一方面提供了一种有限自我复制mRNA分子系统，包括：

编码甲病毒属突变型复制酶的第一mRNA；以及

至少一个编码目标蛋白的第二mRNA；

其中，所述突变型复制酶产生nsP2区域的第259位的突变以及nsP2区域的第650位的突变。

可选地，所述突变型复制酶包括依次连接的nsP1区域、nsP2区域、nsP3区域以及nsP4区域，所述突变型复制酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变型复制酶产生在SEQ ID NO.1所示的796位点的丝氨酸S突变为脯氨酸P以及在SEQ ID NO.1所示的1187位点的精氨酸R突变为天冬氨酸D。

可选地，所述第一mRNA包括突变型复制酶编码序列，所述突变型复制酶编码序列包括如SEQ ID NO.2所示的核酸序列对应的RNA序列；

每个所述第二mRNA包括依次连接的复制酶5’端特异性序列、目标蛋白编码序列以及复制酶3’端特异性序列，所述复制酶5’端特异性序列包括如SEQ ID NO.7所示的核酸序列对应的RNA序列，所述复制酶3’端特异性序列包括如SEQ ID NO.8所示的核酸序列对应的RNA序列。

可选地，所述第一mRNA和所述第二mRNA还包括：5’帽结构、5’UTR序列、3’UTR序列以及多聚腺苷酸序列；

其中，所述第一mRNA按照5’→3’方向依次包括如下元件：5’帽结构、5’UTR序列、突变型复制酶编码序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸序列；

每个所述第二mRNA按照5’→3’方向依次包括如下元件：5’帽结构、5’UTR序列、复制酶5’端特异性序列、目标蛋白编码序列、复制酶3’端特异性序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸序列；

所述5’UTR序列包括如SEQ ID NO.9所示的核酸序列对应的RNA序列，所述3’UTR序列包括如SEQ ID NO.10所示的核酸序列对应的RNA序列，所述5’帽结构选自3′-O-Me-m7G、m7 GpppG、m 2 7,3′-O GpppG、m 7 Gppp(5')N1或m 7 Gppp(m 2′-O)N1中的至少一种。

可选地，所述第一mRNA或所述第二mRNA中部分或全部的尿嘧啶进行了能够提高所述第一mRNA在生物体内稳定性的化学改性，所述化学改性包括利用N1-甲基假尿苷置换所述第一mRNA中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶；

或，所述第一mRNA和所述第二mRNA被RNase III处理，所述第一mRNA和所述第二mRNA经快速蛋白质液相色谱提纯。

可选地，所述目标蛋白包括SARS-CoV-2的抗原性多肽；

或，所述目标蛋白包括白细胞介素-2和不含氨基的甲胎蛋白；

或，所述目标蛋白包括HPV6的L1蛋白、HPV11的L1蛋白、HPV16的L1蛋白、HPV18的L1蛋白和HPV的E6蛋白；

或，所述目标蛋白包括HSV的包膜糖蛋白E和HSV的包膜糖蛋白D；

或，所述目标蛋白包括流感病毒HA抗原；

或，所述目标蛋白包括HIV的Gag抗原、HIV的EnV抗原和HIV的CD40L；

或，所述目标蛋白包括非洲猪瘟病毒的NL-S蛋白、非洲猪瘟病毒的cd2v ep402r蛋白和非洲猪瘟病毒的TK蛋白；

或，所述目标蛋白包括Taffazin蛋白；

或，所述目标蛋白包括c-Myc蛋白、Klf4蛋白、Sox2蛋白、OCT4蛋白和Lin28蛋白；

或，所述目标蛋白包括Cas9蛋白和DNAJC19蛋白；

或，所述目标蛋白包括水解GFP蛋白。

本发明第二方面提供了一种有限自我复制mRNA分子系统的制备方法，包括：

合成第一mRNA；

合成至少一个第二mRNA；

其中，第一mRNA编码甲病毒属突变型复制酶，第二mRNA编码目标蛋白，所述突变型复制酶产生nsP2区域的第259位的突变以及nsP2区域的第650位的突变。

可选地，还包括：

利用RNase III对所述第一mRNA和所述第二mRNA进行处理；

利用快速蛋白质液相色谱对所述第一mRNA和所述第二mRNA进行提纯。

可选地，所述合成第一mRNA，包括：

合成突变型复制酶DNA编码序列，其中，所述突变型复制酶DNA编码序列包括如SEQID NO.9所示的5’非翻译区DNA序列、如SEQ ID NO.2所示的突变型复制酶编码序列、如SEQID NO.10所示的3’非翻译区DNA序列；

通过PCR在所述突变型复制酶DNA编码序列上添加mRNA的poly-(a)尾巴得到第一mRNA的DNA合成模版；

将所述第一mRNA的DNA合成模版进行体外转录合成第一mRNA。

可选地，所述合成第二mRNA，包括：

合成特异性修饰的目标蛋白DNA编码序列，其中，所述特异性修饰的目标蛋白DNA编码序列包括如SEQ ID NO.9所示的5’非翻译区DNA序列、如SEQ ID NO.7所示的复制酶5’端特异性DNA序列、目标蛋白DNA编码序列、如SEQ ID NO.8所示的复制酶3’端特异性DNA序列、如SEQ ID NO.10所示的3’非翻译区DNA序列；

通过PCR在所述特异性修饰的目标蛋白DNA编码序列上添加mRNA的poly-(a)尾巴得到第二mRNA的DNA合成模版；

将所述第二mRNA的DNA合成模版进行体外转录合成第二mRNA。

本发明第三方面提供了一种生物材料，所述生物材料为A1)至A6)中的任一种：

A1)编码所述第一mRNA的核酸分子；

A2)编码所述第二mRNA的核酸分子；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述核酸分子的重组载体；

A5)含有A3)所述重组载体以及的转基因动物细胞系；

A6)含有A4)所述重组载体的转基因动物细胞系。

本发明第四方面提供了一种药物组合物，包括上述的有限自我复制mRNA分子系统中的至少一种，以及递送载体。

本发明第五方面提供了上述编码甲病毒属突变型复制酶的第一mRNA在制备调节免疫系统的佐剂的用途，其中，所述突变型复制酶产生nsP2区域的第259位的突变以及nsP2区域的第650位的突变。

本发明第六方面提供了上述的有限自我复制mRNA分子系统或上述的生物材料或上述的药物组合物在制备细胞重编辑试剂中的用途、在制备基因编辑试剂中的用途、在制备Barth综合征治疗药物中的用途、在制备感染性疾病疫苗中的用途或在制备肿瘤疫苗中的用途。

本发明的有限自我复制mRNA分子系统包括编码甲病毒属突变型复制酶的第一mRNA，以及至少一个编码目标蛋白的第二mRNA，通过在突变型复制酶的nsP2亚单元产生特异突变调整，使该有限自我复制mRNA分子系统能够实现有限自我复制，避免产生细胞毒性；通过将突变型复制酶及不同的目标蛋白构建不同的mRNA，第一mRNA编码的突变型复制酶能够同时有限复制多个不同的目标蛋白，实现多重目标蛋白的持续表达。

【附图说明】

图1为本发明小鼠Barth综合症模型治疗实验的心脏射血份数效果图；

图2为本发明小鼠Barth综合症模型治疗实验的心脏病理评价染色图；

图3为本发明有限自我复制mRNA分子系统功能半衰期及细胞先天免疫排斥结果图；

图4为本发明有限自我复制mRNA分子系统低细胞毒性效应结果图；

图5为本发明有限自我复制mRNA分子系统应用于细胞重编程结果对比图；

图6为本发明有限自我复制mRNA分子系统应用于细胞重编程产物染色结果图；

图7为本发明有限自我复制mRNA分子系统应用于基因编辑的结果图；

图8为本发明有限自我复制mRNA分子系统的结构原理图。

【具体实施方式】

下面将结合本发明实施例中的附图，对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本发明的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

正链RNA病毒基因组是翻译和复制的模板，其导致宿主翻译因子(hosttranslation factor)与RNA复制之间在多水平相互作用。所有已知的正链RNA病毒均携带用于基因组复制的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的基因。然而，不同于其它RNA病毒，正链RNA病毒不将该RNA聚合酶壳体化。因此，在新细胞感染时，直至基因组RNA进行翻译以产生RNA聚合酶(对于大部分正链RNA病毒而言还有复制因子)时，才开始病毒RNA复制。所有特征化的正链RNA病毒均将其RNA复制复合体装配到细胞内膜上。正链RNA病毒在复制过程中产生负链RNA、正链RNA、双链RNA(dsRNA)和亚基因组mRNA，这些物质自身即是先天性免疫应答途径的强诱导剂。

正链RNA病毒基因组具有与细胞mRNA相同的极性，并且正链RNA病毒基因组RNA能够利用细胞翻译体系进行直接翻译。首先，合成非结构蛋白作为前体多蛋白，并通过病毒蛋白酶将其剪切成成熟的非结构蛋白。然后，在翻译和多蛋白处理后，组装包括RNA聚合酶(RdRp)、附加的非结构蛋白、病毒RNA和宿主细胞因子的复合体。组装形成的复制复合体(RC)进行病毒RNA的合成。

“RNA依赖型RNA聚合酶”或“RdRp”为一种具有催化由RNA模板从头合成RNA的酶活性的酶、蛋白质或肽。复制酶是一种具有RdRp活性，并催化特定病毒RNA复制的病毒多蛋白或多蛋白加工产物的复合体。RdRp和复制酶通常由具有RNA基因组的病毒编码。因此，复制酶不但提供RNA依赖型RNA聚合酶的功能，而且还进一步包括提供除RdRp活性以外的其它功能的额外的病毒非结构性多蛋白亚单元。

“重组载体”是指以核酸序列形式携带基因信息的基于DNA或RNA的载体或质粒。术语“质粒”、“载体”、“重组载体”和/或“表达载体”在本文中可互用。

本发明实施例提供了一种有限自我复制mRNA分子系统，包括一个第一mRNA以及至少一个第二mRNA，其中，第一mRNA编码甲病毒属突变型复制酶，每个第二mRNA编码一个目标蛋白，通过突变型复制酶实现至少一个目标蛋白的有限复制。

其中，所述突变型复制酶产生nsP2区域的第259位的突变(丝氨酸S突变为脯氨酸P)以及nsP2区域的第650位的突变(精氨酸R突变为天冬氨酸D)。具体地，所述突变型复制酶包括依次连接的nsP1区域(537个氨基酸)、nsP2区域(799个氨基酸)、nsP3区域(482个氨基酸)以及nsP4区域(1254个氨基酸)，所述突变型复制酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变型复制酶的两个突变点分别产生在SEQ ID NO.1所示的796位点(丝氨酸S突变为脯氨酸P)以及在SEQ ID NO.1所示的1187位点(精氨酸R突变为天冬氨酸D)。

在本实施例中，请参阅图8所示，可以包括多个第二mRNA，多个第二mRNA分别编码第一个目标蛋白、第二个目标蛋白，…，第N个目标蛋白。

在一个可选的实施方式中，所述第一mRNA包括突变型复制酶编码序列，所述突变型复制酶编码序列包括如SEQ ID NO.2所示的核酸序列对应的RNA序列。如SEQ ID NO.2所示的核酸序列为高GC含量的DNA序列，在不改变对应氨基酸序列的前提下，选用GC含量高的密码子，比野生型复制酶DNA序列GC含量高7～20％，具体地，如SEQ ID NO.2所示的1-1611位对应nsP1区域的高GC含量DNA序列、1612-4008位对应nsP2区域的高GC含量DNA序列、4009-5454位对应nsP3区域的高GC含量DNA序列、5455-9216位对应nsP4区域的高GC含量DNA序列。如SEQ ID NO.11所示的核酸序列为野生型甲病毒的复制酶DNA序列，其中，如SEQ IDNO.11所示的1-1611位对应nsP1区域的原始DNA序列、1612-4008位对应nsP2区域的原始DNA序列、4009-5454位对应nsP3区域的原始DNA序列、5455-9216位对应nsP4区域的原始DNA序列。

在一个可选的实施方式中，每个所述第二mRNA包括依次连接的复制酶5’端特异性序列、目标蛋白编码序列以及复制酶3’端特异性序列，在目标蛋白编码序列的两端分别连接了复制酶识别的特异性序列，以提高目标蛋白编码序列的翻译水平，在不保留整个甲病毒RNA框架体系的前提下，实现与之同样的效果，具体地，所述复制酶5’端特异性序列包括如SEQ ID NO.7所示的核酸序列对应的RNA序列，该复制酶5’端特异性序列来源于复制酶nsP1区域对应原始DNA序列的第1位至第221位；所述复制酶3’端特异性序列包括如SEQ IDNO.8所示的核酸序列对应的RNA序列，该复制酶3’端特异性序列来源于复制酶nsP4区域对应原始DNA序列的倒数第2位至倒数第985位。本实施例的mRNA组合有限复制，彻底去除病毒属性，彻底杜绝目前使用甲病毒载体的病毒体内繁殖可能。

进一步地，所述第一mRNA和所述第二mRNA还包括：5’帽结构、5’UTR序列、3’UTR序列以及多聚腺苷酸序列；其中，所述第一mRNA按照5’→3’方向依次包括如下元件：5’帽结构、5’UTR序列、突变型复制酶编码序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸序列。同样地，每个所述第二mRNA按照5’→3’方向依次包括如下元件：5’帽结构、5’UTR序列、复制酶5’端特异性序列、目标蛋白编码序列、复制酶3’端特异性序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸序列。具体地，目标蛋白编码序列优选为目标蛋白编码基因中开放阅读框(ORF)对应的RNA序列，所述5’UTR序列包括如SEQ ID NO.9所示的核酸序列对应的RNA序列，所述3’UTR序列包括如SEQ ID NO.10所示的核酸序列对应的RNA序列，所述5’帽结构选自3′-O-Me-m7G、m 7 GpppG、m 2 7,3′-OGpppG、m 7 Gppp(5')N1或m 7 Gppp(m 2′-O)N1中的至少一种，优选为3′-O-Me-m7G。多聚腺苷酸序列为包含60～200个腺苷酸的序列；优选地，多聚腺苷酸序列为包含120个腺苷酸的序列。

在本实施例中，所述第一mRNA或第二mRNA中部分或全部的尿嘧啶进行了能够提高所述第一mRNA在生物体内稳定性的化学改性，所述化学改性包括利用N1-甲基假尿苷置换所述第一mRNA中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶。进一步地，在本实施例中，利用N1-甲基假尿苷置换所述第一mRNA或第二mRNA中100％的尿嘧啶，降低先天免疫排斥，提高mRNA翻译为蛋白的效率。

在本实施例中，经重组载体体外转录所得第一mRNA和第二mRNA首先经过RNaseIII处理，随后经快速蛋白质液相色谱提纯，能够进一步提高mRNA翻译为蛋白的效率。

在本实施例中，理论上目标蛋白可以为任意可接受的蛋白或多肽，例如：

有限自我复制mRNA分子系统包括一个第二mRNA，编码SARS-CoV-2的抗原性多肽，该抗原性多肽可以选自SARS-CoV-2的受体结合结构域RBD，SARS-CoV-2的刺突蛋白S1亚基或SARS-CoV-2的刺突蛋白S全长序列；上述刺突蛋白来源于SARS-CoV-2德尔塔突变株或SARS-CoV-2原始株。此时，该有限自我复制mRNA分子系统为mRNA疫苗。

有限自我复制mRNA分子系统包括两个第二mRNA，其中一个编码白细胞介素-2，另一个编码不含氨基的甲胎蛋白。

有限自我复制mRNA分子系统包括五个第二mRNA，分别编码HPV6的L1蛋白、HPV11的L1蛋白、HPV16的L1蛋白、HPV18的L1蛋白和HPV的E6蛋白。

有限自我复制mRNA分子系统包括两个第二mRNA，分别编码HSV的包膜糖蛋白E和HSV的包膜糖蛋白D。

有限自我复制mRNA分子系统包括一个第二mRNA，编码流感病毒HA抗原。

有限自我复制mRNA分子系统包括三个第二mRNA，分别编码HIV的Gag抗原、HIV的EnV抗原和HIV的CD40L。

有限自我复制mRNA分子系统包括三个第二mRNA，分别编码非洲猪瘟病毒的NL-S蛋白、非洲猪瘟病毒的cd2v ep402r蛋白和非洲猪瘟病毒的TK蛋白。

有限自我复制mRNA分子系统包括一个第二mRNA，编码包括Taffazin蛋白。

有限自我复制mRNA分子系统包括五个第二mRNA，分别编码c-Myc蛋白、Klf4蛋白、Sox2蛋白、OCT4蛋白和Lin28蛋白。

有限自我复制mRNA分子系统包括两个第二mRNA，分别编码Cas9蛋白和DNAJC19蛋白。

有限自我复制mRNA分子系统包括一个第二mRNA，编码水解GFP蛋白。

本发明实施例还提供了一种生物材料，所述生物材料包括：(i)编码所述第一mRNA的核酸分子；以及(ii)编码所述第二mRNA的核酸分子。

其中，编码第一mRNA的核酸分子包括如SEQ ID NO.2所示的核酸序列，编码第二mRNA的核酸分子包括依次连接的如SEQ ID NO.7所示的核酸序列、目标蛋白DNA编码序列以及如SEQ ID NO.8所示的核酸序列。

在一个可选的实施方式中，编码第一mRNA的核酸分子包括依次连接的如SEQ IDNO.9所示的核酸序列、如SEQ ID NO.2所示的核酸序列、如SEQ ID NO.10所示的核酸序列以及多聚腺苷酸序列。编码第二mRNA的核酸分子包括依次连接的如SEQ ID NO.9所示的核酸序列、如SEQ ID NO.7所示的核酸序列、目标蛋白DNA编码序列、如SEQ ID NO.8所示的核酸序列、如SEQ ID NO.10所示的核酸序列以及多聚腺苷酸序列。

本发明实施例还提供了一种生物材料，所述生物材料包括：含有编码第一mRNA的核酸分子的第一重组载体；以及含有编码第二mRNA的核酸分子的第二重组载体。

本发明实施例还提供了一种生物材料，所述生物材料包括：含有所述第一重组载体的转基因动物细胞系；以及含有所述第二重组载体的转基因动物细胞系。

实施例1：第一mRNA的合成

步骤一、利用GeneArtTM Gibson

1.1突变型复制酶DNA编码序列：5’非翻译区DNA序列(SEQ ID NO.9)、突变型复制酶编码序列(SEQ ID NO.2)、3’非翻译区DNA序列(SEQ ID NO.10)，其中，突变型复制酶编码序列(SEQ ID NO.2)分为nsP1区域片段(SEQ ID NO.3)、nsP2区域片段(SEQ ID NO.4)、nsP3区域片段(SEQ ID NO.5)、nsP4区域片段(SEQ ID NO.6)四个DNA片段，四个DNA片段均为经过修饰后的高GC含量片段。四个DNA片段以gblock形式直接订购于美国IDT公司。

具体包括如下步骤：按照表1组装Gibson反应，在PCR仪器中50℃反应60分钟，获得PCR产物。

表1 Gibson反应体系

1.2将PCR产物转化One ShotTM TOP10化学感受态大肠杆菌细胞，具体包括如下步骤：

用无核酸酶水按照1:5稀释上述Gibson反应体系(PCR产物)，12μL无核酸酶水和3μLGibson反应体系，混匀，冰上反应；

将1μL稀释液加入One ShotTM TOP10化学感受态大肠杆菌细胞中并混合，转化混合物在冰上孵育20～30分钟；

将细胞在42℃孵育30秒，不要摇晃；

立即将反应管转移到冰上并在冰上孵育2分钟；

加入450μL室温S.O.C.培养液(美国Life Technology)；

37℃下以300rpm摇动1小时；

取100μL，涂细菌培养板(100μg/mL ampicillin or 50μg/mL kanamycin.)；

37℃度过夜，挑选细菌克隆，37℃摇菌，一代测序挑选含正确序列的双突变复制酶序列质粒。

步骤二、通过PCR添加mRNA的poly-(a)尾巴得到第一mRNA的DNA合成模版

其中，poly-(a)尾巴包括120个腺苷酸。

按照表2制备PCR预混液(总体积为200μL，八个反应各25μL)；

表2 PCR预混液的组成

按照表3所示反应条件进行PCR反应；

表3 PCR反应条件

通过凝胶电泳检查PCR产物的质量；

切胶回收PCR产物(QIAquick PCR purification kit,Qiagen,cat.no.28106)，将尾模板的最终浓度调整为100ng/μL，作为体外转录合成第一mRNA的DNA合成模版。

步骤三、体外转录合成第一mRNA

1、按照表4组装mRNA帽结构和核苷酸混合物：

帽子结构3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G RNA cap analog(New England Biolabs,cat.no.S1411S),-Methylcytidine-5′-triphosphate(Me-CTP；Trilink,cat.no.N1014)，N1-methyl-pseudo-UTP(Trilink,cat.no.N1019)，其他组分均来自MEGAscript T7试剂盒(Ambion,cat.no.AM1334)。

表4 mRNA帽结构和核苷酸混合物

2、按照表5组装第一mRNA体外转录体系：

表5 第一mRNA体外转录体系

3、将反应置于PCR仪器在37℃孵育3～6h。

4、向每个样品中添加2μL Turbo DNase(来自MEGAscript T7试剂盒,Ambion,cat.no.AM1334)。

5、轻轻混合并在37℃下孵育15min。

6、使用MEGAclear试剂盒(Ambion,cat.no.AM1908)，纯化经过DNase和RNAa seIII处理的反应；用总共100μL的洗脱缓冲液洗脱修饰的mRNA(50μL的洗脱缓冲液洗脱两次)。

7、使用磷酸酶(Antarctic phosphatase(New England Biolabs,cat.no.M0289S)处理纯化的修饰mRNA。

8、向每个样品(～100μL)中，添加11μL 10×磷酸酶缓冲液，然后添加2μL磷酸酶；轻轻混合样品并在37℃下孵育0.5～1h。

9、洗脱后，在NanoDrop分光光度计中测量修饰的第一mRNA的浓度。预期的总产量应为～50ug(30～70ug范围；一次40μL IVT反应的100μL洗脱体积为300～700ng μL)。通过添加洗脱缓冲液或TE缓冲液(pH 7.0)，将浓度调节至100ng/μL，或者FPLC提纯。

实施例2：第二mRNA的合成

第二mRNA的合成步骤与第一mRNA类似，包括如下步骤：

步骤一、利用GeneArtTM Gibson

其中，特异性修饰的目标蛋白DNA编码序列：5’非翻译区DNA序列(SEQ ID NO.9)、复制酶5’端特异性DNA序列(SEQ ID NO.7)、目标蛋白DNA编码序列(请参见表6)、复制酶3’端特异性DNA序列(SEQ ID NO.8)、3’非翻译区DNA序列(SEQ ID NO.10)。

步骤二、通过PCR在特异性修饰的目标蛋白DNA编码序列上添加mRNA的poly-(a)尾巴得到第二mRNA的DNA合成模版；

步骤三、体外转录合成第二mRNA。

按照上述方法分别合成表6所示的26种第二mRNA。

表6 不同第二mRNA的DNA合成模版

上述的SEQ ID NO.14至SEQ ID NO.39以及SEQ ID NO.47均在不改变原始氨基酸序列的前提下，在对应的原始序列的基础上进行了高GC修饰。

实施例3：

本实施例提供一种药物组合物，多重分子信使RNA和递送载体，其中，多重分子信使RNA包括实施例1制备的第一mRNA以及实施例2制备的第二mRNA-1，递送载体为鱼精蛋白。本实施例中目标蛋白为Taffazin蛋白。

实施例3应用-小鼠Barth综合症模型治疗实验

小鼠基因组引入强力霉素诱导Taffazin蛋白Knock down，建立小鼠Barth综合症模型，通过PCR分析确定进行基因分型DNA，引物：

5’CCATGGAATTCGAACGCTGACGTC 3’(SEQ ID NO.45)；

3’TATGGGCTATGAACTAATGACCC 5’(SEQ ID NO.46)；

本案例只使用雄性，强力霉素以2mg/L浓度置于小鼠饮用水中，同时含有10％蔗糖。

在280μL水中稀释10μL的鱼精蛋白(MEDA制药公司的Protamine Ipex5000)5000IU/ml，按280μL+10μL鱼精蛋白5000，制备0.5mg/ml的鱼精蛋白溶液，多重分子信使RNA(多重分子摩尔比为1:1溶液)0.5mg/ml，在RNA溶液中加入等量的鱼精蛋白溶液，并快速上下吹洗至少10次，室温放置10分钟，制成130纳米鱼精蛋白-RNA纳米颗粒，并置于小鼠皮下泵(ALZET pump,https://www.alzet.com/guide-to-use/scid/)持续给药。

将Barth综合症小鼠(TG)小鼠分为6组：TG1、TG2、TG3、TG4、TG5、TG6；

步骤1：将TG1、TG2、TG3、TG4、TG5、TG6采用强力霉素诱导8周，检测心脏射血份数FS％；

步骤2：将TG1、TG2、TG3、TG4、TG5、TG6采用强力霉素诱导10周(在步骤1的基础上继续诱导)，检测心脏射血份数FS％；

步骤3：将TG1、TG2、TG3、TG4采用实施例3的药物组合物治疗2周后，TG5、TG6无治疗，检测心脏射血份数FS％；

步骤4：将TG1、TG2、TG3、TG4采用实施例3的药物组合物治疗3周后(在步骤3的基础上继续治疗1周)，TG5、TG6无治疗，检测心脏射血份数FS％；

步骤5：将TG1、TG2、TG3、TG4采用实施例3的药物组合物治疗6周后(在步骤4的基础上继续治疗1周)，检测小鼠运动能力。

老鼠是在封闭的电动跑步机上进行的可调节速度和倾角,并配备了电击传送网，电冲击强度1毫安。最初在跑步机上休息30分钟让动物适应环境，测试以10％的坡度和5米/分钟的速度开始。每5分钟逐步增加5米/分钟到最终速度25m/min。

试验分组

A组：野生型小鼠强力霉素诱导8周；

B组：Barth综合症小鼠(TG)强力霉素诱导8周，普通药物组合物(普通信使RNA系统+递送系统)治疗6周，其中，普通信使RNA系统编码Taffazin蛋白；其中，普通信使RNA系统按照现有技术CN201910014953.6中记载的方法制备。

C组：Barth综合症小鼠(TG)强力霉素诱导8周，实施例3的药物组合物治疗6周；

分别对A组、B组和C组进行心脏纤维化用天狼星红染色病理评价。

3.5.1心脏功能指标检测结果

多重分子信使RNA治疗Barth综合症心脏射血份数超声波结果提示多重分子信使RNA治疗Barth综合症可以提高其心脏功能。

图1所示，有限复制多重分子信使RNA系统编码Taffazin蛋白治疗提高先天性心肌病Barth综合症小鼠心脏功能，具体地，Barth综合症小鼠(TG)在强力霉素诱导下Taffazin蛋白功能缺失，出现Barth综合症的症状出现心肌病疾病表型，心脏功能指标-射血份数下降，无治疗的TG5，TG6心脏功能下降，相比之下多重分子信使RNA治疗2周(TG1、2、3、4)，治疗2～3周，心功能好转。

3.5.2小鼠运动能力试验结果

多重分子信使RNA治疗Barth综合症强制运动结果提示多重分子信使RNA治疗Barth综合症可以提高其运动能力。动物最初在跑步机上休息30分钟让动物适应环境，测试以10％的坡度和5米/分钟的速度开始。每5分钟逐步增加5米/分钟到最终速度，25m/min。因此，运动的持续时间为36.8分钟并且行进的距离是507.4m，结果提示模型鼠未能在皮带上保持15m/min和10％的倾斜度，并且没有一个模型鼠能够维持运行，跑步机速度超过20米/分钟，而多重分子信使RNA治疗治疗6周后模型鼠均能够维持运，说明多重分子信使RNA治疗可以明显提高模型鼠运动能力。

3.5.3病理分析结果

图2所示，有限复制多重分子信使RNA系统编码Taffazin蛋白治疗先天性心肌病Barth综合症病理分析。

Barth综合症小鼠(TG)在强力霉素诱导下Taffazin蛋白功能缺失，出现Barth综合症的症状出现心肌病疾病表型，心脏病理提示心脏纤维化，多重分子信使RNA治疗8周明显改善心脏纤维化的程度，且优于普通信使RNA治疗效果。

实施例4：

本实施例提供一种有限自我复制mRNA分子系统，包括实施例1制备的第一mRNA以及实施例2制备的第二mRNA-2，目标蛋白为水解GFP蛋白。

实施例4的应用：分别采用编码水解GFP蛋白的普通mRNA(第一组)、实施例4的双分子mRNA(第二组)以及编码水解GFP的全长自我复制mRNA(第三组)转染细胞，步骤见i-vii，下述表达报告基因水解GFP(表达的GFP会被自带的水解酶迅速降解，可以即时反应多重信使RNA分子的持续时间和表达水平)。

实施例4的有限自我复制mRNA分子系统转染细胞步骤如下：

(i)解冻10μl实施例4的有限自我复制mRNA分子系统(第一mRNA和第二mRNA-2的摩尔比例为6:4)，加入40μl OPTI-MEM，轻轻混合。

(ii)在另外一个试管中，加入45μlOPTI-MEM，加5μl Lipofectamine RNAiMax，轻轻混合。

重复移液。

(iii)将稀释后的Lipofectamine RNAiMax加入稀释后的实施例4的有限自我复制mRNA分子系统中，反复轻轻混匀。

(iv)将混合物在室温下孵育15分钟。

(v)用100μl实施例4的有限自我复制mRNA分子系统/转染试剂复合物均匀加入六孔板的一个孔。

(vi)轻轻地左右摇动板子，以确保转染复合物的均匀扩散。

(vii)放回37℃、5％CO

通过检测GFP蛋白荧光强度，分别检测第一组细胞中mRNA半衰期、第二组细胞中mRNA半衰期以及第三组细胞中mRNA半衰期，并对第一组、第二组和第三组进行细胞先天性免疫反应。

检测第一组、第二组和第三组转染后的细胞数。

实验结果及分析：

请参阅图3所示，实施例4的有限自我复制mRNA分子系统编码报告基因水解GFP相比全链自我复制信使RNA半衰期无差异，但是细胞毒性弱，免疫原性少，比普通信使RNA半衰期长。

请继续参阅图3所示，实施例4的有限自我复制mRNA分子系统有较长的功能半衰期和低的细胞先天性免疫排斥，实施例4的有限自我复制mRNA分子系统的半衰期明显高于普通信使RNA，同全长自我复制信使RNA相似，但细胞先天性免疫反应(INFA，干扰素A)显著低于同全长自我复制信使RNA。

请参阅图4所示，实施例4的有限自我复制mRNA分子系统(有限复制多重信使RNA分子系统)具备低细胞毒性效应，实施例4的有限自我复制mRNA分子系统产生的信使RNA的细胞毒性同普通信使RNA相似，但明显低于同全长自我复制信使RNA。

实施例5：

本实施例提供一种有限自我复制mRNA分子系统，包括实施例1制备的第一mRNA以及实施例2制备的第二mRNA-22、第二mRNA-23、第二mRNA-24、第二mRNA-25、第二mRNA-26，目标蛋白分别为c-Myc蛋白、Klf4蛋白、Sox2蛋白、OCT4蛋白和Lin28蛋白。

实施例5的应用-细胞重编程试验

细胞重编程步骤：

1,用0.1％(wt/vol)明胶，于六孔板每孔加入1ml；

在室温下至少放置1小时。或者，4摄氏度下过夜，接种人类NuFF饲养细胞前1天，通过吸去除明胶并让板在室温下干燥。

2，NuFF饲养细胞(Newborn human foreskin fibroblasts(GlobalStem,cat.no.GSC-3001G)，解冻一瓶有丝分裂灭活的NuFFs并将细胞接种在明胶细胞板上。

3，接种重编程目标成纤维细胞后6-12小时，用Pluriton(stemgent)完全重编程培养基替换成纤维细胞培养基(Pluriton含B18R(eBioscience,cat.no.34-8185-85，200ng/ml))，每孔使用2ml然后，在37℃，5％CO2、5％O2培养基中孵育细胞过夜。

4，使用Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,cat.no.56532))进行转染；

(i)解冻10μl修饰的mRNA混合物(双突变复制酶，OCT4,KLF4,c-MYC,SOX2,LIN28A摩尔比例6:1:1:1:1:1,respectively.100ng/μl)，加入40μl OPTI-MEM，轻轻混合。

(ii)在另外一个试管中，加入45μl OPTI-MEM，加5μlLipofectamine RNAiMax，轻轻混合。

重复移液。

(iii)将稀释后的Lipofectamine RNAiMax加入稀释后的修饰mRNA中，反复轻轻混匀。

(iv)将混合物在室温下孵育15分钟。

(v)用100μl修饰的mRNA/转染试剂复合物均匀加入六孔板的一个孔

(vi)轻轻地左右摇动板子，以确保转染复合物的均匀扩散。

(vii)放回37℃、5％CO

5，每72小时重复上述i-vii步骤，直到重编程细胞克隆出现。

请参阅图5和图6所示，有限复制多重信使RNA分子系统同时放大5个编码细胞重编程因子Otc4,Sox2,Klf4,c-Myc,Lin28(OSKML)重高效完成细胞重编程；对比普通信使RNA该系统有更长蛋白表达，和更高的细胞重编程(iPS克隆数为指标)；实施例5的有限自我复制mRNA分子系统(有限复制多重信使RNA分子系统)产生的细胞重编程产物-iPS细胞显示典型多潜能；实施例5的有限自我复制mRNA分子系统(有限复制多重信使RNA分子系统)编码5重编程因子OSKML完成细胞重编程后产物-iPS细胞显示经典多潜能干细胞克隆外形，多潜能标志物Oct4染色阳性，可以在体内形成畸胎瘤。

实施例6：

本实施例提供一种有限自我复制mRNA分子系统，包括实施例1制备的第一mRNA以及实施例2制备的第二mRNA-3，目标蛋白为Cas9蛋白。

实施例6的应用：基因编辑试验

实施步骤：

实施例6的有限自我复制mRNA分子系统(多重分子信使RNA)在人诱导性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells)中进行DNAJC19基因编辑或Taffazin基因编辑。

1、人诱导性干细胞电转染：按下表7组装基因编辑反应体系，Taffazin基因gRNA序列(SEQ ID NO.40，直接订购于IDT公司)，DNAJC19 gRNA序列(SEQ ID NO.17，直接订购于IDT公司)。

表7 基因编辑反应体系

2、按引物

F:TAAGCTAACCTGTCACCCCA(SEQ ID NO.41)；

R:AGAGCACAGAGGCGAGGCTT(SEQ ID NO.42)；

PCR扩增Taffazin基因片段；

或者，按引物

F：CTCAAAAGACTTCTGTTCTTGAGC(SEQ ID NO.43)；

R：CACTGAACACTGTGATAATCTGCT(SEQ ID NO.44)；

PCR扩增DNAJC19基因片段。

3、Surveyor酶评价人诱导干细胞Taffazin基因编辑或DNAJC19基因编辑((IDT,cat.no.706025)，按下表8组装反应体系，

表8 反应体系

4、混合均匀并在42℃孵育60分钟。

5、加入Surveyor Mutation Detection Kit的1/10体积终止溶液以终止反应和1/6体积DNA。

6、通过4–20％TBE凝胶在200V下电泳约60分钟，分析的Surveyor核酸酶消化产物。

7、在1×TBE中用0.5g/ml溴化乙锭染色凝胶10分钟。在水中清洗凝胶10分钟。

8、使用紫外线透射仪对凝胶进行成像。

实验结果及分析：

请参阅图7所示，实施例6的有限自我复制mRNA分子系统(有限复制多重信使RNA分子系统)编码CRISPR蛋白Cas9，高效编辑DNAJC19和人Taffazin基因。具体地，请参阅图7左，DNAJC19基因成功被基因编辑产生基因突变，并被Surveyor识别剪切，出现3条典型条带，说明高效基因编辑完成，请参阅图7右，Taffazin基因成功被基因编辑产生基因突变，并被Surveyor识别剪切，出现3条典型条带，说明高效基因编辑完成。

实施例7：

本实施例提供一种mRNA疫苗，包括实施例1的第一mRNA、实施例2的第二mRNA-5以及鱼精蛋白，形成130纳米鱼精蛋白RNA粒子进行递送。目标蛋白为SARS-CoV-2的抗原性多肽(野生型的刺突蛋白S)。

本实施例还提供一种mRNA疫苗，包括实施例1的第一mRNA、实施例2的第二mRNA-28以及鱼精蛋白，形成130纳米鱼精蛋白RNA粒子进行递送。目标蛋白为SARS-CoV-2的抗原性多肽(德尔塔株的刺突蛋白S)。

实施例8：

本实施例提供一种mRNA疫苗，包括实施例1的第一mRNA、实施例2的第二mRNA-8、第二mRNA-9、第二mRNA-10、第二mRNA-11、第二mRNA-12以及鱼精蛋白，形成130纳米鱼精蛋白RNA粒子进行递送。目标蛋白为HPV6的L1蛋白、HPV11的L1蛋白、HPV16的L1蛋白、HPV18的L1蛋白和HPV的E6蛋白。

实施例9：

本实施例提供一种mRNA疫苗，包括实施例1的第一mRNA、实施例2的第二mRNA-13、第二mRNA-14以及鱼精蛋白，形成130纳米鱼精蛋白RNA粒子进行递送。目标蛋白为HSV的包膜糖蛋白E和HSV的包膜糖蛋白D。

实施例10：

本实施例提供一种mRNA疫苗，包括实施例1的第一mRNA、实施例2的第二mRNA-15以及鱼精蛋白，形成130纳米鱼精蛋白RNA粒子进行递送。目标蛋白为流感病毒HA抗原。

实施例11：

本实施例提供一种mRNA疫苗，包括实施例1的第一mRNA、实施例2的第二mRNA-16、第二mRNA-17、第二mRNA-18以及鱼精蛋白，形成130纳米鱼精蛋白RNA粒子进行递送。目标蛋白为HIV的Gag抗原、HIV的EnV抗原和HIV的CD40L。

实施例12：

本实施例提供一种mRNA疫苗，包括实施例1的第一mRNA、实施例2的第二mRNA-19、第二mRNA-20、第二mRNA-21以及鱼精蛋白，形成130纳米鱼精蛋白RNA粒子进行递送。目标蛋白为非洲猪瘟病毒的NL-S蛋白、非洲猪瘟病毒的cd2v ep402r蛋白和非洲猪瘟病毒的TK蛋白。

实施例13：

本实施例提供一种药物组合物，用于治疗结肠癌，包括实施例1的第一mRNA、实施例2的第二mRNA-6、第二mRNA-7以及鱼精蛋白，形成130纳米鱼精蛋白RNA粒子进行递送。目标蛋白为白细胞介素-2和不含氨基的甲胎蛋白。

实施例14：

本实施例提供一种mRNA疫苗，包括实施例1的第一mRNA、实施例2的第二mRNA-27以及鱼精蛋白，形成130纳米鱼精蛋白RNA粒子进行递送。目标蛋白为狂犬病抗原(狂犬病糖蛋白)。

以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 臻赫医药（杭州）有限公司

<120> 一种有限自我复制mRNA分子系统、制备方法及应用

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3071

<212> PRT

<213> Artificially Synthesized

<400> 1

Met Ala Ala Lys Val His Val Asp Ile Glu Ala Asp Ser Pro Phe Ile

1 5 10 15

Lys Ser Leu Gln Lys Ala Phe Pro Ser Phe Glu Val Glu Ser Leu Gln

20 25 30

Val Thr Pro Asn Asp His Ala Asn Ala Arg Ala Phe Ser His Leu Ala

35 40 45

Thr Lys Leu Ile Glu Gln Glu Thr Asp Lys Asp Thr Leu Ile Leu Asp

50 55 60

Ile Gly Ser Ala Pro Ser Arg Arg Met Met Ser Thr His Lys Tyr His

65 70 75 80

Cys Val Cys Pro Met Arg Ser Ala Glu Asp Pro Glu Arg Leu Val Cys

85 90 95

Tyr Ala Lys Lys Leu Ala Ala Ala Ser Gly Lys Val Leu Asp Arg Glu

100 105 110

Ile Ala Gly Lys Ile Thr Asp Leu Gln Thr Val Met Ala Thr Pro Asp

115 120 125

Ala Glu Ser Pro Thr Phe Cys Leu His Thr Asp Val Thr Cys Arg Thr

130 135 140

Ala Ala Glu Val Ala Val Tyr Gln Asp Val Tyr Ala Val His Ala Pro

145 150 155 160

Thr Ser Leu Tyr His Gln Ala Met Lys Gly Val Arg Thr Ala Tyr Trp

165 170 175

Ile Gly Phe Asp Thr Thr Pro Phe Met Phe Asp Ala Leu Ala Gly Ala

180 185 190

Tyr Pro Thr Tyr Ala Thr Asn Trp Ala Asp Glu Gln Val Leu Gln Ala

195 200 205

Arg Asn Ile Gly Leu Cys Ala Ala Ser Leu Thr Glu Gly Arg Leu Gly

210 215 220

Lys Leu Ser Ile Leu Arg Lys Lys Gln Leu Lys Pro Cys Asp Thr Val

225 230 235 240

Met Phe Ser Val Gly Ser Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Arg Lys Leu Leu

245 250 255

Arg Ser Trp His Leu Pro Ser Val Phe His Leu Lys Gly Lys Gln Ser

260 265 270

Phe Thr Cys Arg Cys Asp Thr Ile Val Ser Cys Glu Gly Tyr Val Val

275 280 285

Lys Lys Ile Thr Met Cys Pro Gly Leu Tyr Gly Lys Thr Val Gly Tyr

290 295 300

Ala Val Thr Tyr His Ala Glu Gly Phe Leu Val Cys Lys Thr Thr Asp

305 310 315 320

Thr Val Lys Gly Glu Arg Val Ser Phe Pro Val Cys Thr Tyr Val Pro

325 330 335

Ser Thr Ile Cys Asp Gln Met Thr Gly Ile Leu Ala Thr Asp Val Thr

340 345 350

Pro Glu Asp Ala Gln Lys Leu Leu Val Gly Leu Asn Gln Arg Ile Val

355 360 365

Val Asn Gly Arg Thr Gln Arg Asn Thr Asn Thr Met Lys Asn Tyr Leu

370 375 380

Leu Pro Ile Val Ala Val Ala Phe Ser Lys Trp Ala Arg Glu Tyr Lys

385 390 395 400

Ala Asp Leu Asp Asp Glu Lys Pro Leu Gly Val Arg Glu Arg Ser Leu

405 410 415

Thr Cys Cys Cys Leu Trp Ala Phe Lys Thr Arg Lys Met His Thr Met

420 425 430

Tyr Lys Lys Pro Asp Thr Gln Thr Ile Val Lys Val Pro Ser Glu Phe

435 440 445

Asn Ser Phe Val Ile Pro Ser Leu Trp Ser Thr Gly Leu Ala Ile Pro

450 455 460

Val Arg Ser Arg Ile Lys Met Leu Leu Ala Lys Lys Thr Lys Arg Glu

465 470 475 480

Leu Ile Pro Val Leu Asp Ala Ser Ser Ala Arg Asp Ala Glu Gln Glu

485 490 495

Glu Lys Glu Arg Leu Glu Ala Glu Leu Thr Arg Glu Ala Leu Pro Pro

500 505 510

Leu Val Pro Ile Ala Pro Ala Glu Thr Gly Val Val Asp Val Asp Val

515 520 525

Glu Glu Leu Glu Tyr His Ala Gly Ala Gly Val Val Glu Thr Pro Arg

530 535 540

Ser Ala Leu Lys Val Thr Ala Gln Pro Asn Asp Val Leu Leu Gly Asn

545 550 555 560

Tyr Val Val Leu Ser Pro Gln Thr Val Leu Lys Ser Ser Lys Leu Ala

565 570 575

Pro Val His Pro Leu Ala Glu Gln Val Lys Ile Ile Thr His Asn Gly

580 585 590

Arg Ala Gly Arg Tyr Gln Val Asp Gly Tyr Asp Gly Arg Val Leu Leu

595 600 605

Pro Cys Gly Ser Ala Ile Pro Val Pro Glu Phe Gln Ala Leu Ser Glu

610 615 620

Ser Ala Thr Met Val Tyr Asn Glu Arg Glu Phe Val Asn Arg Lys Leu

625 630 635 640

Tyr His Ile Ala Val His Gly Pro Ser Leu Asn Thr Asp Glu Glu Asn

645 650 655

Tyr Glu Lys Val Arg Ala Glu Arg Thr Asp Ala Glu Tyr Val Phe Asp

660 665 670

Val Asp Lys Lys Cys Cys Val Lys Arg Glu Glu Ala Ser Gly Leu Val

675 680 685

Leu Val Gly Glu Leu Thr Asn Pro Pro Phe His Glu Phe Ala Tyr Glu

690 695 700

Gly Leu Lys Ile Arg Pro Ser Ala Pro Tyr Lys Thr Thr Val Val Gly

705 710 715 720

Val Phe Gly Val Pro Gly Ser Gly Lys Ser Ala Ile Ile Lys Ser Leu

725 730 735

Val Thr Lys His Asp Leu Val Thr Ser Gly Lys Lys Glu Asn Cys Gln

740 745 750

Glu Ile Val Asn Asp Val Lys Lys His Arg Gly Leu Asp Ile Gln Ala

755 760 765

Lys Thr Val Asp Ser Ile Leu Leu Asn Gly Cys Arg Arg Ala Val Asp

770 775 780

Ile Leu Tyr Val Asp Glu Ala Phe Ala Cys His Pro Gly Thr Leu Leu

785 790 795 800

Ala Leu Ile Ala Leu Val Lys Pro Arg Ser Lys Val Val Leu Cys Gly

805 810 815

Asp Pro Lys Gln Cys Gly Phe Phe Asn Met Met Gln Leu Lys Val Asn

820 825 830

Phe Asn His Asn Ile Cys Thr Glu Val Cys His Lys Ser Ile Ser Arg

835 840 845

Arg Cys Thr Arg Pro Val Thr Ala Ile Val Ser Thr Leu His Tyr Gly

850 855 860

Gly Lys Met Arg Thr Thr Asn Pro Cys Asn Lys Pro Ile Ile Ile Asp

865 870 875 880

Thr Thr Gly Gln Thr Lys Pro Lys Pro Gly Asp Ile Val Leu Thr Cys

885 890 895

Phe Arg Gly Trp Val Lys Gln Leu Gln Leu Asp Tyr Arg Gly His Glu

900 905 910

Val Met Thr Ala Ala Ala Ser Gln Gly Leu Thr Arg Lys Gly Val Tyr

915 920 925

Ala Val Arg Gln Lys Val Asn Glu Asn Pro Leu Tyr Ala Pro Ala Ser

930 935 940

Glu His Val Asn Val Leu Leu Thr Arg Thr Glu Asp Arg Leu Val Trp

945 950 955 960

Lys Thr Leu Ala Gly Asp Pro Trp Ile Lys Val Leu Ser Asn Ile Pro

965 970 975

Gln Gly Asn Phe Thr Ala Thr Leu Glu Glu Trp Gln Glu Glu His Asp

980 985 990

Lys Ile Met Lys Val Ile Glu Gly Pro Ala Ala Pro Val Asp Ala Phe

995 1000 1005

Gln Asn Lys Ala Asn Val Cys Trp Ala Lys Ser Leu Val Pro Val Leu

1010 1015 1020

Asp Thr Ala Gly Ile Arg Leu Thr Ala Glu Glu Trp Ser Thr Ile Ile

1025 1030 1035 1040

Thr Ala Phe Lys Glu Asp Arg Ala Tyr Ser Pro Val Val Ala Leu Asn

1045 1050 1055

Glu Ile Cys Thr Lys Tyr Tyr Gly Val Asp Leu Asp Ser Gly Leu Phe

1060 1065 1070

Ser Ala Pro Lys Val Ser Leu Tyr Tyr Glu Asn Asn His Trp Asp Asn

1075 1080 1085

Arg Pro Gly Gly Arg Met Tyr Gly Phe Asn Ala Ala Thr Ala Ala Arg

1090 1095 1100

Leu Glu Ala Arg His Thr Phe Leu Lys Gly Gln Trp His Thr Gly Lys

1105 1110 1115 1120

Gln Ala Val Ile Ala Glu Arg Lys Ile Gln Pro Leu Ser Val Leu Asp

1125 1130 1135

Asn Val Ile Pro Ile Asn Arg Arg Leu Pro His Ala Leu Val Ala Glu

1140 1145 1150

Tyr Lys Thr Val Lys Gly Ser Arg Val Glu Trp Leu Val Asn Lys Val

1155 1160 1165

Arg Gly Tyr His Val Leu Leu Val Ser Glu Tyr Asn Leu Ala Leu Pro

1170 1175 1180

Arg Arg Asp Val Thr Trp Leu Ser Pro Leu Asn Val Thr Gly Ala Asp

1185 1190 1195 1200

Arg Cys Tyr Asp Leu Ser Leu Gly Leu Pro Ala Asp Ala Gly Arg Phe

1205 1210 1215

Asp Leu Val Phe Val Asn Ile His Thr Glu Phe Arg Ile His His Tyr

1220 1225 1230

Gln Gln Cys Val Asp His Ala Met Lys Leu Gln Met Leu Gly Gly Asp

1235 1240 1245

Ala Leu Arg Leu Leu Lys Pro Gly Gly Ser Leu Leu Met Arg Ala Tyr

1250 1255 1260

Gly Tyr Ala Asp Lys Ile Ser Glu Ala Val Val Ser Ser Leu Ser Arg

1265 1270 1275 1280

Lys Phe Ser Ser Ala Arg Val Leu Arg Pro Asp Cys Val Thr Ser Asn

1285 1290 1295

Thr Glu Val Phe Leu Leu Phe Ser Asn Phe Asp Asn Gly Lys Arg Pro

1300 1305 1310

Ser Thr Leu His Gln Met Asn Thr Lys Leu Ser Ala Val Tyr Ala Gly

1315 1320 1325

Glu Ala Met His Thr Ala Gly Cys Ala Pro Ser Tyr Arg Val Lys Arg

1330 1335 1340

Ala Asp Ile Ala Thr Cys Thr Glu Ala Ala Val Val Asn Ala Ala Asn

1345 1350 1355 1360

Ala Arg Gly Thr Val Gly Asp Gly Val Cys Arg Ala Val Ala Lys Lys

1365 1370 1375

Trp Pro Ser Ala Phe Lys Gly Glu Ala Thr Pro Val Gly Thr Ile Lys

1380 1385 1390

Thr Val Met Cys Gly Ser Tyr Pro Val Ile His Ala Val Ala Pro Asn

1395 1400 1405

Phe Ser Ala Thr Thr Glu Ala Glu Gly Asp Arg Glu Leu Ala Ala Val

1410 1415 1420

Tyr Arg Ala Val Ala Ala Glu Val Asn Arg Leu Ser Leu Ser Ser Val

1425 1430 1435 1440

Ala Ile Pro Leu Leu Ser Thr Gly Val Phe Ser Gly Gly Arg Asp Arg

1445 1450 1455

Leu Gln Gln Ser Leu Asn His Leu Phe Thr Ala Met Asp Ala Thr Asp

1460 1465 1470

Ala Asp Val Thr Ile Tyr Cys Arg Asp Lys Ser Trp Glu Lys Lys Ile

1475 1480 1485

Gln Glu Ala Ile Asp Met Arg Thr Ala Val Glu Leu Leu Asn Asp Asp

1490 1495 1500

Val Glu Leu Thr Thr Asp Leu Val Arg Val His Pro Asp Ser Ser Leu

1505 1510 1515 1520

Val Gly Arg Lys Gly Tyr Ser Thr Thr Asp Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr

1525 1530 1535

Phe Glu Gly Thr Lys Phe Asn Gln Ala Ala Ile Asp Met Ala Glu Ile

1540 1545 1550

Leu Thr Leu Trp Pro Arg Leu Gln Glu Ala Asn Glu Gln Ile Cys Leu

1555 1560 1565

Tyr Ala Leu Gly Glu Thr Met Asp Asn Ile Arg Ser Lys Cys Pro Val

1570 1575 1580

Asn Asp Ser Asp Ser Ser Thr Pro Pro Arg Thr Val Pro Cys Leu Cys

1585 1590 1595 1600

Arg Tyr Ala Met Thr Ala Glu Arg Ile Ala Arg Leu Arg Ser His Gln

1605 1610 1615

Val Lys Ser Met Val Val Cys Ser Ser Phe Pro Leu Pro Lys Tyr His

1620 1625 1630

Val Asp Gly Val Gln Lys Val Lys Cys Glu Lys Val Leu Leu Phe Asp

1635 1640 1645

Pro Thr Val Pro Ser Val Val Ser Pro Arg Lys Tyr Ala Ala Ser Thr

1650 1655 1660

Thr Asp His Ser Asp Arg Ser Leu Arg Gly Phe Asp Leu Asp Trp Thr

1665 1670 1675 1680

Thr Asp Ser Ser Ser Thr Ala Ser Asp Thr Met Ser Leu Pro Ser Leu

1685 1690 1695

Gln Ser Cys Asp Ile Asp Ser Ile Tyr Glu Pro Met Ala Pro Ile Val

1700 1705 1710

Val Thr Ala Asp Val His Pro Glu Pro Ala Gly Ile Ala Asp Leu Ala

1715 1720 1725

Ala Asp Val His Pro Glu Pro Ala Asp His Val Asp Leu Glu Asn Pro

1730 1735 1740

Ile Pro Pro Pro Arg Pro Lys Arg Ala Ala Tyr Leu Ala Ser Arg Ala

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Ala Glu Arg Pro Val Pro Ala Pro Arg Lys Pro Thr Pro Ala Pro Arg

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Thr Ala Phe Arg Asn Lys Leu Pro Leu Thr Phe Gly Asp Phe Asp Glu

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His Glu Val Asp Ala Leu Ala Ser Gly Ile Thr Phe Gly Asp Phe Asp

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Asp Val Leu Arg Leu Gly Arg Ala Gly Ala Met Asn Tyr Ile Pro Thr

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Gln Thr Phe Tyr Gly Arg Arg Trp Arg Pro Arg Pro Ala Ala Arg Pro

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Trp Pro Leu Gln Ala Thr Pro Val Ala Pro Val Val Pro Asp Phe Gln

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Ala Gln Gln Met Gln Gln Leu Ile Ser Ala Val Asn Ala Leu Thr Met

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Arg Gln Asn Ala Ile Ala Pro Ala Arg Pro Pro Lys Pro Lys Lys Lys

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Lys Thr Thr Lys Pro Lys Pro Lys Thr Gln Pro Lys Lys Ile Asn Gly

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Lys Thr Gln Gln Gln Lys Lys Lys Asp Lys Gln Ala Asp Lys Lys Lys

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Lys Lys Pro Gly Lys Arg Glu Arg Met Cys Met Lys Ile Glu Asn Asp

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Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Thr Gly Tyr Ala Cys

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Leu Val Gly Asp Lys Val Met Lys Pro Ala His Val Lys Gly Val Ile

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Asp Asn Ala Asp Leu Ala Lys Leu Ala Phe Lys Lys Ser Ser Lys Tyr

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Asp Leu Glu Cys Ala Gln Ile Pro Val His Met Arg Ser Asp Ala Ser

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Lys Ser Asp Asn His Asp Tyr Thr Lys Ile Arg Tyr Ala Asp Gly His

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Gly Asn Val Lys Ile Thr Val Gly Gly Lys Lys Val Lys Tyr Asn Cys

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Asn Thr Cys Leu Ile Glu Gln Cys His Val Ser Val Thr Asp His Lys

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Lys Pro His Gly Trp Pro His Gln Ile Val Gln Tyr Tyr Tyr Gly Leu

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Ala Glu Thr Met Ala Tyr Leu Trp Asp Gln Asn Gln Ala Leu Phe Trp

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Ala Ile Leu Val Leu Val Val Val Thr Cys Ile Gly Leu Arg Arg

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<210> 2

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<212> DNA

<213> Artificially Synthesized

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acctgcgagt acaagaccgt ggtgcccagc ccctacgtga agtgctgcgg cgccagcgag 8100

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atgtggggcg gcgcctactg cttctgcgac agcgagaaca cccagctgag cgaggcctac 8220

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gtgaacggcg accacgccgt gaccatcggc ggcacccagt tcatcttcgg ccccctgagc 8400

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gacttccccc cctacggcag cggccagccc ggccggttcg gcgacatcca gagccggacc 8520

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acccggatcg tggaggcccc caccatcatc gacctgacct gcaccgtggc cacctgcacc 8820

cacagcagcg acttcggcgg cgtgctgacc ctgacctaca agaccgacaa gaacggcgac 8880

tgcagcgtgc acagccacag caacgtggcc accctgcagg aggccaccgc caaggtgaag 8940

accgccggca aggtgaccct gcacttcagc accgccagcg ccagccccag cttcgtggtg 9000

agcctgtgca gcgcccgggc cacctgcagc gccagctgcg agccccccaa ggaccacatc 9060

gtgccctacg ccgccagcca cagcaacgtg gtgttccccg acatgagcgg caccgccctg 9120

agctgggtgc agaagatcag cggcggcctg ggcgccttcg ccatcggcgc catcctggtg 9180

ctggtggtgg tgacctgcat cggcctgcgg cggtga 9216

<210> 3

<211> 1611

<212> DNA

<213> Artificially Synthesized

<400> 3