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神经肽Y对大鼠皮层神经元NMD电流和大鼠癫痫发作的影响及其作用机制

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摘要

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引言

第一部分 LPS对小胶质细胞生成IL-1β、TNF-a的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 NPY对小胶质细胞生成TNF-α、IL-1β的影响及其作用机制

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 NPY通过调节小胶质细胞的免疫活性影响神经元NMDA电流

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 NPY通过小胶质细胞介导的神经免疫途径对大鼠癫瘸发作行为学影响

前言

材料与方法

结果

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 小胶质细胞在癫痫中的作用

综述二 神经肽Y在中枢神经系统中的作用

致谢

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摘要

癫痫是一种神经系统常见疾病，主要特征是由大脑神经元反复异常放电导致的暂时性脑功能失常。近年来，研究发现癫痫发作区域会出现神经胶质细胞的增生，突触重建等大脑结构和功能的可塑性变化，而这些可塑性变化又使得癫痫呈现反复发作的特点，是癫痫频繁发作和难治的主要原因之一。以往的研究认为神经胶质细胞在神经系统中仅仅起到支持、营养、保护作用，随着对神经胶质细胞在中枢神经系统疾病中所起作用的深入研究，发现神经胶质细胞在包括癫痫在内的多种中枢神经系统疾病中起着重要作用。神经胶质细胞是神经组织中除神经元细胞以外的另一大类细胞，其数量为神经元细胞的(10～50)倍。神经胶质细胞广泛分布于周围和中枢神经系统内，在中枢神经系统，主要有星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。正常状态下，星形胶质细胞可在细胞内将具有神经毒性的谷氨酸转变成无毒性的谷氨酰胺，对大脑起到保护作用。星形胶质胞还可通过对钾的缓冲作用维持神经元周围内环境的稳定，而内环境稳定是维持神经元正常兴奋性的基础。研究表明，癫痫发生区域的星形胶质细胞对谷氨酸的摄取和灭活能力降低，谷氨酰胺合成减少，对钾的缓冲作用减弱，这可能是导致该区域神经元的兴奋性增高，诱发癫痫的反复发作的原因之一。小胶质细胞的反应性激活及随后发生的级联反应对难治性癫痫的发生有重要意义。其对神经元的影响途径可能包括:1.不断激活的小胶质细胞分泌活性物质，诱发兴奋性氨基酸的释放，增加神经元兴奋性。2.早期激活的小胶质细胞可以释放转移生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-10(IL-10)等抗炎细胞因子，其中TGF-β具有明确的神经保护和抗凋亡作用，表明在反应初期小胶质细胞可能通过分泌有修复损伤能力的生长因子起到保护神经元作用。3.小胶质细胞聚集增生可形成胶质结节，参与神经损伤时瘢痕组织的形成。4.小胶质细胞持续活化可以诱发强烈炎症反应，产生和释放IL-1β和TNF-α等大量炎症因子，提高神经元NMDA受体表达，增加其活性，诱发癫痫的发生。小胶质细胞的激活后产生的NO等生物活性物质也可以加重NMDA引起的神经毒性。发生炎症反应时，小胶质细胞分泌的细胞因子和氧自由基等炎症介质可以损伤血脑屏障，使血脑屏障通透性增加，对脑组织的保护作用减弱，脑组织易受损伤。
　　炎症是机体对损伤的一种防御反应，但过度的炎症反应会引起机体组织损伤。癫痫的发生与中枢神经系统的炎症反应密切相关，强烈的炎症反应会导致神经元损伤，加重癫痫。小胶质细胞是中枢神经系统内的巨噬细胞，是产生炎症因子的主要细胞之一。小胶质细胞的过度激活及随后产生的大量炎症因子可能是导致癫痫反复发作的因素之一，通过抑制小胶质细胞的生物活性，减少某些炎症因子的产生可能是治疗癫痫的一种新的途径。
　　神经肽Y(NPY)广泛分布于中枢神经系统及周围神经系统，在神经元受到损伤时发挥着保护作用。过去对其作用机制的研究大部分局限于NPY对神经元的保护作用，认为NPY主要通过Y2和Y5受体起到保护神经元的作用。最近有研究显示，NPY可以抑制LPS所致的小鼠小胶质细胞N9细胞株的激活，降低N9细胞株的免疫活性，抑制其迁移和吞噬能力以及IL-1β及NO的生成。我们推测NPY有可能通过抑制小胶质细胞的激活，减少胶质细胞来源的细胞因子的释放来达到保护神经元、抑制癫痫发作的作用。本实验采用Elisa法、实时荧光定量PCR法检测NPY对小胶质细胞生成IL-1β和TNF-α的影响，用膜片钳技术检测NPY以小胶质细胞为靶点对大鼠皮质神经元NMDA电流的影响，以及NPY通过作用于小胶质细胞进而对动物癫痫发作的行为学影响，探讨NPY通过调节小胶质细胞生物活性、减弱炎症反应起到保护神经元和抗癫痫发作的作用及其机制，寻找以小胶质细胞为靶点的治疗癫痫的新途径。本实验共分四部分。
　　第一部分、LPS对小胶质细胞生成IL-1β、TNF-a的影响
　　目的:以原代培养的大鼠皮质小胶质细胞为研究对象，比较LPS处理小胶质细胞时间与小胶质细胞生成IL-1β和TNF-α的时效关系，寻找能够使小胶质细胞产生大量IL-1β、TNF-a的LPS最佳干预时间，为下一步的实验提供依据。
　　方法:培养原代大鼠皮质小胶质细胞，随机分为10组，5组为LPS处理组，以含LPS（终浓度为100ng/ml）的无血清胶质细胞培养液分别孵育1h、3h、6h、12h、24h。每个LPS处理组均设平行对照，对照组共5组，用无血清胶质细胞培养液孵育，孵育时间同LPS处理组。孵育结束后，Elisa方法检测培养液中IL-1β和TNF-α蛋白含量，RT-PCR方法检测小胶质细胞中IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达水平。
　　结果:以含LPS的无血清胶质细胞培养液孵育原代小胶质细胞1h、3h、6h、12h，24h后，各组培养液中IL-1β和TNF-α蛋白含量及小胶质细胞中IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达水平与对照组相比均有显著性增高(P＜0.05); LPS处理组培养液中IL-1β和TNF-α蛋白含量及小胶质细胞中IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达水平随着处理时间延长逐渐上升，IL-1β在3小时达到高峰，TNF-α在6小时达到高峰，二者在6小时均处于较高水平，以后随时间延长逐渐所下降，相邻LPS处理组间均有显著性差异。
　　结论:LPS能够刺激小胶质细胞大量产生IL-1β和TNF-α，这种效应与LPS刺激时间相关，在刺激6小时时IL-1β和TNF-α均处于较高水平。
　　第二部分、NPY对小胶质细胞生成TNF-α、IL-1β的影响及其作用机制
　　目的:以原代培养的大鼠皮质小胶质细胞为研究对象，比较NPY处理后小胶质细胞生成TNF-α、IL-1β的变化，探讨NPY对小胶质细胞生成TNF-α、IL-1β的抑制作用及其作用机理。
　　方法:将培养的原代小胶质细胞分为Control组、LPS组、NPY+LPS组、NPY组和BIBP3226+NPY+LPS组。Control组细胞以无血清胶质细胞培养液孵育6h，LPS组细胞以含终浓度为100ng/mL LPS的无血清胶质细胞培养液孵育6h，NPY+LPS组细胞是先以含NPY(终浓度为1μmol/L)的无血清胶质细胞培养液孵育0.5h，然后加入LPS（终浓度为100ng/mL）继续孵育6h。NPY组细胞是以含NPY(终浓度为1μmol/L)无血清胶质细胞培养液孵育细胞6h。BIBP3226+NPY+LPS组细胞先用含NPY Y1受体阻断剂BIBP3226(终浓度为1μmol/L)的无血清胶质细胞培养液孵育0.5h，再加入终浓度为1μmol/L的NPY孵育0.5h，最后加入终浓度为100ng/mL的LPS继续孵育6h。Elisa方法检测培养液中IL-1β和TNF-α蛋白含量，RT-PCR方法检测小胶质细胞中IL-1βmRNA和 TNF-αmRNA表达水平。
　　结果:孵育各组小胶质细胞6小时后，LPS组培养液中IL-1β、TNF-a的含量及细胞中IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达水平显著高于Control组(P＜0.05); LPS+NPY组与LPS组相比，IL-1β、TNF-a蛋白和mRNA表达水平明显降低(P＜0.05)，IBP3226+NPY+LPS组与LPS+NPY组相比，IL-1β、TNF-a蛋白和mRNA表达水平显著增高(P＜0.05)，LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间无显著性差异。NPY组与对照组无显著性差异。说明NPY明显降低了小胶质细胞来源地TNF-a和IL-1β的产生，这种效应可以被BIBP3226阻断，NPY对未活化的小胶质细胞生没有明显影响。
　　结论:NPY通过作用于NPYY1受体降低小胶质细胞的生物活性，抑制其生成TNF-a和IL-1β。
　　第三部分、NPY通过调节小胶质细胞的免疫活性影响神经元NMDA电流
　　目的:以原代培养的大鼠皮质小胶质细胞和神经元细胞为研究对象，用LPS和NPY处理后的小胶质细胞培养液孵育神经元细胞，应用膜片钳技术检测神经元NMDA电流的变化，探讨NPY通过对小胶质细胞免疫活性的调节影响神经元NMDA电流及其可能的作用机制。
　　方法:将培养好的原代小胶质细胞分为Control组、LPS组、NPY+LPS组和BIBP3226+NPY+LPS组。Control组细胞以无血清胶质细胞培养液孵育6h，LPS组细胞以含终浓度为100ng/mL LPS的无血清胶质细胞培养液孵育6h，NPY+LPS组细胞是先以含NPY(终浓度为1μmol/L)的无血清胶质细胞培养液孵育0.5h，然后加入LPS（终浓度为100ng/mL）继续孵育6h。BIBP3226+NPY+LPS组细胞先用含NPY Y1受体阻断剂BIBP3226（终浓度为1μmol/L）的无血清胶质细胞培养液孵育0.5h，再加入终浓度为1μmol/L的NPY孵育0.5h，最后加入终浓度100ng/mL的LPS继续孵育6h。6小时后，将Control组、LPS组、NPY+LPS组和BIBP3226+NPY+LPS组的小胶质细胞条件培养液与神经元培养液1∶1混合。培养好的大鼠皮质神经元分为Control组、LPS组、NPY+LPS组和BIBP3226+NPY+LPS组，每组3个样本。用上述混合培养液孵育相应组别的神经元6小时。用全细胞膜片钳技术检测孵育好的各组神经元细胞的NMDA电流(INMDA)，计算电流密度。
　　结果:膜片钳检测显示，与对照组相比，LPS组神经元NMDA电流密度显著增加(P＜0.05)，而加入NPY后(NPY+LPS组)丰申经元的NMDA电流密度显著降低(P＜0.05)，再加入BIBP3226后（BIBP3226+NPY+LPS组）神经元的NMDA电流密度显著上升(P＜0.05)，LPS组与BIBP3226+NPY+LPS组无显著差异。
　　结论:激活后的小胶质细胞可以使神经元的INMDA增高。NPY通过作用于小胶质细胞NPY Y1受体，减轻小胶质细胞对神经元INMDA的影响，避免神经元INMDA的过度增高。这种作用是通过小胶质细胞与神经元之间的非直接接触途径实现的，可能与小胶质细胞分泌到细胞外的TNF-a和IL-1β等生物活性物质有关。
　　第四部分、NPY通过小胶质细胞介导的神经免疫途径对大鼠癫痫发作行为学的影响
　　目的:以SD大鼠为研究对象，通过观察经过LPS和NPY处理后不同组别的小胶质细胞条件培养液注入大鼠侧脑室后行为学的表现，探讨NPY以中枢神经系统小胶质细胞为靶点对大鼠癫痫发作的影响。
　　方法:将SD大鼠随机分为Control组、LPS组、NPY+LPS组、BIBP3226+NPY+LPS组，每组5只。采用第一部分同样方法培养和纯化原代大鼠皮层小胶质细胞。采用第三部分方法分组及处理小胶质细胞。将各组小胶质细胞条件培养液离心后注入相应各组大鼠的侧脑室。观察各组大鼠的行为学表现。根据Diehl的分级标准对大鼠癫痫发作程度进行评估，以Ⅰ-Ⅱ级为轻度发作，Ⅲ-Ⅳ级重度发作。
　　结果:20分钟内，LPS组和BIBP3226+NPY+LPS组5只大鼠均出现重度癫痫发作，NPY+LPS组有4只出现轻度癫痫发作，Control组未见癫痫发作.LPS组发作程度显著高于对照组，NPY+LPS组发作程度显著低于LPS组，BIBP3226+NPY+LPS组发作程度显著高于NPY+LPS组。LPS组和BIBP3226+NPY+LPS组发作程度无明显差异。
　　结论:激活后的小胶质细胞可以导致大鼠癫痫发作，这种作用是通过小胶质细胞与神经元之间的非直接接触途径实现的，可能与小胶质细胞分泌到细胞外的生物活性物质导致神经元INMDA增高有关。NPY可以通过作用于小胶质细胞上NPY Y1受体，抑制大鼠的癫痫发作。这可能与NPY通过降低小胶质细胞生物活性，进而影响神经元INMDA有关。

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