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黄连素抗氧化活性及其对癌细胞毒性的研究

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第一章 综述

1.1 黄连素的研究现状

1.1.1 黄连素的性质

1.1.2 黄连素的药理活性

1.1.3 基因芯片技术研究黄连素药理作用的基因基础

1.2 活性氧及其清除

1.2.1 活性氧的产生及生理功能

1.2.2 活性氧对生物大分子的损伤

1.2.3 活性氧与疾病

1.2.4 活性氧的清除

1.2.5 抗氧化研究方法

1.3 药物对癌细胞的毒性与细胞凋亡

1.3.1 药物对癌细胞的毒性

1.3.2 细胞凋亡

1.4 本课题研究目的和研究内容

1.4.1 研究的目的和意义

1.4.2 研究的主要内容

第二章 黄连素抗氧化活性的研究

2.1 材料、仪器与试剂

2.1.1 材料与试剂

2.1.2 仪器

2.2 实验方法

2.2.1 脂质过氧化的测定

2.2.2 DNA 氧化断裂的实验方法

2.2.3 蛋白质氧化损伤的实验方法

2.2.4 清除羟自由基能力的测定

2.2.5 清除超氧阴离子能力的测定

2.2.6 清除DMPD·+自由基能力的测定

2.2.7 还原力的测定

2.3 结果与分析

2.3.1 黄连素对脂质过氧化的保护作用

2.3.2 黄连素对DNA 氧化损伤的保护作用

2.3.3 黄连素对蛋白质氧化损伤的保护作用

2.3.4 黄连素对超氧阴离子的清除能力

2.3.5 黄连素对羟自由基的清除能力

2.3.6 黄连素对DMPD·+的清除作用

2.3.7 黄连素的还原力

2.4 讨论

第三章 黄连素对癌细胞毒性的研究

3.1 材料、仪器与试剂

3.1.1 材料与试剂

3.1.2 仪器

3.2 实验方法

3.2.1 细胞培养

3.2.2 SRB 法检测黄连素对HepG2 细胞的毒性作用

3.2.3 台盼蓝排染法检测黄连素对K562 细胞的毒性作用

3.2.4 黄连素对K562 细胞DNA 的损伤

3.2.5 黄连素诱导K562 细胞凋亡

3.3 实验结果

3.3.1 SRB 法检测黄连素对HepG2 细胞的毒性作用

3.3.2 台盼蓝排染法检测黄连素对K562 细胞的毒作用

3.3.3 黄连素对K562 细胞DNA 的损伤

3.3.4 黄连素诱导K562 细胞凋亡

3.4 讨论

参考文献

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致谢

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摘要

黄连素是从黄连、黄柏、三棵针等数十种中药中提取的一种季胺类化合物,属于异喹啉生物碱,具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗心律失常、抗心力衰竭、保护缺血心肌、抑制血管平滑肌增殖、降血压、降血脂、降血糖、抗血小板聚集等药理活性。近年来,对其抗氧化活性及抗癌活性的研究备受人们关注。
  本文以黄连素为材料,测定了它在体外的抗氧化及抗癌活性。采用MDA测定、琼脂糖凝胶电泳、彗星电泳技术和SDS-PAGE法,检测了对脂质过氧化、DNA氧化断裂和蛋白质氧化损伤的保护作用;用黄嘌呤氧化酶-NBT还原法、甲基紫法、DMPD·+法及Oyaiuz法测定清除超氧阴离子、羟自由基及DMPD·+自由基的能力和还原力的大小。还检测了黄连素对肝癌细胞株HepG2和白血病细胞株K562的毒性、对细胞增殖的抑制作用、对K562细胞DNA的损伤作用和诱导K562细胞凋亡作用。结果如下:
  (1)黄连素对生物大分子的氧化损伤有较好的保护作用。在抑制脂质过氧化时,浓度为5μmol·L-1时,抑制率为1.6%;320μmol·L-1时,抑制率达到95.5%。在保护DNA的氧化断裂时,在10mmol·L-1AAPH引发的质粒pBR322DNA氧化的体系中,低浓度下(5μmol·L-1)其对DNA氧化断裂有微弱的保护作用;80μmol·L-1时基本完全保护DNA的氧化断裂。在50μmol·L-1H2O2诱导的人外周血单个核细胞DNA氧化损伤的模型中,6.25μmol·L-1黄连素使细胞DNA损伤显著减少,损伤率从81.7%降至66.2%;当浓度达到100μmol·L-1时,损伤率降为48.4%。黄连素对蛋白质氧化损伤的保护作用与Trolox接近,320μmol·L-1时,均可完全保护蛋白质不被氧化降解。
  (2)黄连素在体外有较强的清除自由基的能力和还原力。它对超氧阴离子的清除效果优于Trolox,浓度为160μmol·L-1时,其清除率已达到99.2%。对羟自由基也具有很好的清除作用,与Trolox的清除效果基本相当,当浓度为160μmol·L-1时,清除率分别达到91.0%和96.0%。在FeCl3引发的氧化体系中,黄连素清除DMPD·+的作用较弱,浓度达到1280μmol·L-1时,清除率只达到35.0%。此外,Oyaiuz法表明黄连素还具有较好的还原力。
  (3)在对肝癌细胞株HepG2和白血病细胞株K562的抑制作用中,黄连素可明显抑制两种癌细胞的增殖,且具有浓度和时间依赖性;黄连素处理24、48h后,对HepG2细胞的IC50分别为19μmol·L-1和9μmol·L-1;对K562细胞的IC50分别为11μmol·L-1和3μmol·L-1,表明对两种细胞都具较高毒性,而且K562细胞对黄连素更敏感;在较高浓度(80、160μmol·L-1)处理48h可引起两种癌细胞死亡。
  (4)在用彗星电泳技术检测黄连素对K562细胞DNA的损伤作用中,处理细胞48h后,2.5μmol·L-1时,损伤率为23.4%(基础损伤率为10.0%);当浓度为160μmol·L-1时,损伤率已达到92.8%。说明高浓度黄连素可引起严重的K562细胞DNA的损伤。
  (5)在AO/EB双染法检测黄连素诱导K562细胞凋亡的实验中,作用呈浓度和时间依赖关系。处理细胞24h后,40μmol·L-1和160μmol·L-1黄连素处理组细胞凋亡率分别为16.9%和29%(对照细胞凋亡率为10.1%);处理48h后,160μmol·L-1时凋亡率达到75.2%(对照细胞凋亡率为5.2%)。
  综上,黄连素在体外多个体系中有较好的抗氧化活性;对肝癌细胞株HepG2和白血病细胞株K562有很强的生长抑制作用;此外,黄连素在较高浓度可诱导K562细胞凋亡,其诱导凋亡的作用可能和引起细胞DNA损伤有关。

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