一种鉴定欧洲水果型黄瓜的方法及其专用SNP引物组和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定欧洲水果型黄瓜的方法及其专用SNP引物组和应用。

背景技术

黄瓜是我国重要的蔬菜作物，年播种面积和产量位居世界第一。黄瓜属一年生葫芦科蔓生植物，我国栽培的黄瓜可以分为四种类型，即华北型、华南型、欧洲水果型和西双版纳型。欧洲水果型黄瓜由于外形小巧玲珑，也称为迷你黄瓜，最早是从荷兰、德国等国家引进的温室栽培型品种。水果型黄瓜长度14-18厘米，直径约3厘米，果实表面光滑无刺，口感脆嫩，瓜味浓郁，营养成分含量明显高于普通黄瓜，既可作为蔬菜食用，也可作为水果食用，深受中高档餐饮行业的青睐。近年来，欧洲水果型黄瓜的栽培面积逐步扩大，具有较大的市场发展潜力。

欧洲水果型黄瓜与其它类型黄瓜的栽培环境和商业用途有很大的区别，农业生产和品种选育过程中要明确区分。然而，随着黄瓜杂交育种和不同种间的基因交流，已不能简单通过种子和子叶来鉴定欧洲水果型黄瓜。据统计，我国申请登记的黄瓜品种已超过1600份，传统的田间表型鉴定费时费力，不能满足当前黄瓜品种数量激增的鉴定需求。因此，建立一种简单快速鉴定欧洲水果型黄瓜品种的方法尤为重要，为黄瓜品种选育和种群鉴定提供技术支撑。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于鉴定欧洲水果型黄瓜的SNP位点；本发明的目的之二在于提供一种用于鉴定欧洲水果型黄瓜的SNP引物组；本申请的目的之三在于提供一种包括上述引物组的试剂盒；本申请的目的之四在于提供所述SNP位点、或者所述SNP引物组、或者所述试剂盒的应用；本申请的目的之五在于提供一种鉴定欧洲水果型黄瓜的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种用于鉴定欧洲水果型黄瓜的SNP位点，所述SNP位点为如下第二SNP位点和/或第三SNP位点：第二SNP位点SNP02，所述第二SNP位点位于2号染色体的3924266处，该位点的核苷酸碱基为T或C；第三SNP位点SNP03，所述第三SNP位点位于3号染色体的1870398处，该位点的核苷酸碱基为C或A。第二SNP位点对应的基因型：T:T纯合型为非欧洲水果型黄瓜的基因型，C:C纯合型为欧洲水果型黄瓜的基因型；第三SNP位点对应的基因型：C:C纯合型为非欧洲水果型黄瓜的基因型，A:A纯合型为欧洲水果型黄瓜的基因型。

第二方面，本发明提供一种用于鉴定欧洲水果型黄瓜的SNP引物组，所述引物组选自第二KASP引物对和/或第三KASP引物对，所述第二KASP引物对用于扩增用于鉴定欧洲水果型黄瓜的第二SNP位点，或确定第二SNP位点对应的基因型；所述第三KASP引物对用于扩增用于鉴定欧洲水果型黄瓜的第三SNP位点，或确定第三SNP位点对应的基因型；每个KASP引物对均包括：第一正向引物、第二正向引物和通用反向引物。

在上述用于鉴定欧洲水果型黄瓜的SNP引物组中，作为一种优选实施方式，所述第二KASP引物对中：第一正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-GTATGGATATGTGAAGGATATGGTGT-3’；第二正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-TATGGATATGTGAAGGATATGGTGC-3’；通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ IDNO.3所示，具体为：5’-GAATAATTATATCACGGTGAATGTAGAAGTTTG-3’；所述第三KASP引物对中：第一正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示，具体为：5’-TCTTTCAATCAAATCCATTTCCTATGATC-3’；第二正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示，具体为：5’-CTCTTTCAATCAAATCCATTTCCTATGATA-3’；通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.6所示，具体为：5’-GCAACGGTTTAGGTCAAGAAGATCAAG-3’。

在上述用于鉴定欧洲水果型黄瓜的SNP引物组中，作为一种优选实施方式，每个KASP引物对中的所述第一正向引物和第二正向引物的5’端分别连有不同的荧光接头序列。

在上述用于鉴定欧洲水果型黄瓜的SNP引物组中，作为一种优选实施方式，所述荧光接头序列选择FAM、HEX、FITC、RED、TET、JOE、R110中的一种。

第三方面，本发明提供一种试剂盒，包括上述引物组和PCR反应试剂。

在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述PCR反应试剂为具有竞争性等位基因特异性PCR检测能力的试剂；优选地，所述PCR反应试剂为Master mix。

第四方面，本发明提供上述SNP位点、或者上述SNP引物组、或者上述试剂盒在以下任一方面的应用：(a)辅助选育欧洲水果型黄瓜的品种；(b)鉴定黄瓜品种是否为欧洲水果型黄瓜。

第五方面，本发明提供一种鉴定欧洲水果型黄瓜的方法，包括如下步骤：

(1)待测黄瓜样品基因组DNA的提取；(2)以待测黄瓜样品基因组DNA为模板，分别利用上述引物组中的各引物对进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行荧光检测和分析，获得待测黄瓜样品对应SNP位点的基因型，由此确定待测黄瓜品种是否为欧洲水果型黄瓜；其中确定待测黄瓜样品是否为欧洲水果型黄瓜的条件选自如下中的一种或多种：当基于第二SNP位点SNP02的基因型为T:T纯合型时，待测黄瓜样品为非欧洲水果型黄瓜；基于第二SNP位点SNP02的基因型为C:C纯合型时，待测黄瓜样品为欧洲水果型黄瓜；或者/和，当基于第三SNP位点SNP03的基因型为C:C纯合时，待测黄瓜样品为非欧洲水果型黄瓜；基于第三SNP位点SNP03的基因型为A:A纯合型时，待测黄瓜样品为欧洲水果型黄瓜。

在上述鉴定欧洲水果型黄瓜的方法中，作为一种优选实施方式，所述PCR扩增的条件依次为：94℃预变性15分钟，在94℃下变性20s；61℃-55℃下退火1min，共10个循环，61℃为第一个循环的退火温度，之后每个循环退火温度降低0.6℃；94℃变性20s，55℃复性/延伸1min，共26个循环。

在上述鉴定欧洲水果型黄瓜的方法中，作为一种优选实施方式，所述引物组中，各引物对的第一正向引物、第二正向引物和通用反向引物在PCR体系中的浓度比为2:2:5。

在上述鉴定欧洲水果型黄瓜的方法中，作为一种优选实施方式，所述待测黄瓜样品基因组DNA的浓度为10-30ng/μL。

本发明的PCR的模板：待测样品基因组DNA，其琼脂糖电泳条带应单一无明显弥散，其浓度满足10-30ng/μL，并且紫外分光光度法检测中A260/A280的比值大于1.8。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明基于代表了广泛的黄瓜遗传多样性的68份黄瓜代表资源的重测序数据，筛选得到110492个黄瓜perfect SNP，从中进一步筛选8个SNP位点，其中SNP分型结果显示纯合基因型比例较高且与欧洲水果型黄瓜紧密连锁的是SNP02和SNP03，使用用于第二SNP位点基因分型的第二KASP引物对或用于第三SNP位点基因分型的第三KASP引物对，对12种待测黄瓜鉴定是否为欧洲水果型黄瓜，所检测到的纯合基因型与表型完全一致，为鉴定黄瓜是否为欧洲水果型黄瓜提供了有力的技术支持。利用本发明的SNP位点开发的特异性扩增引物，可以高效、准确地鉴定出欧洲水果型黄瓜，可显著提高品种黄瓜品种选育和种群鉴定效率。

附图说明

图1为68份黄瓜代表资源重测序数据的PCA聚类结果。

图2为利用本发明第二KASP引物对，对实施例2中144个供试黄瓜品种进行基因分型的结果或进行KASP扩增的结果图，其中，A处是基因型为欧洲水果黄瓜(C:C基因型，红色)；B处是基因型为非欧洲水果黄瓜(T:T基因型，蓝色)；C处是未检出基因型的样本(？，粉色)。

图3为利用本发明第三KASP引物对，对实施例2中144个供试黄瓜品种进行基因分型的结果或进行KASP扩增的结果图，其中，A处是基因型为欧洲水果黄瓜(A:A基因型，红色)；B处是基因型为非欧洲水果黄瓜(C:C基因型，蓝色)；C处是未检出基因型的样本(？，粉色)；D处是基因型为杂合的样本(A:C基因型，绿色)。

图4为利用本发明第二KASP引物对，对实施例3中12个待测黄瓜品种进行基因分型的结果或进行KASP扩增的结果图，其中，A处是基因型为欧洲水果黄瓜(C:C基因型，红色)；B处是基因型为非欧洲水果黄瓜(T:T基因型，蓝色)；C处是基因型为杂合的样本(C:T基因型，绿色)。

图5为利用本发明第三KASP引物对，对实施例3中12个待测黄瓜品种进行基因分型的结果或进行KASP扩增的结果图，其中，A处是基因型为欧洲水果黄瓜(A:A基因型，红色)；B处是基因型为非欧洲水果黄瓜(C:C基因型，蓝色)；C处是基因型为杂合的样本(A:C基因型，绿色)。

具体实施方式

本发明利用黄瓜种质资源的重测序数据，从全基因组筛选欧洲水果型种群特异的遗传位点，进而开发用于鉴定欧洲水果型黄瓜品种的特异分子标记。SNP作为第三代分子标记，其在基因组中分布广泛，平均每1000bp就会存在一个SNP变异，遗传稳定且易于自动化检测。KASP(KompetitiveAllele Specific PCR)，即竞争性等位基因特异性PCR技术是用于SNP分型的常用方法，具有高稳定性、准确性和低成本的特点。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明鉴定欧洲水果型黄瓜的方法及其专用SNP引物组和应用进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1、用于鉴定黄瓜品种属于欧洲水果型黄瓜的SNP引物组合的获得

一、8个SNP位点的发现

本发明基于68份黄瓜代表资源的重测序数据，这些黄瓜种质代表了广泛的黄瓜遗传多样性，包括21份东亚类型(华北型和华南型)黄瓜，28份欧洲型黄瓜和19份西双版纳型黄瓜(图1)，筛选SNP两翼50bp无其它变异且基因组特异的perfect SNP位点，具体的，SNP位点的筛选标准如下：在全基因组内选择MAF>0.3、杂合度小于0.1、缺失率小于0.1且两翼50bp序列保守(无InDel，无SSR，无其它SNP)的SNP位点。共获得110492个黄瓜perfect SNP，进一步筛选非同义SNP用于计算欧洲水果型黄瓜与其它类型黄瓜之间的SNP变异频率，最终获得8个SNP位点在欧洲型黄瓜与其它类型黄瓜种群之间的SNP频率差值为1。

8个SNP位点的基本信息详见表1。其中SNP位点在染色体上的位置是基于黄瓜Chinese Long 9930参考基因组序列比对确定的，所述黄瓜Chinese Long 9930参考基因组序列的版本号为V2(下载地址为：http://cucurbitgenomics.org/org anism/2)。

表1. 8个欧洲水果型黄瓜特异非同义SNP位点的基本信息

二、用于鉴定欧洲水果型黄瓜的特异SNP引物的获得

基于步骤一发现的8个SNP位点，本发明的发明人设计8对KASP引物并对已知种群属性的24个黄瓜品种进行SNP分型。根据SNP基因型结果，获得2个纯合基因型比例较高且与欧洲水果型黄瓜紧密连锁的SNP位点组合，即SNP02和SNP03。因此，本发明优选了基于第二SNP位点SNP02的第二KASP引物对和/或基于第三SNP位点SNP03的第三KASP引物对作为用于鉴定欧洲水果黄瓜的特异SNP引物组合，其中，每个引物对均包括第一正向引物、第二正向引物和通用反向引物，其序列如下表2所示。

表2.用于鉴定欧洲水果型黄瓜的特异SNP引物组合

注：单下划线为FAM荧光标签序列，双下划线为HEX荧光标签序列。

基于本发明中其他六个SNP位点所设计的KASP引物对如下所示，

第一正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.11所示，具体为：5’-CATCTTCCATTTCCAACAACTCCG-3’；第二正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.12所示，具体为：5’-TTCATCTTCCATTTCCAACAACTCCA-3’；通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ IDNO.13所示，具体为：5’-GAGATGGTTGTCGTTTTGAAAGGTGG-3’。

第四KASP引物对中：

第一正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.14所示，具体为：5’-CCTTCTCTCAGTCTCTAACTGGTT-3’；第二正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.15所示，具体为：5’-CTTCTCTCAGTCTCTAACTGGTG-3’；通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.16所示，具体为：5’-ATCCGATTGGGAAGGTATGAGAGGT-3’。

第五KASP引物对中：

第一正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.17所示，具体为：5’-TCGCCATTACTGCTGACTTGGAA-3’；第二正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.18所示，具体为：5’-TCGCCATTACTGCTGACTTGGAT-3’；通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.19所示，具体为：5’-GAGTCAGAGATGAATGGAGGTAGAAAC-3’。

第六KASP引物对中：

第一正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.20所示，具体为：5’-CCTTCCTTGACATCTCTTTAAGGAAA-3’；第二正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.21所示，具体为：5’-CTTCCTTGACATCTCTTTAAGGAAG-3’；通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ IDNO.22所示，具体为：5’-GCTTGACGTTAGAAAATAGAAATAGCAGTG-3’。

第七KASP引物对中：

第一正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.23所示，具体为：5’-CCGAACTCTTTGTTTCGGTTCATG-3’；第二正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.24所示，具体为：5’-AACCGAACTCTTTGTTTCGGTTCATT-3’；通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ IDNO.25所示，具体为：5’-CAATCAAAAGTATTACAGAAAGACCGACTG-3’。

第八KASP引物对中：

第一正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.26所示，具体为：5’-GTGGGAAATCCTTGGAGTTTAGAAG-3’；第二正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.27所示，具体为：5’-GTGGGAAATCCTTGGAGTTTAGAAA-3’；通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ IDNO.28所示，具体为：5’-AGCAAGTACTGAAGATGAGATCTCAAAG-3’。

上述每个KASP引物对中的所述第一正向引物和第二正向引物的5’端分别连有不同的荧光接头序列。所述荧光接头序列选择FAM、HEX、FITC、RED、TET、JOE、R110中的一种。

本发明中，第一KASP引物对是用于扩增第一SNP位点SNP01或用于确定第一SNP位点基因型；第二KASP引物对是用于扩增第二SNP位点SNP02或用于确定第二SNP位点基因型；第三KASP引物对是用于扩增第三SNP位点SNP03或用于确定第三SNP位点基因型；第四KASP引物对是用于扩增第四SNP位点SNP04或用于确定第四SNP位点基因型；第五KASP引物对是用于扩增第五SNP位点SNP05或用于确定第五SNP位点基因型；第六KASP引物对是用于扩增第六SNP位点SNP06或用于确定第六SNP位点基因型；第七KASP引物对是用于扩增第七SNP位点SNP07或用于确定第七SNP位点基因型；第八KASP引物对是用于扩增第八SNP位点SNP08或用于确定第八SNP位点基因型。

实施例2、实施例1开发的SNP引物组合的有效性检验

本实施例中的144个供试黄瓜品种的基本信息见下表3中第1至3列。144个供试黄瓜品种均为常见的市场品种。根据表型，36个供试黄瓜品种为欧洲水果型黄瓜，108个供试黄瓜品种为非欧洲水果型黄瓜。

1、供试黄瓜品种的基因组DNA的获得

采用CTAB法分别提取144个供试黄瓜品种的幼根(混取10粒种子的幼根)的基因组DNA，得到供试黄瓜品种的基因组DNA。

供试黄瓜品种的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/A280比值在1.8左右，A260/A230比值大于1.8；供试黄瓜品种的基因组DNA的浓度在10-30ng/μL。

2、分别以144个供试黄瓜品种的基因组DNA为模板，分别采用第二KASP引物对和第三KASP引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，第一正向引物、第二正向引物和反向通用引物的浓度比为2:2:5。

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。

PCR试剂为：具有竞争性等位基因特异性PCR检测能力的试剂盒。本实施例中使用LGC公司的Mastermix(96或384孔板货号PartNo.KBS-1016-002或1536微孔板货号PartNo.KBS-1016-011)

表4 384孔板或96孔板的PCR反应体系

3、完成步骤2后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断144个供试黄瓜品种基于每个SNP位点的基因型。具体的判断原则如下：

待测样品基于第二SNP位点SNP02的PCR结果：显示蓝色荧光信号则该位点基因型为T:T(与第二KASP引物对的第一正向引物3’端最后一个碱基相同)，并由此判断待测黄瓜样品为非欧洲水果型黄瓜；显示红色荧光信号则该位点基因型为C:C(与第二KASP引物对的第二正向引物3’端最后一个碱基相同)，并由此判断待测黄瓜样品为欧洲水果型黄瓜；显示绿色荧光信号则该位点基因型为杂合型，一个碱基为T(与第二KASP引物对的第一正向引物3’端最后一个碱基相同)，另一个碱基为C(与第二KASP引物对的第二正向引物3’端最后一个碱基相同)，并由此判定T:C。本实施例中144个供试样品基于SNP02的基因型统计结果见下表3中第4列(部分结果见图2)。

当待测样品基于第三SNP位点SNP03的PCR结果：显示蓝色荧光信号，则该位点基因型为C:C(与第三KASP引物对的第一正向引物3’端最后一个碱基相同)，并由此判断待测黄瓜样品为非欧洲水果型黄瓜；显示红色荧光信号则该位点基因型为A:A(与第三KASP引物对的第二正向引物3’端最后一个碱基相同)，并由此判断待测黄瓜样品为欧洲水果型黄瓜；显示绿色荧光信号则该位点基因型为杂合型，一个碱基为C(与第三KASP引物对的第一正向引物3’端最后一个碱基相同)，另一个碱基为A(与第三KASP引物对的第二正向引物3’端最后一个碱基相同)，并由此判定A:C。本实施例中144个供试样品基于SNP03的基因型统计结果见下表3中第5列(部分结果见图3)。

需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至荧光信号聚类紧凑，FAM和HEX的相对荧光值介于1和2之间。

表3. 144个供试黄瓜品种的基本信息

注：NA为基因型数据缺失。

结果表明，2个引物组在144个供试黄瓜品种中均可以得到很好的分型效果，且分型结果高度一致，具体一致性数据见本实施例第4部分。

4、两个引物对鉴定144个供试黄瓜品种是欧洲水果型黄瓜的效率评价

(1)统计144个供试黄瓜品种基于SNP02的基因型。

结果表明，上表3中基于SNP02基因型为C:C纯合型的供试黄瓜品种为39个，判定为欧洲水果型黄瓜，根据上表3中第3列供试黄瓜的表型统计结果可知，其中35个为欧洲水果型黄瓜，一致性为89.7％。上表3中基于SNP02基因型为T:T纯合型的供试黄瓜品种为104个，判定为非欧洲水果型黄瓜；根据上表3中第3列供试黄瓜的表型统计结果可知，这104个黄瓜全部为非欧洲水果型黄瓜，一致性为100％。

根据上表3可知，本实施例通过使用第二引物对、基于第二SNP位点基因型，对144个供试黄瓜品种的鉴定结果中，基因型与表型不吻合的共5个(其中HH45的基因型检测结果为杂合)，因此，第二KASP引物对鉴定144个供试样品中欧洲水果型黄瓜的结果与表型的一致性为96.53％。

(2)统计144个供试黄瓜品种基于SNP03的基因型。

结果表明，上表3中基于SNP03基因型为A:A纯合型的供试黄瓜品种为32个，判定为欧洲水果型黄瓜，根据上表3中第3列供试黄瓜的表型统计结果可知，其中32个全部为欧洲水果型黄瓜，一致性为100％。上表3中基于SNP03基因型为C:C纯合型的供试黄瓜品种为108个，判定为非欧洲水果型黄瓜，根据上表3中第3列供试黄瓜的表型统计结果可知，其中105个为非欧洲水果型黄瓜，一致性为97.2％。

根据上表3可知，本实施例通过使用第三引物对、基于第三SNP位点基因型，对144个供试黄瓜品种的鉴定结果中，基因型与表型不吻合的共6个(其中HH16、HH29和HH45的基因型检测结果为杂合)，数据丢失(NA)的共1个，因此，第三KASP引物对鉴定144个供试样品中欧洲水果型黄瓜的结果与表型的一致性为95.14％。

(3)统计144个供试黄瓜品种基于SNP02和SNP03的基因型

结果表明，上表3中基于SNP02和SNP03基因型分别为C:C、A:A纯合型的供试黄瓜品种为32个，判定为欧洲水果型黄瓜，根据上表3中第3列供试黄瓜的表型统计结果可知，其中32个全部为欧洲水果型黄瓜，一致性为100％。上表3中基于SNP02和SNP03基因型分别为T:T、C:C纯合型的供试黄瓜品种为101个，判定为非欧洲水果型黄瓜，根据上表3中第3列供试黄瓜的表型统计结果可知，其中101个全部为非欧洲水果型黄瓜，一致性为100％。

由此可见，实施例1开发的SNP位点及其专用引物对可以高效、准确鉴定待测黄瓜是否为欧洲水果型黄瓜，并且第二和第三SNP位点基因型连锁度很高(除去HH45两个SNP位点基因型皆为杂合之外，基于这两个SNP位点基因型鉴定待测黄瓜是否为欧洲水果型黄瓜的结果与表型完全一致)，在对黄瓜是否为欧洲水果型黄瓜的鉴定中，第二KASP引物对和第三KASP引物对可以作为一个引物组共同用于鉴定欧洲水果型黄瓜，互为补充，进一步提高鉴定欧洲水果型黄瓜的准确性。

实施例3、采用实施例1开发的SNP引物组合检测待测黄瓜是否为欧洲水果型黄瓜

待测黄瓜品种为待测黄瓜品种1至待测黄瓜品种12。

1、采用实施例1开发的SNP引物组合检测待测黄瓜品种是否属于欧洲水果型黄瓜

(1)待测黄瓜品种的基因组DNA的获得

种植待测黄瓜品种的种子，得到幼苗；取待测黄瓜品种的叶片或根，采用CTAB法分别提取基因组DNA，获得待测黄瓜品种的基因组DNA。

(2)以待测黄瓜品种的基因组DNA为模板，分别采用第二KASP引物对和第三KASP引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，第一正向引物、第二正向引物和通用反向引物的浓度比为2:2:5。

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。PCR试剂为：LGC公司的Mastermix。

(3)完成步骤(2)后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，得到荧光信号颜色，根据实施例2中的方法，判定相应SNP位点的基因型，由此判断待测品种是否为欧洲水果型黄瓜。

12个待测黄瓜品种采用第二KASP引物对的SNP分型结果见图4；

12个待测黄瓜品种采用第三KASP引物对的SNP分型结果见图5。

统计结果见表5中第2-4列。基于SNP02基因型为C:C纯合型、基于SNP03基因型为A:A纯合型的供试黄瓜品种判定为欧洲水果型黄瓜。基于SNP02基因型为T:T纯合型、基于SNP03基因型为C:C纯合型的供试黄瓜品种判定为非欧洲水果型黄瓜。

表5 12个待测黄瓜品种属于欧洲水果黄瓜类型

2、根据表型，判断待测黄瓜品种是欧洲水果型黄瓜类型。

统计结果见表3中第4列。

结果表明，实施例1开发的SNP引物组合可以鉴定欧洲水果型黄瓜和表型鉴定结果完全一致。由此可见，基于实施例1开发的SNP引物组合可以检测待测黄瓜品种是否属于欧洲水果型黄瓜。

上述实施例仅是为了清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或者变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种鉴定欧洲水果型黄瓜的方法及其专用SNP引物组和应用

<130> C1CNCN220458

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtatggatat gtgaaggata tggtgt 26

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatggatatg tgaaggatat ggtgc 25

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaataattat atcacggtga atgtagaagt ttg 33

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctttcaatc aaatccattt cctatgatc 29

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctctttcaat caaatccatt tcctatgata 30

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaacggttt aggtcaagaa gatcaag 27

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaggtgacc aagttcatgc tgtatggata tgtgaaggat atggtgt 47

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaggtcgga gtcaacggat ttatggatat gtgaaggata tggtgc 46

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaggtgacc aagttcatgc ttctttcaat caaatccatt tcctatgatc 50

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggtcgga gtcaacggat tctctttcaa tcaaatccat ttcctatgat a 51

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catcttccat ttccaacaac tccg 24

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttcatcttcc atttccaaca actcca 26

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagatggttg tcgttttgaa aggtgg 26

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccttctctca gtctctaact ggtt 24

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttctctcag tctctaactg gtg 23

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atccgattgg gaaggtatga gaggt 25

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcgccattac tgctgacttg gaa 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcgccattac tgctgacttg gat 23

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gagtcagaga tgaatggagg tagaaac 27

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccttccttga catctcttta aggaaa 26

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cttccttgac atctctttaa ggaag 25

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcttgacgtt agaaaataga aatagcagtg 30

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccgaactctt tgtttcggtt catg 24

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aaccgaactc tttgtttcgg ttcatt 26

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caatcaaaag tattacagaa agaccgactg 30

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtgggaaatc cttggagttt agaag 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gtgggaaatc cttggagttt agaaa 25

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agcaagtact gaagatgaga tctcaaag 28