用于鉴别梅花鹿台湾亚种的分子标记、鉴别方法及应用

技术领域

本发明涉及用于鉴别梅花鹿台湾亚种的分子标记、鉴别方法及应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

梅花鹿(Cervus nippon)属于哺乳纲(Mammalia)、偶蹄目(Artiodactyla)、鹿科(Cervidae)、鹿属(Cervus)，是东亚季风区标志性动物，从乌苏里江到越南均有分布。目前比较公认的说法是将梅花鹿分为13个亚种，日本现存6个亚种分别是北海道亚种(Cervusnipponyesoensis)、本州亚种(Cervus nippon centralis)、指名亚种(Cervusnipponnippon)、屋久岛亚种(Cervus nippon yakushimae)、马毛岛亚种 (Cervusnipponmageshimae)和琉球亚种(Cervus nipponkeramae)。越南有1个亚种：越南亚种(Cervus nippon pseudaxis)。中国梅花鹿有6个亚种，其中华北亚种 (Cervusnipponmandarinns)和山西亚种(Cervus nippon grassianus)均已灭绝。东北亚种(Cervusnippon hortulorum)分布于辽宁、吉林、黑龙江、西伯利亚东南部、乌苏里江流域和朝鲜，体型较大，腹部青灰色，夏毛红棕色，白斑大但稀少，冬毛白斑不明显，甚至无白斑。华南亚种(Cervus nipponkopschi)在安徽南部、浙江西北部和江西东北部等都有分布，体型小，夏毛红棕色，白斑较大，体侧白斑较稀疏，腹部灰棕色，冬毛深棕色，白斑不明显。四川亚种(Cervus nippon sichuanicus) 在1964年才被发现并经鉴定成为一个新的梅花鹿亚种，其栖息地主要位于若尔盖铁布、包座自然保护区，体型大，腹部白色，夏毛深红棕色，白斑小而密，冬毛白斑不明显。台湾亚种(Cervus nippontaiouanus)主要分布在中国台湾地区，体型小，夏毛黄棕色，颈后颜色较深，夏毛与冬毛均有明显较大白斑。

目前梅花鹿的亚种划分主要依据形态学差异和地理分布，存在着遗传资源分类混乱的难题。基于线粒体全基因组的梅花鹿起源进化研究结果表明，东北亚种内部存在极大的遗传分化，家养梅花鹿与其他梅花鹿亚种存在基因交流，这或是自然因素或是人为因素，野生梅花鹿中的台湾亚种、四川亚种和华南亚种在系统进化分析中均聚为单独的分支，这表明线粒体基因组蛋白质编码基因不同亚种特异SNP可作为鉴别台湾亚种、四川亚种和华南亚种的候选分子标记。

分子SNP标记具有准确性高、变异丰富、操作简单等优点，且分子标记不受环境因素影响，能直接反应动物基因水平的差异，因而被广泛应用于动物个体鉴别和种源鉴定。

目前本领域内尚未有用分子标记鉴定梅花鹿台湾亚种的相关报道。

发明内容

本发明的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种用于鉴别梅花鹿台湾亚种的分子标记及其引物和应用，有助于解决当前精准鉴别梅花鹿亚种面临的问题。

本发明人对梅花鹿不同亚种样品的mtDNA序列进行了深入研究，获得了可以用于精准鉴别梅花鹿台湾亚种的SNP标记和鉴定方法，实现了梅花鹿不同亚种的精准鉴别工作，对梅花鹿资源的保护和管理方面具有重要理论和应用价值。

本发明一方面，提供一种用于鉴别梅花鹿台湾亚种的分子标记，所述分子标记包括2个SNP标记位点：S-1～S-2，位点信息如表1所示：

表1本发明用于鉴别梅花鹿台湾亚种的SNP标记位点

本发明提供的2个SNP位点S-1～S-2在梅花鹿台湾亚种中为A、C；在非梅花鹿台湾亚种中分别为G、T。所述非梅花鹿台湾亚种包括梅花鹿东北亚种、梅花鹿华南亚种、梅花鹿四川亚种、梅花鹿北海道亚种、梅花鹿本州亚种、梅花鹿指名亚种、梅花鹿屋久岛亚种。

本发明还提供用于鉴别梅花鹿台湾亚种的分子标记引物，所述引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示。用所述引物对扩增待测样品，可扩增得到 COX2基因572bp片段。

本发明还提供上述用于鉴别梅花鹿台湾亚种的分子标记或用于鉴别梅花鹿台湾亚种的引物在鉴别梅花鹿台湾亚种中的应用；及在制备试剂盒或在检测方法中的应用，所述试剂盒或检测方法的用途为鉴别梅花鹿台湾亚种。

本发明进一步提供一种鉴别梅花鹿台湾亚种的方法，所述方法是：提取待测样本DNA，用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示引物对进行PCR扩增；对PCR 产物进行测序，根据SNP标记位点碱基即可鉴别待测样品是否为梅花鹿台湾亚种。若扩增得到的片段序列的2个SNP位点分别为A、C，则待测样品为梅花鹿台湾亚种；若2个SNP位点分别为G、T，则待测样品是非梅花鹿台湾亚种。

本发明有益效果：

(1)本发明确定2个用于鉴别梅花鹿台湾亚种特异性的SNP位点，得到了 1对鉴别引物，建立了鉴别梅花鹿台湾亚种特异SNP的方法。本发明弥补了本领域目前尚无鉴别梅花鹿台湾亚种的分子检测技术的不足，实现对梅花鹿种质资源的精准鉴别。

(2)本发明方法以梅花鹿亚种差异性SNP为判定依据，为梅花鹿资源的亚种水平鉴别提供了稳定、可靠的分子检测方法，从基因水平上拓展了梅花鹿可用标记位点范围，为梅花鹿种质资源鉴定提供了新思路和方法，对梅花鹿的DNA 指纹图谱绘制和野生亚种保护管理等方面具有重要理论与应用价值。

(3)本发明所选位点稳定性好，鉴定方法准确率极高。用本发明方法检测了来自中国和日本的105个梅花鹿样品。结果表明：105个样品中15个样品为台湾亚种，其余样品非台湾亚种。检测准确率100％。

附图说明

图1为本发明的梅花鹿台湾亚种与其他亚种mtDNA序列差异性SNP位点。图中：Cervus nippon hortulorum:东北亚种；Cervus nippon sichuanicus:四川亚种； Cervusnippon kopschi:华南亚种；Cervus nippon taiouanus:台湾亚种；Cervus nipponyesoensis:北海道亚种；Cervus nippon centralis:本州亚种；Cervus nippon nippon:指名亚种；Cervus nippon yakushimae:屋久岛亚种

图2为实施例2的PCR结果图。图中，M：DNAMaker1000；1泳道是引物对扩增得到的条带。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明不限于此。本发明中所涉及的方法，如无特殊说明均为本领域常用方法，所涉及的试剂，如无特殊说明均可以从商业途径获得。

实施例1、用于鉴别梅花鹿台湾亚种的特异SNP标记的获得

1、梅花鹿台湾亚种特异SNP位点筛选

结合测得梅花鹿东北亚种、四川亚种、华南亚种、台湾亚种、北海道亚种、本州亚种、指名亚种和屋久岛亚种等不同亚种样品的mtDNA序列，利用Mega6.0 比对分析，主要针对同一亚种共有且特异于其他亚种的位点进行筛选，筛选差异 SNP位点2个，如图1所示。2个标记位点均位于梅花鹿mtDNA基因组COX2 基因572bp片段上；标记S-1在第101bp，台湾亚种中为碱基A，非台湾亚种为碱基G；标记S-2位于第500bp，台湾亚种中为碱基C，非台湾亚种为碱基T。所述非台湾亚种包括梅花鹿东北亚种、梅花鹿华南亚种、梅花鹿四川亚种、梅花鹿北海道亚种、梅花鹿本州亚种、梅花鹿指名亚种、梅花鹿屋久岛亚种。

2、引物设计

用Mega6.0截取COX2基因片段，根据前后序列共750bp左右，用于设计鉴别引物。

根据截取的目的基因片段，结合Primer5.0与Oligo7.0设计鉴别引物。得到用于扩增COX2基因片段的引物对：

F：5'TGCTACATTTTCATGATCATACATTAATAATTGT3'(SEQ ID NO.1)；

R：5'AATATTGATATAATTATTATAAGTCATGTGGACGTG3'(SEQ ID NO.2)。

引物设计好后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2、鉴别梅花鹿台湾亚种的方法的建立

采用上述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示引物对，进行PCR实验，以建立鉴别梅花鹿台湾亚种的方法，PCR扩增条件如表2。

表2 PCR扩增条件

PCR反应体系如表3。

表3 PCR体系

所述PCR扩增的过程为：94℃预变性5min；94℃变性30sec、58℃退火 30sec、72℃延伸30sec，共进行30个循环；72℃再延伸5min，4℃保存。

PCR产物取3.5μL于1％琼脂糖凝胶电泳中检测，电泳结果(图2)与目的片段一致，条带单一致密，可用于后续测序。条带单一明亮，大小符合目的片段大小，可用于测序。

对PCR产物进行测序，根据SNP标记位点碱基即可鉴别待测样品是否为梅花鹿台湾亚种。梅花鹿台湾亚种序列如SEQ ID NO.3所示；梅花鹿非台湾亚种序列如SEQ ID NO.4所示。

实验结果表明本发明成功建立了有效鉴别梅花鹿台湾亚种和其他亚种的方法。

实施例3.本发明鉴别梅花鹿台湾亚种的方法的具体应用

选取采自中国和日本的样品共105个，分别提取基因组DNA，由实验者A 将这些样品随机混合，重新编号，实验者B采用本发明设计的引物对这些样品进行PCR扩增，扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。通过Bioedit 7.0查看测序峰图，测序结果图谱波峰波谷分离、无重叠、无误读，表明测序结果可信。用Mega6.0比对序列，以梅花鹿台湾亚种特异SNP位点的碱基作为判定依据。

根据本发明确定的mtDNA特异性SNP分子标记来判定。鉴别结果见表4, 结果以是/否分别表示台湾亚种/其他亚种。结果表示，在105个梅花鹿样品中，T1-T15这15个样品的S-1、S-2位点分别为A和C，T16-T105这90个样品的 S-1、S-2位点分别为G和T，经与实验者A核对，T1-T15这15个样品确为台湾亚种，准确率为100％，T16-T105这90个样品为非台湾亚种，准确率为100％。

综上所述，说明用本发明提出的2个SNP位点用于鉴别梅花鹿台湾亚种和其他亚种时准确率高且稳定性好。

表4梅花鹿样品检测结果

序列表

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 用于鉴别梅花鹿台湾亚种的分子标记、鉴别方法及应用

<141> 2022-05-31

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tgctacattt tcatgatcat acattaataa ttgt 34

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

aatattgata taattattat aagtcatgtg gacgtg 36

<210> 3

<211> 612

<212> DNA

<213> 梅花鹿(Cervus nippon)

<400> 3

caaaattaac acacactagc acaatagacg ctcaagaggt agagacaatc tgaacaatcc 60

taccggctgt catcctaatt ttaattgctc tcccatcttt acgaatttta tatatgatgg 120

atgaaattaa caatccatct ctcacagtaa aaactatagg acatcaatga tattgaagct 180

acgaatatac agattatgag gacttaagct tcgactccta tataattcca acatcagaat 240

taaaaccagg agaattacga ctactagagg tagataaccg ggttgtccta ccaatagaaa 300

taacaatccg aatgttagtc tcctctgaag acgtactgca ctcttgagcc gtaccctctc 360

taggactaaa aacggacgca atcccaggcc gcctaaacca aacaactctt atatcaactc 420

gaccaggtct atattacgga caatgctctg aaatctgcgg atcaaatcac agcttcatac 480

ctatcgttct tgaactagtc ccattaaatt atttcgaaaa atgatctgca tcaatactat 540

aaatgccgca actagacacg tccacatgac ttataataat tatatcaata tttttagctc 600

tcttcattat tt 612

<210> 4

<211> 612

<212> DNA

<213> 梅花鹿(Cervus nippon)

<400> 4

caaaattaac acacactagc acaatagacg ctcaagaggt agagacaatc tgaacaatcc 60

taccggctgt tatcctaatt ttaattgctc ttccatcttt gcgaatttta tatatgatag 120

atgaaattaa caatccatct ctcacagtaa aagctatagg acatcaatga tattgaagct 180

acgagtatac agattatgag gacctaagct tcgactccta tataattcca acatcagaat 240

taaaaccagg agaattacga ctactagagg tagataaccg ggttgttcta ccaatagaaa 300

taacaatccg aatattagtc tcctctgaag acgtactgca ctcttgagcc gtaccctctc 360

taggactaaa aacggacgca atcccaggcc gcctaaacca aacaactctt atatcaactc 420

gaccaggtct atattacgga caatgctctg aaatctgcgg atcaaatcac agcttcatac 480

ctatcgttct tgaactagtt ccattaaatt acttcgaaaa atgatctgca tcaatactat 540

aaatgccgca actagacacg tccacatgac ttataataat tatatcaatg tttttaactc 600

tcttcatcat tt 612