CRISPR/Cas9系统

摘要： CRISPR/Cas9系统在植物遗传改良及功能基因研究中有着非常重要的作用.本研究中,根据拟南芥糖基转移酶家族中同工酶UGT79B2/79B3的前体序列,设计针对靶基因UGT79B2/79B3的特异的sgRNA引导序列,构建ugt79b2/79b3-Cas9双突变植物表达载体,并转化到根癌农杆菌GV3101中.将含有目标载体的GV3101活化后,花浸染法浸染拟南芥.以后代阳性株系DNA作为模板,送公司测序.99株阳性转基因株系中分子鉴定发现有24株发生突变,其中只有1株发生ugt79b2/79b3双突变.该研究结果为拟南芥糖基转移酶ugt79b2/79b3突变体的功能开发提供了基础研究与方法支持.

摘要： 猪是重要的农业经济动物,也是生物医学研究的理想动物模型之一。自2013年首次将成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)系统应用于哺乳动物以来,基因编辑猪在农业育种、医学研究、人源化器官生产和临床疾病治疗等多个领域取得突破性进展。文章围绕基因编辑猪的研究现状,对CRISPR/Cas9系统在猪遗传育种、人类疾病模型建立和异种器官移植等方面的应用进行综述,以期为我国养猪业健康发展和生物医药研究提供参考。

摘要： CRISPR-Cas9系统是细菌和古细菌中进化出的适应性免疫防御系统,称为簇状规则间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR),该系统被开发为一种基因组编辑技术并已广泛应用于病毒与宿主互作基因的筛选,2015年通过CRISPR-Cas9全基因组敲除细胞文库筛选鉴定了HRD1,EMC2等基因为西尼罗河病毒(WNV)的宿主互作基因[1]。由于病毒具有一定的传播特性,加上一些病毒的特异性受体未知,入侵机制不明,未来可能会威胁牲畜、公共卫生甚至威胁人类安全。因此,人类必须重视病毒与宿主细胞的相互作用研究,本文通过对CRISPR-Cas9系统筛选法与其他筛选方法在病毒宿主作用因子中的应用进行总结与比较,为后续科研人员在方法学上的选择提供一定参考。

摘要： 乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。

摘要： CRISPR/Cas系统是一种源自细菌和古细菌的适应性免疫系统,经人工改造后发展成为一种强大的基因编辑工具,使基础科学研究发生了革命性的变化。其中,CRISPR/Cas9系统是研究最为深入、发展最快的一种。随着CRISPR/Cas9系统的不断发展,越来越多关于CRISPR/Cas9系统的疗法进入临床试验。本文简要介绍CRISPR/Cas9系统的结构和作用机制,并对其在传染病诊疗中的应用进行综述。

摘要： LAZY1基因隶属于IGT基因家族,与植物分枝角度调控相关。为敲除84K杨中的LAZY1基因,获得转基因株系开展功能研究,以银腺杨84K为材料,克隆84K杨LAZY1基因的3个同源基因,设计基因编辑靶点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,运用农杆菌介导法转化84K杨并成功获得13个基因编辑株系,经测序分析发现,有3个转基因株系的靶标位点发生碱基缺失或插入,表明这3个株系基因编辑成功,编辑效率为23.07%。本研究结果丰富了IGT基因家族的功能研究,为IGT基因家族的分子育种应用和研究奠定了基础,为CRISPR/Cas9系统在银腺杨84K中的应用做出了初步探索。

摘要： 随着基因编辑技术的迅速发展,研究者利用基因编辑技术在越来越多的领域中取得了许多突破性的进展。目前,众多的基因编辑工具中CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系统应用最为广泛。CRISPR/Cas9及其衍生出的碱基编辑器(base editor,BE)和先导编辑器(prime editor,PE)系统使研究者可以在目标基因组中简单、高效地完成碱基的删除、插入和替换等修饰。CRISPR/Cas9相关基因编辑技术在生产具有特定遗传特征的动物方面有巨大的潜在价值。绵羊作为具有许多重要经济性状的家畜,是理想的基因工程研究大动物模型。CRISPR/Cas9相关基因编辑技术已经用于绵羊基因组工程研究,如生产具有优良特性的品种,利用乳腺生产疾病治疗药物,构建用于人类疾病和再生医学研究的动物模型。作者从CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理出发,着重阐述了利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的具体流程,并概述了CRISPR/Cas9系统在绵羊研究和生产中的应用情况。

摘要： CRISPR-Cas系统已迅速发展成为高效、精确、简便的多功能基因组编辑及代谢调控工具,并被成功应用于多种细菌。继最具代表性的II型CRISPR-cas9系统后,更简单高效的V型CRISPR-Cpf1系统被开发出来。对这两者不起作用的宿主菌,可考虑采用CRISPR-cas9n或内源I型CRISPR-Cas系统。此外,CRISPR-dcas9、CRISPR-ddCpf1及内源I型CRISPR-Cas系统可用于基因代谢调控。该文从CRISPR-Cas系统的结构、分类、作用机理、各类CRISPR-Cas系统介导的细菌基因组编辑和基因表达调控等方面进行综述,并对CRISPR技术的发展进行了展望。

摘要： 基因编辑是一种依赖于核酸内切酶对目标基因进行定向改造的现代生物学技术,可实现特定片段的加入、删除,以及特定碱基的插入、缺失、替换等。CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9)是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御外源质粒和噬菌体入侵的获得性免疫系统,经改造后已成为一种新型的基因组编辑工具,因其具有操作简单、成本低、切割效率高等优点被广泛应用于多种动物、植物及微生物等的基因组编辑。应用CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑的基础上可分析和验证基因功能、研究遗传育种及筛选药物靶点和疫苗分子等,以达到减弱病原微生物致病性、增强动植物抗病性、治疗遗传性疾病、病毒性感染及肿瘤等目的。寄生虫因其生活史复杂,与细菌和病毒相比基因组较大、结构较复杂,缺乏有效的研究工具等原因,使得相关研究进展缓慢,而CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现为基因功能研究提供了新的技术手段。笔者对CRISPR/Cas9系统的发现及其在寄生虫基因组编辑中的应用研究进展进行综述,并对该系统的应用现状和发展进行总结和展望。

摘要： 基因编辑技术及其应用是近年研究的热点,各种基因编辑工具不断涌现,基因编辑技术的精准性和安全性不断提升,并显现了巨大的应用潜力.本文综述了以成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)为代表的基因编辑技术本身的研发现状以及在生物医学、农业、食品及环境科学等领域的应用研究进展,并展望了基因编辑技术的发展前景.

摘要： 本发明公开了一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明构建敲除质粒PHY300dsrf，该质粒包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记。本发明所设计的特异性靶向srfA‑C基因的sgRNA，可以指引cas9蛋白在srfA‑C基因的特异性位点切割双链，然后再同源修复臂的指导下对基因组进行精确地同源性重组，在断裂处引入XhoI酶切位点。在对srfA‑C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行上罐发酵培养，泡沫显著减少，证明该CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效的对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑。

摘要： 本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9技术纠正猪KIT基因结构突变的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术构建分别靶向猪KIT基因内含子16和内含子17的打靶载体，转染猪肾细胞，使猪KIT基因实现拷贝删除，其中构建所述打靶载体所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4中的任一项所示。本发明的方法简单易行，通过能够有效靶向，实现目标基因拷贝数的精确删除。

摘要： 本发明涉及病毒检测技术领域，且公开了一种PPV检测的crRNA引物对、CRISPRCas12a系统及应用方法，包括以下步骤：S1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1mL PBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以12000rpm/min离心3min；S2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒对病毒进行核酸提取；S3、引物设计：在GenBank中检索猪细小病毒全基因组(GenBank ID:NC_001718.1)，通过Meglign软件分析比对，确定猪细小病毒全基因组中高度保守片段为VP2基因，使用Primer Premier 5软件，设计VP2基因的全长引物，根据猪细小病毒全基因组中高度保守片段VP2基因，使用CRISPR‑DT网站中Cpf1引物设计软件设计猪细小病毒VP2基因的crRNA引物，并委托某生物公司合成生产。

摘要： 本发明公开了一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA‑21检测方法，包括以下步骤：合成正向切口引物、反向切口引物以及对应的向导RNA；对所述正向切口引物和反向切口引物进行等温扩增；将等温扩增后的产物以及所述向导RNA，采用CRISPRCas12a系统进行检测，获得miRNA‑21检测结果。本发明属于生物检测技术领域，可在短时间内实现对miRNA‑21的高灵敏、高特异性检测。

摘要： 隐性雄性不育在植物育种中具有重要利用价值，水稻中TDR基因功能缺失会引起彻底的隐性雄性不育，因而是基因工程创制隐性雄性不育的重要靶标。本发明公开了一种利用CRISPRCas9系统对水稻TDR基因进行定点突变的方法，通过本发明提供的定点突变方法可快速高效地创制TDR基因突变体从而获得隐性雄性不育材料；本发明进一步提供了一种对通过前述定点突变方法获得的特定TDR突变基因型进行检测的方法，可用于快速鉴定TDR定点突变当代转化子中靶位点是否存在突变，亦可用于后代特定突变基因型的基因分型鉴定。

摘要： 本发明公开了基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体及其应用。其包括Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白和与其结合的特定基因的向导RNA，在Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白上具有SunTag系统，SunTag系统中含有GCN4抗原表位决定簇，将高亮度绿色荧光蛋白mNeonGreen连接在GCN4抗体上，GCN4抗体与GCN4抗原表位决定簇相结合。本发明的基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其荧光强度较强，能够在活细胞条件下观察特定基因的各个时期的表达情况，可以获得特定基因在整个间期和分裂期的动态变化趋势，并且不会将细胞杀死。

摘要： 本发明公开了一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明构建敲除质粒PHY300dsrf，该质粒包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记。本发明所设计的特异性靶向srfA-C基因的sgRNA，可以指引cas9蛋白在srfA-C基因的特异性位点切割双链，然后再同源修复臂的指导下对基因组进行精确地同源性重组，在断裂处引入XhoI酶切位点。在对srfA-C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行上罐发酵培养，泡沫显著减少，证明该CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效的对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑。

摘要： 本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas‑SDA‑AuNPs的细菌检测方法。本发明引入CRISPR‑Cas系统，通过CRISPR/Cas12a特异性识别细菌和SDA进行检测信号放大，提出了基于CRISPR/Cas12a‑SDA和DNA‑AuNPs光热效应的细菌检测方法，可以实现对细菌的简便、快速、高灵敏检测。

摘要： 本发明公开了一种基于点击化学末端转移酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法。首先，靶标miRNA‑21作为模板，将两个核酸探针进行点击化学连接，其生成物可与磁珠(MBs)结合。然后用TdT对其连接的核酸探针和互补链miRNA‑21进行延伸。延伸出的poly‑T尾巴激活了CRISPR/Cas12a的反式切割能力，从而切割报告基因来产生荧光信号。microRNAs(miRNAs)检测的特异性和灵敏性在癌症的早期诊断和各种疾病的治疗中起着至关重要的作用。

摘要： 本发明公开了一种基于CRISPRCas9高效快速连续基因编辑方法，首先将CRISPRCas9质粒pRedCas9‑N20转入目的菌株，再将体外扩增的带有PAM以及抗性marker序列的donor片段导入大肠杆菌，配合CRISPRCas9质粒基于Red同源重组将带有PAM序列的donor整合入基因组，再通过配合CRISPRCas9对PAM序列进行切割，再进行同源重组DSB修复，将标记maker消除，以及基因组无痕编辑，如果还需继续编辑，只需重新设计线性片段，无需再设计PAM序列，同样用于编辑使用的质粒可大量准备，用于多个菌株编辑，且本发明编辑效率高，单基因编辑时间短，编辑出的PAM序列固定。