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动物源性食品中各种动物源性肉及肉制品鉴别检验的研究

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近年来,动物源性食品掺假、过分添加各种添加剂、使用非食用性原料和成分等各种食品安全问题不断出现。因此,建立快速、准确的检测方法,对食品进行动物源性成分鉴定已经成为一个备受关注的问题。本试验开展了多重PCR技术鉴别检测肉食品中动物源性成分的研究,通过分子生物学手段,研究各类动物源性肉及肉制品的特异性基因,借助聚合酶链式反应的特性,来达到对相应的动物源性肉及肉制品定性和定量检测的目的。
　　 用KI法、氯仿-醋酸钠法、酚仿抽提法、试剂盒法和FTA滤膜法5种提取方法分别对新鲜动物组织进行基因组DNA提取,通过1％琼脂糖凝胶电泳检测,所获基因组DNA均呈现亮带,背景清晰,电泳条带整齐均匀,完整性好。用同等样品,KI法和氯仿-NaAe法提取效果最好,试剂盒法次之。紫外分光光度计所测OD260nm/OD280nm值在1.70～1.93,浓度为0.1～2.0μg/μL,提取的DNA无RNA和蛋白质或酚的污染。
　　 试验过程中通过对TaqDNA聚合酶、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物、循环参数、反应温度、反应时间等参数的优化,确定了PCR的反应体系和反应程序。鸭和猪(引物1)单重PCR反应体系为:预混液25μL,引物终浓度为0.2μmol/L,模板0.5μg,用ddH2O补足体系50μL。鸭成分PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃退火40s,72℃延伸60s,35个循环;最后于72℃延伸5min。猪成分PCR反应条件为:94℃预变性1min;94℃变性60s,54℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸5min。鸭肉DNA扩增后在226bp位置有明亮条带,猪肉DNA扩增后在149bp位置有明显亮带,与预期目的条带大小一致,空白对照无条带产生,无非特异条带。KI法最低检出限为0.005%,氯仿-NaAc法检出限为0.01%,试剂盒法检出限为0.1%.
　　 鸭和猪(引物1)双重PCR反应体系为:预混液25μL,鸭引物各2μL,猪1引物各0.5μL(引物浓度为20μmol/L),鸭模板1μg,猪模板0.5μg,用ddH2O补足体系50μL。反应条件为:94℃预变性5min94℃变性30s,56℃退火40s,72℃延伸60s,35个循环;72℃延伸7min。结果可同时扩增出两个清晰条带,位置与目的条带一致。
　　 用牛、山羊、绵羊、猪、鸡、马、鹿、兔8种动物相应的特异性引物进行多重PCR扩增,从不同物种扩增得到片段大小各不相同的PCR产物。PCR反应体系为:预混液25μL,混合引物6.5μL,模板0.5μg,用ddH2O补足体系至50μL。反应程序为:94℃预变性4min;94℃变性30s,58℃左右退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸4min。经过反复试验,当引物的混合比例为通用上游:牛:山羊:绵羊:猪2:鸡:马:鹿:兔=1:2:3:0.5:1:0.6:2:1.5:1.8(1代表20pmol/50μL)时,扩增效果最为理想。此方法能同时扩增出8种动物的特异性条带,检测灵敏度达到0.01%.
　　 实际样品的检测结果表明,自行混合的引物完全能够扩增出不同种类肉品相应的特异:DNA片段,可应用于熟肉制品进行真伪鉴别及掺假成分的判断。本试验建立的方法特异性强、灵敏度高、快速和操作简便,为快速检测食品中动物源性成分构建了一个技术平台,能作为一种推荐性方法被质检部门推广应用。

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