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【6h】

硫化氢对PTSD大鼠学习记忆及海马NMDA受体表达的影响

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综述 内源性硫化氢对中枢神经系统的作用

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摘要

目的：
　　创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)是一种有着各种精神方面症状的精神障碍，每个PTSD患者都经历了对自己生命有着威胁的事件或者遭受过很严重的伤害。到现在为止，PTSD的发病机制还未完全明确，神经元的长时程增强可能是引起忧虑，焦急和多因素性恐慌的神经基础。
　　近年来多项研究都显示H2S是继一氧化氮、一氧化碳后第三种气体信号分子，存在于中枢神经、心血管和内脏等许多组织，在多种疾病的发生发展过程中起到了关键作用。由于内源性H2S主要由胱硫醚β-合酶(cystathionineβ-synthase，CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase，CSE)等酶的催化产生的，所以，H2S的表达受这些酶的调控。而在神经系统中的小脑、海马、皮质等部位，大量分布着CBS，其中，海马中CBS的含量比较高。
　　N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAr)是离子型受体，它能调节生物体内神经元的活性、神经的结构发育和突触可塑性、对生物体的发育过程有重要作用。NMDA受体在体内活性调节的不平衡可能是老年痴呆、癫痫和帕金森等许多中枢神经系统疾病的发病基础。
　　本实验拟通过对PTSD大鼠H2S含量和相关蛋白CBS蛋白的表达变化，及应用外源性H2S，观察上述因素的变化与NMDA蛋白表达变化的相关性，探讨两个信号通路在PTSD过程中是否以及如何发挥作用，为PTSD的进一步研究提供科研依据。
　　方法：
　　一、PTSD大鼠模型制备与实验分组
　　成年SD雄性大鼠(200±12g)，在室温下禁锢2h后，马上进行强迫游泳20min（深400mm，温25℃）。然后晾干15min以后，进行乙醚麻醉。
　　将SD大鼠随机分为4组:空白对照组、SPS、SPS+NaHS、SPS+NaCl组。
　　模型制备后给予SPS+NaHS组腹腔注射NaHS（5mg/kg，溶于0.5gNaCl中），SPS+NaCl组腹腔注射NaCl(0.9％，0.5g)，7天。
　　二、行为学检测
　　各组大鼠分别进行旷场试验(open-field，OF)和高架十字迷宫(elevatedplus-maze，EPM)，用来测试大鼠的行为学变化。
　　三、取材
　　将各组大鼠麻醉，0.9％NaCl灌注，在冰上断头取脑海马组织，然后-80℃冻存备用(Western Blot);多聚甲醛灌注，在冰上断头取脑，4℃备用（免疫组化）。四、Western Blot
　　大鼠海马组织，剪碎裂解半小时，4℃离心(12000 r/min，30 min)，取上清。进行目的蛋白分子量测定后，电泳(90V，120V)、转膜、封闭，CBS和NMDAR2B一抗孵育（兔抗大鼠多克隆抗体NMDA R2B，1∶1000;兔抗大鼠多克隆抗体CBS，1∶1000），4℃过夜，二抗孵育（HRP标记羊抗兔IgG，1∶5000）37℃1h，ECL发光。内参对照选用抗GAPDH抗体。用来测定各组大鼠CBS和NMDA蛋白的表达情况。
　　五、免疫组织化学
　　大鼠脑组织进行冰冻切片，山羊血清封闭，一抗孵育(兔抗鼠多克隆抗体NMDAR2B，1∶1000)4℃过夜，滴加二抗，辣根酶标记链霉卵白素工作液溶液，DAB显色，脱水透明，中性树胶封片。
　　六、统计学处理
　　采用GraphPad Prim5.0统计软件进行统计学分析，所有实验数据均用均数±标准差（(x)±s）表示。各组CBS和NMDA NR2B的比较采用单因素的方差分析方法。当p＜0.05时表示差异之间有统计学意义。
　　结果：
　　1.旷场试验结果:与空白对照组相比，SPS组和SPS+NaCl组大鼠在中央停留的时间、在中央区域走动的距离均显著减少;与SPS组和SPS+NaCl组相比，SPS+NaHS组大鼠在中央停留的时间、在中央区域走动距离显著增多，且与空白对照组无显著差异。旷场试验1小时后，对SPS模型大鼠进行高架十字迷宫试验，结果显示:与空白对照组相比，SPS组和SPS+NaCl组在开放臂停留时间及进入开放臂次数显著减少;与SPS组和SPS+NaCl组相比，SPS+NaHS组在开放臂停留时间及进入开放臂次数显著增加，且与空白对照组无显著差异。
　　2.Western Blot结果显示:与空白对照组相比，SPS和SPS+NaCl组CBS蛋白和NMDA受体表达水平显著降低;与SPS组和SPS+NaCl组相比，SPS+NaHS组CBS蛋白和NMDA受体表达水平显著增强，且与空白对照组相比没有统计学差异。
　　3.免疫组织化学结果显示:与空白对照组相比，SPS及SPS+NaCl组大鼠海马NMDA受体表达显著降低;与SPS组和SPS+NaCl组相比，SPS+NaHS组大鼠海马NMDA受体表达水平显著增强，且与空白对照组相比没有统计学差异。
　　结论：
　　外源性硫化氢改善PTSD大鼠的学习记忆能力，可能与上调PTSD大鼠海马CBS蛋白和NMDA受体表达相关。

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